玉米苗期室內(nèi)菌土接種絲黑穗病菌侵染條件的優(yōu)化

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玉米苗期室內(nèi)菌土接種絲黑穗病菌侵染條件的優(yōu)化

王振華，孫培元，李寧寧，邸宏，王禹賀，劉顯君，張林，于滔

（東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱150030）

摘要：研究以高感絲黑穗病玉米自交系黃早四為材料，模擬大田環(huán)境在室內(nèi)研究溫度、土壤濕度、菌土濃度等因素對玉米苗期絲黑穗病菌侵染效果的影響。采用正交試驗設計，借助PCR檢測技術分析9種不同條件下病菌侵染率，通過多重比較篩選出最優(yōu)侵染條件；在優(yōu)化的侵染條件下室內(nèi)接種已知不同抗性級別的20份玉米自交系，并移栽到田間驗證侵染效果。結(jié)果表明，室內(nèi)接種絲黑穗病菌最佳侵染條件為土壤濕度20%，菌土濃度1%，20℃光照培養(yǎng)8 h和15℃暗培養(yǎng)16 h變溫培養(yǎng)；20份玉米自交系室內(nèi)接種后移入田間發(fā)病率均高于歷年田間直接接種發(fā)病率，兩者呈極顯著正相關。研究優(yōu)化并驗證玉米苗期絲黑穗病菌室內(nèi)侵染條件，可為研究該病室內(nèi)快速鑒定方法奠定基礎。

關鍵詞：玉米；絲黑穗病；室內(nèi)接種；侵染條件

網(wǎng)絡出版時間2015-1-12 9:53:17

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150112.0953.010.html

王振華,孫培元,李寧寧,等.玉米苗期室內(nèi)菌土接種絲黑穗病菌侵染條件的優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報, 2015, 46(1): 1-5.

玉米絲黑穗病菌病原菌為玉米絲軸黑粉菌（Sporisorium reilianum f. sp. zeae），擔子菌屬。該病是世界性的重要玉米病害[1]，最有效的防治方法是培育和利用抗病品種[2]，而抗絲黑穗病資源鑒定是培育抗病玉米新品種基礎。傳統(tǒng)資源評價方式為田間菌土接種法，該法存在鑒定周期長、用地量多、鑒定群體大、受環(huán)境影響較大等缺點[3]，因此建立室內(nèi)接種技術尤為重要。檀國慶研究表明，人工室內(nèi)接種效果主要受培養(yǎng)溫度、土壤濕度和菌土濃度等多因素影響[4]。Kispatic等認為病原菌最佳侵染溫度為24℃[5]，張志德則認為22℃為玉米絲黑穗病菌最佳侵染溫度[6]，而吳新蘭等研究認為最佳侵染溫度為25℃[7]；劉惕若等研究認為25%土壤含水量條件下發(fā)病率最高[8]，張志德認為15.5%時發(fā)病率最高[6]；菌土濃度對玉米絲黑穗病發(fā)病率的影響，研究者多認為，菌含量增加發(fā)病率隨之提高，到達一定濃度后，菌土濃度升高而發(fā)病率保持平衡[4,9-10]。上述報道均以單個影響因素為研究對象，而關于絲黑穗病菌侵染條件的多因素分析卻鮮見報道。

本研究以高感（HS）玉米自交系黃早四為材料，通過室內(nèi)模擬田間環(huán)境，采用PCR技術檢測侵染率與正交試驗設計相結(jié)合的方法，優(yōu)化玉米絲黑穗病菌室內(nèi)最佳侵染條件。同時以20份已知發(fā)病率不同的玉米自交系為材料，采用優(yōu)化的最佳侵染條件接種后移入大田調(diào)查發(fā)病率，驗證接種條件正確性，為探究室內(nèi)快速鑒定方法提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

本研究所用高感絲黑穗病玉米自交系黃早四和20份不同抗性級別玉米自交系由東北農(nóng)業(yè)大學玉米研究所提供，自交系田間發(fā)病率及抗病等級數(shù)據(jù)來源于東北農(nóng)業(yè)大學王振華教授、甘肅農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所郭滿庫、吉林大學高樹仁等[11-13]及東北農(nóng)業(yè)大學玉米研究所歷年田間鑒定數(shù)據(jù)。試驗用菌為2012年秋季在東北農(nóng)業(yè)大學香坊實驗實習基地（哈爾濱）從典型病株上采集病癭，風干后裝布袋內(nèi)通風處越冬，使用前將病癭上的菌粉抖落，用40目銅篩篩出冬孢子。試驗用黑鈣土來自于東北農(nóng)業(yè)大學香坊實驗實習基地（哈爾濱）10年內(nèi)未種植玉米的地塊，土壤經(jīng)2 mm×2 mm篩子篩出后，105℃烘箱內(nèi)滅菌4~6 h備用。

1.2試驗設計

試驗以玉米自交系黃早四為材料，采用正交試驗設計（見表1），對影響玉米絲黑穗病發(fā)病的主要條件土壤濕度、菌土濃度和培養(yǎng)溫度3個條件的3個不同水平進行研究，其中高溫時光照8 h，低溫時暗培養(yǎng)16 h，試驗共9個處理，每個處理設置4次重復，每次重復100粒種子。

表1　L9(34)正交試驗設計Table 1　L9(34) orthogonal design

1.3室內(nèi)接種

選取籽粒飽滿、大小一致玉米自交系種子，蒸餾水清洗3次后，用濃度為1%次氯酸鈉消毒20 min，蒸餾水清洗5次。在發(fā)芽盒（長?寬?高=18 cm? 14 cm?12 cm）內(nèi)放入600 g高溫滅菌土，加水配置成絕對含水量為15%、17%和20%的濕土，種胚朝下將消毒后種子擺在土壤上，每盒播種50粒；用0.5%、1%和3%菌土覆蓋在種子上，每粒種子覆蓋2 g，厚度約1 cm；再用200 g上述絕對含水量的濕菌土覆蓋，攤平不要壓實，蓋上蓋子保濕。發(fā)芽盒在人工氣候箱中培養(yǎng)，三種不同培養(yǎng)條件見表1。待幼苗長至3葉期時開蓋，每盒加入50 mL水，20℃持續(xù)光照恒溫培養(yǎng)，防止開蓋后水分大量蒸發(fā)導致苗干旱死亡。

1.4 PCR檢測

根據(jù)實驗室前期研究結(jié)果，待每株玉米幼苗長到三葉期時取第3葉葉鞘，用含70%酒精棉擦拭表面，并用含滅菌水的棉花擦拭清除殘留酒精，用CTAB小量法提取全部幼苗第3葉葉鞘總DNA。由上海生工合成Xu等所設計的SSR引物SR3[7]，序列為5' GCAGCCTCAGCATTACTC 3'，5' ATACAC CTGTGACGGCTG 3'，PCR反應總體積為30 μL，PCR反應程序為94℃3 min；94℃30 s，56℃40 s，72℃1 min，循環(huán)37次；最后72℃延伸5 min。反應產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

侵染率（%）＝PCR檢測陽性株數(shù)/檢測總株數(shù)× 100%。

1.5最優(yōu)室內(nèi)侵染條件驗證

將20份玉米自交系在優(yōu)化后的玉米絲黑穗病室內(nèi)最佳侵染及培養(yǎng)條件下接菌種植，當幼苗至3葉期時，將其移栽到哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學香坊實驗實習基地。設置接菌處理與不接菌對照兩組處理，采用隨機區(qū)組設計，每個自交系種植3次重復，處理與對照組同為雙行區(qū)，每行21株，株距25 cm，行距70 cm，行長5 m。正常田間管理，至乳熟末期，調(diào)查其絲黑穗病發(fā)病率。

發(fā)病率（%）＝（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%

與其歷年平均發(fā)病率進行回歸分析，采用鄧肯氏新復極差法進行數(shù)據(jù)差異顯著性檢測。數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析采用SAS 9.1.3軟件和Excel 2010。

2　結(jié)果與分析

2.1 PCR技術檢測玉米自交系黃早四苗期絲黑穗病菌侵染率

以SSR引物SR3對玉米自交系黃早四人工接種后三葉期時第3葉葉鞘DNA進行PCR檢測，部分樣品檢測結(jié)果見圖1。

其中，陽性對照和病原菌侵染的樣品能夠擴增出680 bp特異條帶，陰性對照和水對照未擴增出特異條帶，說明可以用PCR檢測的陽性率作為病原菌侵染率。

圖1　玉米絲黑穗病菌侵染率的PCR檢測Fig. 1　PCR result of infection rate of maize head smut

2.2在不同接種培養(yǎng)條件下的病原菌侵染率差異分析

對正交試驗9個處理4次重復病原菌對玉米自交系黃早四侵染率的結(jié)果進行鄧肯氏多重比較，結(jié)果見表2。9個處理中處理8和處理1與其他處理差異極顯著，其中病原菌侵染率最高的為處理8，即土壤濕度20%、菌土濃度1%、培養(yǎng)溫度20℃/15℃變溫，其次為處理1；病原菌侵染率最低的為處理4，即土壤濕度17%、菌土濃度0.5%、培養(yǎng)溫度25℃/15℃變溫條件，侵染率為42.00%。

試驗中還發(fā)現(xiàn)土壤濕度影響幼苗死亡率，土壤濕度為15%時幼苗死亡率達到14.42%，遠高于土壤濕度為17%（死亡率6.92%）和20%（死亡率3.33%）。處理8土壤濕度為20%，在9個處理中平均侵染率最高，同時苗穩(wěn)定性最優(yōu)，死亡率也最低。因此本研究確定室內(nèi)最優(yōu)的玉米絲黑穗病菌侵染條件為處理8。

表2　不同侵染條件下病原菌侵染率的多重比較Table 2　Multiple comparison results of infection rateunder different treatments

2.3玉米絲黑穗病菌室內(nèi)接種最優(yōu)侵染條件的田間驗證

本研究對20份不同抗性玉米自交系在上述篩選出的室內(nèi)最優(yōu)病原菌侵染條件下接種，3葉期移栽至田間，乳熟期調(diào)查發(fā)病率，結(jié)果見表3。20份自交系人工室內(nèi)接種后田間平均發(fā)病率為38.09%，其中發(fā)病率最高的玉米自交系為京七，發(fā)病率為94.83%，發(fā)病率最低的為齊319，發(fā)病率為2.46%。4份高抗玉米自交系人工接種后田間平均發(fā)病率為3.87%?發(fā)病率最高的為丹9046 （6.12%）?發(fā)病率最低的為齊319（2.46%）；4份抗病玉米自交系平均發(fā)病率為9.93%，發(fā)病率最高的為龍抗11（17.03%），發(fā)病率最低的為Mo17（3.76%）；4份中抗玉米自交系平均發(fā)病率為14.56%，發(fā)病率最高的為鐵7922（23.55%），發(fā)病率最低的為鄭58 （8.19%）；4份感病玉米自交系平均發(fā)病率為32.88%，發(fā)病率最高的為東237（51.26%），發(fā)病率最低的為81162（20.18%）；4份高感玉米自交系平均發(fā)病率為91.11%，發(fā)病率最高的為京七（94.83%），發(fā)病率最低的為U8112（83.60%）。

通過差值比較發(fā)現(xiàn)，在室內(nèi)人工接種條件下不同抗性級別自交系室內(nèi)接種后田間發(fā)病率均高于歷年田間接種發(fā)病率，其中高抗、抗病、中抗、感病和高感玉米自交系兩種接種方法發(fā)病率平均差值分別為3.71%、7.30%、6.11%、13.41%和12.46%。說明優(yōu)化后的玉米絲黑穗病室內(nèi)人工接種侵染方法優(yōu)于傳統(tǒng)田間接種方法。

20份玉米自交系室內(nèi)接種田間鑒定發(fā)病率與20份自交系田間接種鑒定發(fā)病率作回歸分析（見圖2）。

圖2結(jié)果表明，二者呈極顯著正相關，方程為y=1.0894x+6.8184，相關系數(shù)r=0.9753（P<0.01）。且隨著田間接種鑒定發(fā)病率提高，室內(nèi)接種田間鑒定發(fā)病率也隨著升高。

表3　20份不同抗性級別自交系室內(nèi)接種田間平均發(fā)病率與歷年田間發(fā)病率的比較Table 3　Incidence rate of 20 maize inbred lines between infecting indoor and infecting in field over the years

圖2　20份自交系室內(nèi)接種田間鑒定發(fā)病率與歷年田間接種鑒定發(fā)病率的回歸分析Fig. 2　Regression analysis of incidence rate of 20 maize inbred lines between infecting indoor and infecting in field over the years

3　討論與結(jié)論

玉米絲黑穗病病菌主要在種子萌發(fā)至7葉期侵染中胚軸、胚根和胚芽等。在根系中以胚根侵染率最高，菌絲侵染幼苗后出現(xiàn)一個潛伏期，伴隨玉米生長過程，苗期一些植株葉片會出現(xiàn)褪綠斑點，進入開花期后，在雄穗或雌穗上顯癥，出現(xiàn)充滿孢子堆的病癭。由于潛伏期長且菌絲伴隨植株生長，常規(guī)田間菌土接種鑒定方法須等到植株花期顯癥后，方能進行發(fā)病率調(diào)查。研究表明，菌絲生長不局限于生殖器官，臨近發(fā)病器官的莖和葉片以及苗期葉片、葉鞘等均能檢測到菌絲存在，且有些時期和部位在抗感材料中存在顯著差異[14-15]，這為玉米苗期絲黑穗病侵染率的檢測提供可能。

目前研究者已將PCR應用到玉米絲黑穗病研究中，開發(fā)多個針對玉米絲黑穗病菌檢測SSR標記，其中標記SR3[16]主要用于病菌侵染效果的檢測，而標記oJS31[17]、AS15[18]主要用于病原菌遺傳多樣性等方面研究。病原菌侵染后檢測取樣部位主要為生長點，但取樣后玉米幼苗則失去生長能力。本研究前期對不同取樣部位進行比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論抗病和感病玉米自交系生長點的PCR檢測陽性率均較高，無法辨別材料間抗性差異，而在人工接種后取玉米三葉期第3葉葉鞘進行檢測，抗感材料間差異大，分辨效果好。因此本研究采用此取樣部位進行PCR檢測，用以明確不同侵染條件下黃早四發(fā)病率差異，篩選出室內(nèi)接種絲黑穗病菌的最佳侵染條件為土壤濕度20%、菌土濃度1%、20℃光照培養(yǎng)8 h和15℃暗培養(yǎng)16 h的變溫培養(yǎng)。通過20份抗性不同的玉米自交系室內(nèi)接種后移栽到田間的發(fā)病率與多年田間接種發(fā)病率的關系驗證侵染條件可靠性，結(jié)果表明在室內(nèi)人工接種條件下不同抗性級別玉米自交系室內(nèi)接種后的田間發(fā)病率均高于歷年田間直接接種發(fā)病率，說明玉米絲黑穗病菌室內(nèi)最優(yōu)侵染條件下接種，相對于田間接種鑒定，排除侵染時期環(huán)境因素的影響，充分證明本試驗確定的玉米絲黑穗病菌室內(nèi)接種條件可靠性，為今后苗期快速評價玉米資源對該病抗性提供可靠方法。

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Wang Zhenhua, Sun Peiyuan, Li Ningning, et al. Indoors infecting factors optimization of maize head smut under seedling stage[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(1): 1-5. (in Chinese with English abstract)

Indoors infecting factors optimization of maize head smut under seed?

ling stage

/WANG Zhenhua, SUN Peiyuan, LI Ningning, DI Hong, WANG Yuhe, LIU Xianjun,ZHANG Lin, YU Tao

(School of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:In this study, a high sensitive maize inbred line Huangzao4 was used to check indoors inoculation factors of maize head smut under seedling stage. Using the orthogonal design and PCR technology, we analyzed nine infection treatments and selected the best one based on multiple comparison results. Then the optimized method was identified in 20 maize inbred lines under indoor and field condition. The results showed that the optimized infection conditions of maize head smut fungus were that 20% soil moisture, 1% soil bacteria concentration, and culture condition was 8 h light at 20℃and 16 h dark at 15℃. The incidence of 20 inbred lines showed a significant positive correlation between infecting indoors and in field in several years using regression analysis. The results provided a powerful support to develop the rapid identification method indoor under seedling stage in maize.

Key words:maize; head smut; infecting indoors; inoculation factors

*通訊作者：王振華（1965-），男，教授，博士，博士生導師，研究方向為玉米遺傳育種。E-mail：zhenhuawang_2006@163.com

基金項目：國家自然科學基金項目（31371634）

收稿日期：2014-10-30

文章編號：1005-9369（2015）01-0001-05

文獻標志碼：A

中圖分類號：S435.131