野生型枯草芽孢桿菌N4的spizizen轉(zhuǎn)化法優(yōu)化

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野生型枯草芽孢桿菌N4的spizizen轉(zhuǎn)化法優(yōu)化

李春艷1，馮鳳兆1，馮露1，成毅1，成小松2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150030；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，哈爾濱150001）

摘要：采用經(jīng)典Spizizen方法將已構(gòu)建的大片段重組質(zhì)粒pHT01-nit（nit為腈水解酶基因）轉(zhuǎn)化野生型枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N4，無法獲得轉(zhuǎn)化子。研究對(duì)Spizizen方法進(jìn)行改進(jìn)，分別在感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化過程中加入有機(jī)溶劑及溶菌酶，并對(duì)有機(jī)溶劑種類、濃度，溶菌酶濃度，質(zhì)粒與感受態(tài)共培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，提高轉(zhuǎn)化效率，構(gòu)建Bacillus subtilis N4-pHT01-nit。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacryamide gel electro?phoresis, PAGE）驗(yàn)證nit在野生型枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N4中的表達(dá)。結(jié)果表明，最優(yōu)條件為在感受態(tài)制備過程中添加4%的Tween-80，轉(zhuǎn)化過程中添加5 μg·mL-1溶菌酶，感受態(tài)與質(zhì)粒共培養(yǎng)時(shí)間為1 h，條件優(yōu)化后可得到37個(gè)轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA。在SDS-PAGE上可以看到與腈水解酶分子質(zhì)量一致的蛋白條帶。說明該優(yōu)化后的方法效果明顯，適合于大片段重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化野生型枯草芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞：野生型枯草芽孢桿菌；spizizen轉(zhuǎn)化法；有機(jī)溶劑；溶菌酶；SDS-PAGE

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2015-1-27 16:01:07

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150127.1601.014.html

李春艷,馮鳳兆,馮露,等.野生型枯草芽孢桿菌N4的spizizen轉(zhuǎn)化法優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 46(2): 78-82.

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是革蘭氏陽性好氧細(xì)菌，內(nèi)生抗逆孢子，細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，無致病性，直接分泌多種蛋白到培養(yǎng)基中，有些枯草芽孢桿菌還能形成生物膜，因此常被用作一些重要工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌，亦可應(yīng)用到環(huán)境污染的治理中[1-2]。自枯草芽孢桿菌168菌株被Spizizen[3]發(fā)現(xiàn)可用作轉(zhuǎn)化菌株以來，枯草芽孢桿菌生理生化及遺傳學(xué)研究工作不斷深入，其屬于革蘭氏陽性菌，相對(duì)大腸桿菌，其轉(zhuǎn)化工作較為困難。常用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、Spizizen轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法進(jìn)行枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法盡管條件溫和，轉(zhuǎn)化設(shè)備要求低，但在原生質(zhì)體制備時(shí)，對(duì)破壁溫度、破壁時(shí)間以及溶菌酶用量等條件有嚴(yán)格要求，試驗(yàn)操作繁瑣，且轉(zhuǎn)化效率較低[4]；目前，轉(zhuǎn)化效率較高當(dāng)屬電轉(zhuǎn)化法，但該方法對(duì)轉(zhuǎn)化設(shè)備要求高，操作中影響轉(zhuǎn)化因素較多，需進(jìn)行條件摸索，不易在短期內(nèi)掌握[4]。傳統(tǒng)Spizizen轉(zhuǎn)化方法[3]基本能夠滿足WB600、WB800和168等模式菌株的轉(zhuǎn)基因要求，但由于某些野生型枯草芽孢桿菌較低的膜通透性，使得胞內(nèi)胞外物質(zhì)不能順利進(jìn)出[5]，因此利用Spizizen方法轉(zhuǎn)化某些野生型枯草芽孢桿菌達(dá)不到要求轉(zhuǎn)化效率。目前國內(nèi)外針對(duì)野生型枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化報(bào)道較少，不同枯草芽孢桿菌形成感受態(tài)條件差別很大，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒大小也會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率，一般質(zhì)粒越小越利于轉(zhuǎn)化。魏艷等報(bào)道針對(duì)1株野生型枯草芽孢桿菌有機(jī)溶劑轉(zhuǎn)化方法[5]，但其轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA片段較小，而對(duì)大片段質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化野生型枯草芽孢桿菌尚無報(bào)道，因此建立一種適合轉(zhuǎn)化大片段質(zhì)粒DNA的野生型枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化方法尤為重要。

本研究以野生型B. subtilis N4為研究對(duì)象，在Spizizen轉(zhuǎn)化法的基礎(chǔ)上，在制備感受態(tài)和轉(zhuǎn)化過程中，通過添加不同濃度的Tween-80、丙酮、煤油、甲醇等有機(jī)溶劑和溶菌酶，并探討質(zhì)粒與感受態(tài)共培養(yǎng)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)野生型B. subtilis N4的DNA轉(zhuǎn)化，獲得大片段質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化野生型枯草芽孢桿菌的方法，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)加以驗(yàn)證，以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作需要，同時(shí)也對(duì)其他野生型枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化有一定借鑒作用。

1　材料與方法

1.1供試菌株、質(zhì)粒及試劑

菌株：B. subtilis N4為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室篩選并保存。質(zhì)粒：PHT01-nit（9.1 kb）由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存于大腸桿菌DH5α中，外源片段為1.1 kb腈水解酶基因（nit），大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒PHT01約8 kb，購自MoBiTec（Goettingen, Ger?many）。所用抗生素工作濃度：N4菌株（氯霉素5 μg·mL-1）；大腸桿菌DH5α（氨芐青霉素50 μg·mL-1）。

有機(jī)溶劑Tween-80購自天津市進(jìn)化化工試劑有限公司；煤油購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；丙酮和甲醇購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；溶菌酶購自Amresco；限制性內(nèi)切酶AatⅡ和XbaⅠ購自大連寶生物工程有限公司。

1.2培養(yǎng)基及溶液

LB固體培養(yǎng)基：用于轉(zhuǎn)化子篩選，主要成分有NaCl 10 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0~7.2，并添加氯霉素至終濃度為5 μg·mL-1；LB液體培養(yǎng)基：用于轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)，主要成分有NaCl 10 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0~7.2，并添加氯霉素至終濃度為5 μg·mL-1；

10×最低鹽溶液：用于GMⅠ和GMⅡ溶液配制，MgSO4·7H2O 0.2 g，檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O）1 g，（NH4）2SO42 g，KH2PO46 g，K2HPO4·3H2O 18.34 g，在蒸餾水中依次溶解，加水至100 mL；L-trp溶液：用于GMⅠ溶液和GMⅡ溶液配制，2 mg·mL-1，貯于棕色瓶內(nèi)，113℃滅菌30 min，用黑紙包裹；GMⅠ溶液：用于枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化，1×最低鹽溶液95 mL，5%水解酪蛋白0.4 mL，10%酵母汁1 mL，50%葡萄糖1 mL，2 mg·mL-1L-trp 2.5 mL（50 μg·mL-1）；GMⅡ溶液：用于枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化，1×最低鹽溶液97.5 mL，10%酵母汁0.04 mL，5%水解酪蛋白0.08 mL，50%葡萄糖1 mL，0.1 mol·L-1CaCl20.5 mL（0.5 mmol·L-1），0.5 mol·L-1MgCl20.5 mL（2.5 mmol·L-1），2 mg·mL-1L-trp 0.5 mL（5 μg·mL-1）。

10% SDS（W/V）溶液：稱取10 g高純度SDS于100~200 mL燒杯中，加入約80 mL去離子水，68℃加熱溶解。滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 7.2，將溶液定容到100 mL后，室溫保存。

1.3質(zhì)粒提取方法

質(zhì)粒提取使用質(zhì)粒提取試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，因B. subtilis N4屬于革蘭氏陽性菌，故按試劑盒說明書提取質(zhì)粒時(shí)，加入SolutionⅠ后，需加終濃度為5 mg·mL-1的溶菌酶裂解細(xì)胞[5]，后續(xù)操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 B. subtilis N4菌株感受態(tài)細(xì)胞制備方法

接種斜面培養(yǎng)2 d的B. subtilis N4菌株于5 mL GMⅠ溶液，同時(shí)分別加入體積百分比為1%、2%、3%、4%、5%濃度的Tween-80、丙酮、煤油、甲醇，以傳統(tǒng)spizizen轉(zhuǎn)化法為對(duì)照，30℃、100 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)過夜。第2天取2 mL過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到18 mL新鮮GMⅠ中，37℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)3.5 h。再取10 mL轉(zhuǎn)接到90 mL GMⅡ中，37℃、100 r·min-1振蕩培養(yǎng)90 min。8 000 r·min-1離心收集菌體。用10 mL上清液懸浮菌體，并加30%滅菌甘油至10%，混合均勻。以每管0.5 mL量分裝到離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 B. subtilis N4菌株化學(xué)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證

取500 μL上述制備的感受態(tài)細(xì)胞于45℃水浴溶化。分別加入1、5、10 μg·mL-13個(gè)不同濃度的溶菌酶，以傳統(tǒng)spizizen轉(zhuǎn)化法為對(duì)照。加入1 μg供體PHT01-nit質(zhì)粒于500 μL感受態(tài)細(xì)胞中。37℃、80 r·min-1振蕩培養(yǎng)30 min。涂布含5 μg·mL-1氯霉素抗性平板，37℃培養(yǎng)過夜，次日記錄菌落數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次。用滅菌牙簽隨機(jī)挑取單菌落，然后接種到5 mL含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 h。提取質(zhì)粒后，用限制性內(nèi)切酶AatⅡ和XbaⅠ雙酶切驗(yàn)證。

1.6質(zhì)粒PHT01-nit與B. subtilis N4感受態(tài)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

分別選取質(zhì)粒與感受態(tài)的共培養(yǎng)時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3 h，37℃、80 r·min-1振蕩培養(yǎng)，測定質(zhì)粒與感受態(tài)共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)B. subtilis N4轉(zhuǎn)化效率的影響。

1.7腈水解酶基因(nit)的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取對(duì)照菌（野生型B. subtilis N4）和重組菌（B. subtilis N4-PHT01-nit）各1個(gè)單菌落，分別接入5.0 mL不含氯霉素和含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜，作為種子液。培養(yǎng)過夜后，按1%接種量轉(zhuǎn)種于裝有50 mL不含氯霉素和含氯霉素的LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃，200 r·min-1培養(yǎng)至OD600為0.7~0.8時(shí)開始誘導(dǎo)，此時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG（體積濃度為1mmol·L-1），誘導(dǎo)24 h后取樣。

各取B. subtilis N4和重組菌的培養(yǎng)液10 mL，離心（10 000 r·min-1、5 min）收集細(xì)胞，用約2 mL去離子水懸浮細(xì)胞，再次離心收集細(xì)胞，用去離子水懸浮細(xì)胞至原體積。取細(xì)胞液進(jìn)行超聲破碎（冰浴、超聲1 s、間歇3 s、功率700 W、全程12 min）離心（14 000 r·min-1、15 min）獲取粗酶液。各取20 μL粗酶液加入等體積2×SDS上樣緩沖液，進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳。

2　結(jié)果與分析

2.1有機(jī)溶劑對(duì)枯草芽孢桿菌B. subtilis N4轉(zhuǎn)化效率的影響

比較不同濃度有機(jī)溶劑對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，圖1a顯示，添加4% Tween-80轉(zhuǎn)化效率最高，得到17個(gè)轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA，添加3% Tween-80也能得到轉(zhuǎn)化子，但轉(zhuǎn)化效率很低，僅獲得2個(gè)轉(zhuǎn)化子。

圖1b顯示添加2%甲醇得到1個(gè)轉(zhuǎn)化子，濃度增大或降低均得不到轉(zhuǎn)化子；而添加各濃度的丙酮和煤油均未得到轉(zhuǎn)化子。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Tween-80 對(duì)B. subtilis N4轉(zhuǎn)化效率的影響最為顯著和穩(wěn)定，重復(fù)試驗(yàn)3次，均得到數(shù)目相近的轉(zhuǎn)化子。傳統(tǒng)spizizen轉(zhuǎn)化組，野生型B. subtilis N4在氯霉素抗性平板上未得到轉(zhuǎn)化子，說明野生型B. subtilis N4不能利用spizizen轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

2.2溶菌酶對(duì)枯草芽孢桿菌B. subtilis N4轉(zhuǎn)化效率的影響

在感受態(tài)制備過程中添加4% Tween-80基礎(chǔ)上，同時(shí)在轉(zhuǎn)化過程中添加1、5、10 μg·mL-13個(gè)不同濃度的溶菌酶，測定溶菌酶對(duì)B. subtilis N4轉(zhuǎn)化效率的影響，結(jié)果表明，傳統(tǒng)spizizen轉(zhuǎn)化組，野生型B. subtilis N4未得到轉(zhuǎn)化子，同時(shí)加有Tween-80和5 μg·mL-1溶菌酶則能提高B. subtilis N4轉(zhuǎn)化效率，如圖1c所示由原來只加4% Tween-80的17個(gè)轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA提高到26個(gè)轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA。而添加1 μg·mL-1和10 μg·mL-1的溶菌酶對(duì)原轉(zhuǎn)化效率幾乎無影響，說明適量溶菌酶可以改善細(xì)胞通透性，有助于轉(zhuǎn)化順利進(jìn)行。

2.3質(zhì)粒PHT01- nit與B. subtilis N4感受態(tài)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

由圖1d可知，在添加4% Tween-80和5 μg·mL-1溶菌酶的基礎(chǔ)上，質(zhì)粒與感受態(tài)共培養(yǎng)1 h，轉(zhuǎn)化效率最高，得到37個(gè)轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA，共培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到2 h后轉(zhuǎn)化效率為0。

2.4轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證

將從轉(zhuǎn)化子中提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果均得到大小約為1.1和8.0 kb的兩個(gè)片段（見圖2），表明重組質(zhì)粒PHT01-nit于野生型B. subtilis N4中轉(zhuǎn)化成功。

圖1　不同因素對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig. 1　Effect of different factors on transformation efficiency

2.5枯草芽孢桿菌表達(dá)載體PHT01-nit在蛋白水平的表達(dá)

對(duì)照菌（B. subtilis N4）和重組菌（B. subtilis N4-PHT01-nit）經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，重組菌出現(xiàn)1條明顯的蛋白條帶，約40 ku，與腈水解酶基因nit表達(dá)的蛋白大小相符。結(jié)果如圖3所示。

圖2　轉(zhuǎn)化子PHT01-nit雙酶切鑒定/XbaⅠ, AatⅡFig. 2　 PHT01-nit digested with XbaⅠand AatⅡ

圖3　B. subtilis N4-PHT01-nit SDS-PAGEFig. 3　SDS-PAGE results of B. subtilis N4-PHT01-nit

3　討　論

本研究使用Tween-80、丙酮、煤油、甲醇等不同有機(jī)溶劑，探討如何提高野生型B. subtilis N4的轉(zhuǎn)化效率，目前對(duì)有機(jī)溶劑作用機(jī)制研究很多，李文華等認(rèn)為復(fù)合物聚-β-羥基丁酸（Polyβ-hydroxybutyrate，PHB）存在于枯草芽孢桿菌中，PHB復(fù)合物是細(xì)菌通過細(xì)胞膜攝取外源DNA所不可缺少組分，PHB能與多聚磷酸以及Ca+形成柱狀螺旋結(jié)構(gòu)，構(gòu)成細(xì)菌細(xì)胞膜上膜通道，有利于外源DNA進(jìn)入[7]。Reusch研究顯示細(xì)菌非感受態(tài)細(xì)胞膜上的PHB含量明顯低于感受態(tài)細(xì)胞膜上的PHB[8-9]。在細(xì)菌體內(nèi)，PHB是由甲醇、有機(jī)酸、糖類、CO2等有機(jī)小分子合成，因此推斷在制備野生型B. subtilis N4感受態(tài)過程中加入的有機(jī)溶劑可能參與PHB合成，改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)而允許DNA片段進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。Nishida等研究表明[10-12]，細(xì)胞膜上磷脂可以與有機(jī)溶劑發(fā)生靜電反應(yīng)，使膜的液相流動(dòng)性提高，干擾細(xì)胞膜液晶結(jié)構(gòu)，形成間隙，質(zhì)粒DNA通過間隙進(jìn)入細(xì)胞。Tween-80是典型的表面活性劑，可提高不飽和脂肪酸C18?1ω9、C18?2ω9, 12和C16?1ω9在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)含量[13-15]，朱利中研究認(rèn)為細(xì)胞膜脂肪酸組成受表面活性劑影響，表面活性劑可增大細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸含量，提高細(xì)胞膜通透性，這是Tween-80處理過的細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率略高的原因[16]。

魏艷等曾利用有機(jī)溶劑改善細(xì)胞膜通透性方法，構(gòu)建針對(duì)野生型枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化法，但其轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA片段較小，為3.6 kb[5]。而實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒PHT01-nit大小約9.1 kb，屬于大片段質(zhì)粒DNA，不易進(jìn)入細(xì)胞，因此僅通過添加有機(jī)溶劑只得到17個(gè)轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA，轉(zhuǎn)化效率略低。本研究在魏艷等研究基礎(chǔ)上，在感受態(tài)制備過程中添加有機(jī)溶劑同時(shí)，在轉(zhuǎn)化過程中添加適量溶菌酶以進(jìn)一步提高野生型B. subtilis N4的轉(zhuǎn)化效率。由N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺以β （1, 4）糖苷鍵連成的大分子肽聚糖是構(gòu)成細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，而N-乙酰胞壁酸酶俗稱溶菌酶，可破壞細(xì)胞壁的雙糖結(jié)構(gòu)。故有學(xué)者提出為了便于外源DNA進(jìn)入細(xì)胞，使用適當(dāng)溶菌酶處理細(xì)胞壁使其變薄或形成空隙[6]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化過程中加入5 μg·mL-1溶菌酶使轉(zhuǎn)化效率提高到26個(gè)轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA，而添加1 μg·mL-1和10 μg·mL-1溶菌酶對(duì)轉(zhuǎn)化效率沒有影響，這可能是由于濃度過小的溶菌酶對(duì)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)沒有破壞作用，而過量溶菌酶會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量原生質(zhì)外漏而影響轉(zhuǎn)化[6]，只有適量溶菌酶才能有效改善B. subtilis N4細(xì)胞的通透性，利于重組質(zhì)粒PHT01-nit進(jìn)入。

依據(jù)Spizizen[3]轉(zhuǎn)化法，若達(dá)到有效轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒與感受態(tài)共培養(yǎng)時(shí)間僅需30 min，但魏艷報(bào)道[5]，細(xì)胞感受態(tài)狀態(tài)可維持1 h，為獲得最大轉(zhuǎn)化效率，本研究比較質(zhì)粒與感受態(tài)不同的共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響，確定野生型B. subtilis N4轉(zhuǎn)化最佳共培養(yǎng)時(shí)間為1 h。

4　結(jié)　論

a.通過改進(jìn)spizizen轉(zhuǎn)化法，在感受態(tài)制備過程中添加有機(jī)溶劑Tween-80，使重組質(zhì)粒PHT01-nit轉(zhuǎn)化野生型B. subtilis N4的轉(zhuǎn)化效率由原來的0個(gè)轉(zhuǎn)化子提高到17個(gè)轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA。

b.在感受態(tài)制備過程中添加4% Tween-80基礎(chǔ)上，在轉(zhuǎn)化過程中添加5 μg·mL-1溶菌酶，使重組質(zhì)粒PHT01-nit轉(zhuǎn)化野生型B. subtilis N4的轉(zhuǎn)化效率由17個(gè)轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA提高到26個(gè)轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA。

c.通過比較重組質(zhì)粒PHT01-nit和B. subtilis N4感受態(tài)不同的共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)時(shí)間在1 h時(shí)轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最大，得到37個(gè)轉(zhuǎn)化子·μg-1DNA。優(yōu)化Spizizen轉(zhuǎn)化法，使其適用于大片段重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化野生型枯草芽孢桿菌。

d.重組菌Bacillus subtilis N4-pHT01-nit經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，通過SDS-PAGE證明nit在野生型枯草芽孢桿菌N4中成功表達(dá)。

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Optimization of the spizizen method for wild-type Bacillus subtilis N4

/LI Chunyan1, FENG Fengzhao1, FENG Lu1, CHENG Yi1, CHENG Xiaosong2(1. School of Resources and Environmental Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. School of First Clinical Medicine, Harbin Medical University, Harbin 150001, China)

Abstract:The constructed large recombinant plasmid could not be transformed into the wild-type Bacillus subtilis N4 by traditional spizizen method. In this study, we optimized the spizizen method by adding organic solvents and lysozyme in preparation and transformation of competent cells. The types and concentrations of organic solvent, the concentrations of lysozyme, co-culture time of plasmids and competent cells were studied for improving transformation efficiency to construct Bacillus subtilis N4 PHT01-nit. After IPTG induced, the expression of nit in wild type Bacillus subtilis N4 was validated by SDS-PAGE. Results showed that the highest transformation efficiency of 37 transformants·μg-1DNA could be obtained when 4% of the Tween-80 was added in preparation of competent cells, 5 μg·mL-1of lysozyme was added in transformation of competent cells, and plasmids were cultured with competent cells for 1 h. SDS-PAGE showed that the target protein band was consistent with nitrilase. This optimized spizizen method could be used for large plasmid DNA transformation into the wild-type Bacillussubtilis.

Key words:wild-type Bacillussubtilis; spizizen method; organic solvents; lysozyme; SDS-PAGE

作者簡介：李春艷（1970-），女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物。E-mail: chunyanli@neau.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（41271504）

收稿日期：2014-03-14

文章編號(hào)：1005-9369（2015）02-0078-05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類號(hào)：Q785