TYLCV山東分離物株系分化及侵染性克隆的構(gòu)建

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TYLCV山東分離物株系分化及侵染性克隆的構(gòu)建

薛東齊，劉冠，姜景彬，許向陽，李景富

（東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，哈爾濱150030）

摘要：對2012~2014年山東省96份感番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）樣品進行特異性檢測，發(fā)現(xiàn)有94份樣品感染TYLCV，有2份樣品感染番茄卷葉病毒（ToLCV）。對該94份樣品進行全序列克隆和序列測定，共分離出13份TYLCV株系，經(jīng)核苷酸序列相似性分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，明確侵染我國山東地區(qū)的TYLCV為TYLCV-IL株系，且3年間爆發(fā)于山東省內(nèi)的TYLCV株系的DNA組分并未發(fā)生大變異。遂構(gòu)建山東壽光TYLCV株系侵染性克隆，經(jīng)致病性驗證，具有較好的侵染率，為番茄抗Ty育種提供穩(wěn)定的毒源篩選壓力。

關(guān)鍵詞：番茄黃化曲葉病毒；特異性檢測；系統(tǒng)進化樹；侵染性克隆

網(wǎng)絡(luò)出版時間2015-1-12 9:53:46

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150112.0953.011.html

薛東齊,劉冠,姜景彬,等. TYLCV山東分離物株系分化及侵染性克隆的構(gòu)建[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報, 2015, 46(1): 26-33.

近幾年，番茄病毒病在山東、浙江、江蘇、新疆等全國各主要番茄主產(chǎn)區(qū)大面積爆發(fā)，嚴重威脅番茄安全生產(chǎn)和國家蔬菜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。其中尤以雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）對番茄危害最為嚴重，其以B型和Q型煙粉虱（Bemisia tabaci）作為傳毒介體[1-3]，伴隨著煙粉虱遷徙，而季節(jié)性危害露地番茄，并可全年危害保護地番茄生產(chǎn)。

TYLCV于20世紀40年代末首先在以色列被發(fā)現(xiàn)，隨即在以色列以及約旦河流域的中東地區(qū)暴發(fā)[4]，并隨著煙粉虱遷徙和番茄帶毒種苗運輸而逐漸蔓延到北非及地中海沿岸國家，成為TYLCV新溫床[5-6]。半個世紀以來，TYLCV已成為世界熱帶和亞熱帶國家和地區(qū)番茄生產(chǎn)頭號病害[7-8]。20世紀90年代初，TYLCV傳入我國臺灣和廣西地區(qū)，僅有零星發(fā)生[9]。直到2005年，我國廣西南寧和百色番茄產(chǎn)區(qū)大面積感染TYLCV，造成番茄減產(chǎn)65%以上，有些地區(qū)甚至絕產(chǎn)。2006年，TYLCV迅速蔓延到上海、浙江等地[10-12]。2007年至今，我國山東[13]、安徽[13]、江蘇[14]、河北[15]、河南[16]、陜西[17]等東南部沿海省份及中部內(nèi)陸地區(qū)的番茄產(chǎn)區(qū)均大面積發(fā)病，造成番茄嚴重減產(chǎn)甚至絕收。TYLCV在我國的流行呈現(xiàn)明顯的由南向北、由東南部沿海向中西部內(nèi)陸蔓延的趨勢。

由于TYLCV為ssDNA，具有較高突變頻率，因此在不同地理區(qū)域形成致病力各異的株系，主要有TYLCV-IL、TYLCV-IR、TYLCV- Mld、TYL? CV-Gez等株系[18-19]。因此，為明確我國蔬菜主產(chǎn)區(qū)山東省的TYLCV株系分化情況，并為番茄抗TYLCV育種奠定基礎(chǔ)，遂對山東多地番茄主產(chǎn)區(qū)感染TYLCV病株進行檢測和病毒分離物克隆，以期明確山東地區(qū)TYLCV的株系分化情況，構(gòu)建TYLCV山東分離物侵染性克隆，克服煙粉虱自然接種的弊端，為番茄抗Ty育種、研究TYLCV侵染循環(huán)及TYLCV病害防控技術(shù)等奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒樣品

2012~2014年分別采集覆蓋整個山東省16個地市的96份具黃化、卷葉癥狀的番茄感病葉片，并于-80℃保存，42份用于進化分析的GenBank數(shù)據(jù)見表1，包含國內(nèi)不同地區(qū)具有代表性的TYLCV分離物29份，以及國外其他地區(qū)代表性的分離物12份和1份外群。

表1　番茄黃化曲葉病毒GenBank登入號Table 1　GenBank accession numbers of TYLCV in this study

1.1.2主要試劑

2×Taq MasterMix、RNase-Free Water（購自康維世紀）；pMD19-T Vector（購自TaKaRa公司）；DNA快速純化回收試劑盒（購自TaKaRa公司）；Amp、Rif、Kan、YEP、LB、大腸桿菌DH5a、根癌土壤農(nóng)桿菌EHA105、植物表達載體pBI121等均由課題組自備。

1.2方法

1.2.1 DNA提取

按王偉偉等[20]報道的方法快速提取番茄葉片總

DNA。

1.2.2 TYLCV PCR特異性檢測及全序列克隆和序列測定

1.2.2.1 TYLCV PCR特異性檢測

利用設(shè)計的TYLCV特異引物TY-F/TY-R（見表2）檢測鑒定所采集的樣品，檢測體系為：11 μL 2×Taq MasterMix，11 μL RNase-Free Water，1 μL上游引物TY-F（20 μmol·L-1），1 μL下游引物（20 μmol·L-1），1 μL感病番茄葉片總DNA；PCR檢測參數(shù)為：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性40 s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，38次循環(huán)后72℃充分延伸10 min。

表2　用于TYLCV DNA序列克隆的引物Table 2　Primers used for cloning DNA of TYLCV

1.2.2.2 TYLCV全序列克隆和序列測定

對特異性檢測陽性樣品利用TYLCV背靠背引物Full-F/Full-R（見表2）擴增DNA全長序列，檢測體系為：10×反應(yīng)緩沖液2.5 μL，MgCl（225 mmol·L-1）1.5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）2 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，LATaq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.25 μL，加ddH2O至25 μL；PCR檢測參數(shù)為：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸3 min，38次循環(huán)后72℃充分延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，回收約2 800 bp目的條帶，分別經(jīng)pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對鑒定有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株分別測序。

1.2.3 TYLCV山東分離物株系分化分析

序列相似性利用DNAMAN6.0（Lynnon biosoft，quebec，Canada）進行分析；多序列比對采用Clust?alX2軟件，系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建使用MEGA5中基于Kimura 2-parameter model的鄰接法（Neighbor-join?ing），并進行1 000次bootstrap檢驗；同時TYLCV山東省內(nèi)分離物的遺傳距離分析也采用MEGA5軟件和DnaSP Version 5軟件，以期明確不同地區(qū)TY?LCV種群遺傳多樣性及群體變異水平。

1.2.4 TYLCV山東壽光分離物侵染性克隆的構(gòu)建

對連接到pMD19-T載體上的山東壽光（SD-SG13）分離物進行全序列檢測，證實并未發(fā)生擴增突變，將該重組載體命名為pMD19T-SG13-1.0A；用SacⅠ和Bam HⅠ對pMD19T-SG13-1.0A重組載體酶切，回收2.2 kb（0.78A）大小的目的片段，將該目的片段插入同樣經(jīng)SacⅠ和Bam HⅠ酶切的植物表達載體pBI121中，命名為pBI121-SG13-0.78A；用Bam HⅠ對pMD19T-SG13-1.0A單酶切，獲得約2.8 kb（1.0A）的目的片段，并將其插入同樣經(jīng)Bam HⅠ單酶切的pBI121-SG13-0.78A，從而構(gòu)建成含有1.78個重復(fù)的山東壽光（SD-SG13）分離物侵染性克隆pBI121-SG13-1.78A。利用Bam HⅠ對pBI121-SG13-1.78A進行單酶切，以及利用SacⅠ和Bam HⅠ對pBI121-SG13-1.78A進行雙酶切，驗證構(gòu)建的侵染性克隆，并將構(gòu)建的侵染性克隆pBI121-SG13-1.78A通過電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中。

1.2.5侵染性克隆的致病性鑒定

為驗證侵染性克隆pBI121-SG13-1.78A的致病性，遂進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物接種鑒定。將含有pBI121-SG13-1.78A的農(nóng)桿菌接種在含Kan和Rif 的5 mL LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)24 h（28℃），取500 μL菌液加入含相同抗生素以及含10 mmol·L-1MES、20 μmol·L-1AS的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12 h（28℃），離心收集菌體，并用10 mmol·L-1MES、10 mmol·L-1MgCl2、0.1 mmol·L-1AS混合液懸浮菌體。用1 mL無菌注射器將菌液分別接種于4~6葉期的番茄、辣椒和本氏煙的葉柄處和葉脈處韌皮部，每種植物接種10株，3次重復(fù)。接種植株置于防蟲光照培養(yǎng)室，于25℃、16 h光照下培養(yǎng)，接種兩周后統(tǒng)計發(fā)病情況。

2　結(jié)果與分析

2.1 TYLCV PCR特異性檢測

根據(jù)GenBank上已知的TYLCV序列，利用Oli?go軟件設(shè)計特異性引物TY-F/TY-R，對2012~2014年間采集的覆蓋整個山東省16個地市的96份具黃化、卷葉、皺縮癥狀的番茄感病葉片進行初步檢測，其中有94份樣品檢測到400 bp左右的目的條帶，而這94份樣品覆蓋整個山東省的16個地市（見圖1），說明山東省內(nèi)絕大部分番茄生產(chǎn)區(qū)已受到TYLCV危害；其余2份未檢測出目的條帶的樣品經(jīng)初步分析，為番茄卷葉病毒（ToLCV）侵染，從而表現(xiàn)出類似于番茄黃曲葉病毒侵染所致的癥狀。

圖1　特異性引物TY-F/TY-R對部分感病番茄樣品的PCR檢測Fig. 1　PCR amplification of some susceptible tomato samples by specific primers TY-F/TY-R

2.2 TYLCV全序列克隆和序列測定

2012年所采集的32份樣品，經(jīng)背靠背引物Full-F/Full-R PCR擴增，均能擴增出2 800 bp目的條帶，擴增產(chǎn)物分別與pMD19-T載體連接后進行序列測定，對測序結(jié)果利用ClustalX2軟件分別進行雙序列和多序列比對，將該32份TYLCV分離物分為3個株系，分別為TYLCV-SD-WF12、TYL?CV-SD-SG12、TYLCV-SD-LC12。對2013年采集的32份樣品，除山東壽光和濟南各有1份樣品為ToLCV侵染，其余30份樣品經(jīng)PCR擴增，也擴增出2 800 bp目的條帶，經(jīng)序列測定和序列比對，該31份分離物鑒定為5個株系，分別為TYL?CV-SD-LC13、TYLCV-SD-LW13、TYLCV-SDSG13、TYLCV-SD-WF13、TYLCV-SD-YT13。對2014年所采集的32份樣品，經(jīng)序列測定和序列比對，也鑒定為5個株系，分別為TYLCV-SDLC14、TYLCV-SD-SG14、TYLCV-SD-WF14、TY?LCV- SD-LY14、TYLCV-SD-ZZ14。該13份株系的全序列PCR擴增結(jié)果如圖2所示。與此同時，將其基因組數(shù)據(jù)提交到GenBank上，登入號見表1。

圖2　TYLCV DNA全長PCR擴增Fig. 2　DNA full length amplification of TYLCV by PCR

2.3 TYLCV山東分離物株系分化分析

對山東省分離出的13份TYLCV株系全基因序列進行分析可知，該13份株系的DNA序列全長均為2 781 bp，經(jīng)過與GenBank中具代表性的TYLCV不同株系全序列核苷酸一致率比對（登入號見表1），發(fā)現(xiàn)該13份病毒株系與TYLCV-IL、TYLCVIR、TYLCV-Mild、TYLCV-Gez核苷酸一致率分別為95.7%~98.5%、90.7%~91.3%、90.6%~92.2%、87.8%~90.3%；與番茄黃化曲葉泰國病毒（TYL? CThV）的核苷酸一致率為69.2%~72.4%；與番茄黃化曲葉撒丁島病毒（TYLCSaV）核苷酸一致率為71.6%~ 73.4%；與番茄黃化曲葉中國病毒（TYLCCNV）核苷酸一致率為70.3%~73.9%，由此可知，侵染山東的TYLCV與TYLCV-IL株系的核苷酸一致率較高，說明其病毒來源可能是TYLCV-IL株系。

為明確山東TYLCV分離物的系統(tǒng)進化關(guān)系，遂對表1中各地具有代表性的Ty分離物構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（見圖3）。

圖3　基于TYLCV全序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig. 3　Phylognetic tree constructed with complete sequence of TYLCV

從系統(tǒng)進化樹可知，除外群（WDV）單獨形成一個分支外，其他Ty分離物聚為3個類群。云南、廣西、四川的Ty分離物與TYLCThV、TYLCTWV、TYLCSaV聚在ClusterⅢ內(nèi)，該群與ClusterⅠ、ClusterⅡ內(nèi)分離物的同源性在73.0%~76.6%，說明ClusterⅢ與其他兩群的親緣關(guān)系較遠；TYLCVGez、TYLCV-Ja、TYLCV-Mild聚在ClusterⅡ內(nèi)，該群與ClusterⅠ內(nèi)分離物的同源性在89.7%~93.6%，說明這兩個類群的親緣關(guān)系較近；其余32份覆蓋我國東部沿海省份、華北地區(qū)和中西部內(nèi)陸地區(qū)的Ty分離物聚在ClusterⅠ內(nèi)，并與TYL?CV-IL、TYLCV-IR株系聚在同一群。由圖3可知，ClusterⅠ類群又分為3個亞組，亞組的組內(nèi)（間）遺傳距離見表3，組內(nèi)遺傳距離小于組間遺傳距離，說明分組合理，結(jié)合核苷酸一致率分析可知，侵染我國山東地區(qū)的TYLCV為TYLCV-IL株系在山東省內(nèi)不同地區(qū)適應(yīng)當?shù)丨h(huán)境后演變出的不同株系，且3年間爆發(fā)于山東省內(nèi)的TYLCV株系的DNA組分并未發(fā)生大的變異。

本研究鑒定的13份山東TYLCV株系分別聚在GroupⅠ和GroupⅡ內(nèi)，利用DnaSP軟件計算出亞組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的｜Fst｜值分別為0.0475、0.0563和0.0788，均小于0.33，說明亞組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ間的TYLCV各株系基因交流頻繁，并處于一種波動發(fā)展的狀態(tài)。

表3　ClusterⅠ亞組內(nèi)(間)的遺傳距離分析Table 3　Genetic distance within andbetween groups of ClusterⅠ

2.4 TYLCV山東壽光分離物侵染性克隆的構(gòu)建

對2012~2014年山東省分離出的13份TYLCV株系全基因組序列與GenBank上已公布的Ty基因組序列多序列比對分析，以及TYLCV的系統(tǒng)進化樹分析可知（見圖3），該13份TYLCV株系均與TY?LCV-IL株系親緣關(guān)系較近，其基因組相似性達到95.7%~98.5%，因此隨機選擇山東壽光（SD-SG13）TYLCV株系構(gòu)建侵染性克隆。

為驗證構(gòu)建的山東壽光（SD-SG13）TYLCV株系侵染性克隆pBI121-SG13-1.78A是否正確，遂利用Bam HⅠ對pBI121-SG13-1.78A質(zhì)粒進行單酶切，獲得大小約為15和2.8 kb的2個目的條帶（見圖4）；以及利用SacⅠ和Bam HⅠ對pBI121-SG13-1.78A質(zhì)粒進行雙酶切，獲得大小約為13 kb、2.2 kb和600 bp的3個目的條帶（見圖4），因此說明構(gòu)建的侵染性克隆pBI121-SG13-1.78A是正確的。

圖4　山東壽光(SD-SG13)TYLCV株系侵染性克隆的酶切鑒定Fig. 4　Enzyme cutting identify of TYLCVShandong-Shouguang isolate

2.5侵染性克隆的致病性鑒定

利用構(gòu)建的侵染性克隆對6~8葉期的番茄、辣椒和本氏煙分別接種，3周后統(tǒng)計發(fā)病情況（見表4）。

表4　TYLCV侵染性克隆誘導(dǎo)的致病率Table 4　Infectivity efficiency of the infectious clone

由表4可知，接種的30株番茄有20株表現(xiàn)出葉片卷曲、皺縮、黃化癥狀，致病率達66.7%；接種的30株本氏煙均表現(xiàn)出明顯的葉片皺縮、葉脈增厚、黃化等癥狀，接種本氏煙的致病率達100%；接種的30株辣椒，僅有1株表現(xiàn)有葉邊緣卷曲的癥狀，侵染性克隆誘導(dǎo)的癥狀如圖5所示。對表現(xiàn)葉片黃化、皺縮卷曲癥狀的番茄、本氏煙、辣椒分別提取葉片總DNA，并利用TYLCV特異性引物TY-F/TY-R進行PCR擴增，其中番茄、本氏煙均能擴增到約400 bp的目的片段，而表現(xiàn)為葉邊緣卷曲癥狀的1株辣椒并未能擴增到400 bp的目的片段，說明該株辣椒并未被TYLCV侵染性克隆所侵染，番茄和本氏煙上表現(xiàn)出來的葉片皺縮、曲葉、黃化癥狀是由TYLCV侵染性克隆pBI121- SG13-1.78A所引起的。因此，本試驗構(gòu)建的山東壽光（SD-SG13）TYLCV侵染性克隆pBI121-SG13- 1.78A具有侵染性。

圖5　侵染性克隆誘導(dǎo)的癥狀Fig. 5　Typical symptom on the plants induced by the infectious clone

3　討論與結(jié)論

從國外番茄產(chǎn)區(qū)TYLCV的發(fā)病趨勢看，番茄黃化曲葉病毒病的嚴重發(fā)生總是煙粉虱大爆發(fā)后[21]。近年來，由于煙粉虱在我國諸多省份番茄主產(chǎn)區(qū)爆發(fā)成災(zāi)，無論是露地栽培番茄，還是保護地栽培番茄都長期受害。因此，加強煙粉虱監(jiān)測和防治、采取合理的栽培模式和田間管理措施、及選育含Ty-1[22]、Ty-2、Ty-3[23]等抗性基因的抗病品種都是防控TYLCV的重要途徑。

目前，侵染我國番茄的Ty病毒主要有三種：一種為主要侵染我國西南部省份廣西、云南、四川的TYLCCNV；一種為侵染臺灣、廣東地區(qū)的TYLCTWV；另一種為侵染我國東南沿海省份，以及中東部內(nèi)陸地區(qū)和華北地區(qū)的TYLCV。通過對山東省所采集的96份感病樣品進行特異性檢測，發(fā)現(xiàn)有94份樣品感染TYLCV，有2份樣品感染ToLCV，對94樣品進行全序列克隆和序列測定，共分離出13份株系，經(jīng)核苷酸序列相似性分析和系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建（見圖3），明確侵染我國山東地區(qū)的TYLCV為TYLCV-IL株系在山東省內(nèi)不同地區(qū)適應(yīng)當?shù)丨h(huán)境后所演變出的不同株系，且2012~ 2014年，爆發(fā)于山東省內(nèi)的TYLCV株系的DNA組分并未發(fā)生大的變異。從親緣關(guān)系看，本次分離的山東TYLCV分離物與江蘇、浙江、上海等地分離物親緣關(guān)系較近，并與韓國、美國的分離物也具有較近親緣關(guān)系，但與侵染我國番茄的其他粉虱傳雙生病毒親緣關(guān)系較遠。因此推斷，引起山東地區(qū)的TYLCV可能是由于上海、浙江等地進口帶毒番茄種苗，由煙粉虱作為傳毒介體傳播造成。

Lapidot報道表明，番茄抗Ty品種的抗病性鑒定方法主要有煙粉虱接種法、嫁接接種法、農(nóng)桿菌注射接種法。煙粉虱接種法操作繁瑣，容易使周邊作物受到危害，由于煙粉虱個體較小，試驗結(jié)束后如何處理煙粉虱也是一個問題，且該方法使番茄感病率不穩(wěn)定[24]；嫁接接種法雖能夠為待鑒定的番茄植株提供大量的Ty病毒[25]，但該方法耗時耗力，適合于少量的致病性鑒定[26]；農(nóng)桿菌接種法指將構(gòu)建的病毒侵染性克隆轉(zhuǎn)入寄主植株[27]，與其他兩種接種方法相比，農(nóng)桿菌注射法可有效控制接種病毒數(shù)量、接種時期和接種部位。本研究制備的TYLCV山東壽光分離物侵染性克隆pBI121- SG13-1.78A，經(jīng)致病性驗證，具有較好的侵染率，可在番茄抗Ty育種研究中作為毒源使用，為番茄品種抗性篩選提供新的簡便、可靠途徑。

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Strain differentiation and infectious clone construction of tomato yellow

leaf curl virus in Shandong Province

/XUE Dongqi, LIU Guan, JIANG Jingbin, XUXiangyang, LI Jingfu

(School of Horticulture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:There were 96 samples of a sense of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) that were collected in Shandong Province between 2012-2014. After specific detection, 94 samples infected TYLCV and two samples infected ToLCV. The 94 samples that infected TYLCV were cloned and sequenced the whole sequence. The results showed that 13 TYLCV strains were separated. By nucleotide sequence similarity analysis and phylogenetic tree construction, We identified that the TYLCV isolates infected Shandong area belonged TYLCV-IL strains, and TYLCV DNA component of Shandong Province didn't occur large variation between 2012-2014. Then we constructed Shandong Shouguang TYLCV strain infectious clone, By pathogenic verification, It had a better infection rate. Therefore, It provide a stable viral source of selection pressure for anti-Ty tomato breeding.

Key words:tomato yellow leaf curl virus; specific detection; phylogenetic tree; infectious clone

*通訊作者：李景富，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)。E-mail: Ljf_2005@126. com

作者簡介：薛東齊（1987-），男，博士研究生，研究方向為蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)。E-mail: xuedongqi2009@hotmail. com

基金項目：“十二五”國家科技計劃項目（2012BAD02B02-7）

收稿日期：2014-09-09

文章編號：1005-9369（2015）01-0026-08

文獻標志碼：A

中圖分類號：S436.412.1+1