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美拉德反應(yīng)修飾改善豬血漿蛋白抗氧化肽功能特性的研究
劉騫1,牛海力1,李菁1, 2,盧巖1,耿蕊1,孔保華1*,李東海1
(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,哈爾濱150030;
2.哈爾濱市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院,哈爾濱150036)
摘要:研究主要探討美拉德反應(yīng)修飾對豬血漿蛋白抗氧化肽功能特性的影響。采用D-半乳糖對豬血漿蛋白抗氧化肽進(jìn)行美拉德修飾,蛋白質(zhì)和糖的比例為1?3(W/W),在90℃水浴中分別加熱0、1和6 h,得到美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs),測定其溶解性、表面疏水性、乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及起泡穩(wěn)定性。結(jié)果表明,經(jīng)美拉德反應(yīng)修飾后豬血漿蛋白抗氧化肽的功能特性有明顯改善,其溶解性、乳化及乳化穩(wěn)定性、起泡及起泡穩(wěn)定性均隨反應(yīng)時(shí)間增加而逐漸增大(P<0.05),表面疏水性則隨反應(yīng)時(shí)間增加而降低(P<0.05)。同時(shí),MRPs功能特性隨體系中pH的改變而顯著變化(P<0.05)。因此,采用美拉德修飾改善豬血漿蛋白抗氧化肽功能特性,可使其廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)。
關(guān)鍵詞:豬血漿蛋白抗氧化肽;D-半乳糖;美拉德反應(yīng)修飾;功能特性
網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2015-1-27 15:59:46
[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150127.1559.003.html
劉騫,牛海力,李菁,等.美拉德反應(yīng)修飾改善豬血漿蛋白抗氧化肽功能特性的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 46(2): 18-23. Liu Qian, Niu Haili, LI Jing, et al. Improvement of functional properties of procine plasma protein antioxidant peptides via maillard reaction modification[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(2): 18-23. (in Chinese with English abstract)
目前,利用不同蛋白資源開發(fā)蛋白肽成為研究熱點(diǎn)。研究表明蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解后會產(chǎn)生具有抗氧化活性的抗氧化肽,已有研究包括乳清蛋白[1]、玉米蛋白[2]、豬血漿蛋白[3]、卵白蛋白[4],肌肉蛋白[5],大豆蛋白[6],馬鈴薯蛋白[7],以及蕎麥蛋白[8]等。與其他生物分子如氨基酸、大分子蛋白質(zhì)等相比,抗氧化肽具有天然、高效以及安全性高等優(yōu)點(diǎn)。但相關(guān)研究表明,抗氧化肽的功能特性(尤其是乳化性、起泡性和凝膠性等等)由于酶解作用而喪失很多,直接影響其在食品體系中應(yīng)用[9-10]。因此,有必要通過適當(dāng)?shù)母男约夹g(shù),使抗氧化肽的功能性得到顯著改善,使其具有更好的應(yīng)用前景。
美拉德修飾(Maillard reaction modification)是一種在食品加工過程中廣泛存在的非酶褐變反應(yīng),主要是指食品中的羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸和蛋白質(zhì))間發(fā)生復(fù)雜反應(yīng)[11],又稱美拉德或者羰胺反應(yīng)。美拉德修飾對食品的品質(zhì)極其重要,會在色澤、風(fēng)味、營養(yǎng)價(jià)值以及功能特性等方面影響食品的品質(zhì)[12]。Saeki通過葡萄糖對鯉魚肌原纖維蛋白進(jìn)行美拉德修飾,研究結(jié)果表明肌原纖維蛋白的乳化能力顯著增強(qiáng)[13]。Liu等將花生分離蛋白與D-核糖在加熱條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)[14],研究結(jié)果表明花生分離蛋白的乳化性和熱穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。通過以上文獻(xiàn)綜述可知,大部分學(xué)者都在致力于研究美拉德修飾對蛋白質(zhì)功能特性的促進(jìn)作用及其機(jī)制,但鮮少有人研究美拉德修飾對抗氧化肽功能特性的改善與促進(jìn)。因此,在前期研究基礎(chǔ)之上[15],本試驗(yàn)利用D-半乳糖對豬血漿蛋白抗氧化肽進(jìn)行美拉德修飾,探討抗氧化肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products,MRPs)功能特性變化,為豬血漿蛋白抗氧化肽在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1.1材料
豬血漿蛋白粉購于黑龍江省北大荒肉業(yè),蛋白質(zhì)含量為70%;堿性蛋白酶Alcalase購買于Novo公司;D-半乳糖,8-苯氨基-萘酚-磺酸(ANS),十二烷基磺酸鈉(SDS)購于美國Sigma試劑公司;大豆色拉油購于上海嘉里糧油工業(yè)有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2儀器與設(shè)備
FE20KpH計(jì)(上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司);JD500-2電子天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司);AL-104型精密電子天平(上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司);UT-1800紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)、DK-8B電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);JJ-1精密增力電動攪拌器(常州國華電器有限公司);FD-2A冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司);AM-1磁力攪拌器(北京鼎昊源實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);F-4500熒光分光光度計(jì)(日本日立公司);T-18Basic內(nèi)切式勻漿機(jī)(德國IKA公司)。
1.3方法
1.3.1豬血漿蛋白抗氧化肽的制備
參照Liu等的方法制備豬血漿蛋白抗氧化肽[3]。將豬血漿蛋白粉溶解后(40 mg·mL-1),經(jīng)90℃水浴中預(yù)熱5 min,調(diào)節(jié)溶液pH、溫度至堿性蛋白酶最適條件(對于堿性蛋白酶,最適pH 8.0,最適溫度為55℃),添加堿性蛋白酶的量與底物之比為2?100(g·g-1)。水解過程中不斷加入1 mol·L-1NaOH,使溶液pH保持恒定,記錄耗堿量(mL),水解時(shí)間為5 h。待水解結(jié)束后,用1 mol·L-1HCl把水解液的pH調(diào)為7.0,然后在95℃水浴中加熱5 min使酶滅活,得到豬血漿蛋白抗氧化肽(PPPH)。真空冷凍干燥水解液,得淺黃色粉末狀固體,將凍干樣品密封于4℃下保存。
1.3.2美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備
按照Li等方法[15],將豬血漿蛋白抗氧化肽溶解,使之蛋白濃度為20 mg·mL-1。稱取一定量的D-半乳糖,加入蛋白溶液中,使反應(yīng)體系中蛋白與糖的比例為1?3。取上述溶液10 mL轉(zhuǎn)移到25 mL具塞試管中,蓋緊。在90℃水浴中分別加熱0、1和6 h,然后立即放入冰水中冷卻。將獲得的MRPs進(jìn)行真空冷凍干燥,得黃色粉末狀固體,將凍干樣品密封于4℃下保存,用于分析其功能特性。1.3.3溶解性的測定
稱取200 mg不同反應(yīng)時(shí)間的MRPs樣品,分別在20 mL pH 3.0~8.0的緩沖溶液中溶解。用磁力攪拌器在室溫下攪拌30 min,4 000 r·min-1離心20 min,轉(zhuǎn)移上清液,上清液中蛋白質(zhì)含量用雙縮脲法進(jìn)行測定。樣品中總蛋白含量用凱式定氮法測定。然后用以下公式進(jìn)行計(jì)算:
溶解性(%)=(A/B)×100%
式中,A表示上清液中蛋白含量;B表示水解樣品中總蛋白含量。
1.3.4表面疏水性的測定
參照Akita等方法[16]。不同反應(yīng)時(shí)間的MRPs樣品用pH 3.0~8.0的緩沖溶液溶解成濃度為1, 5, 8, 10和20 mg蛋白/100 mL的溶液。每3 mL的蛋白溶液加入5 μL的ANS溶液(8 mmol·L-1)。使用1 cm樣品池,利用F4500熒光分光光度計(jì)測量。測量條件為:激發(fā)波長374 nm,發(fā)射波長485 nm,狹縫寬選擇10 nm,在室溫20℃下測定。被溶解的MRPs樣品的疏水性值(R)由相對熒光值H0與蛋白濃度(g·L-1)的比值計(jì)算。
參照Pearce等方法[17],稍作修改。稱取60 mg不同反應(yīng)時(shí)間的MRPs樣品,在pH 3.0~8.0的緩沖溶液中溶解。在室溫下(25℃)用磁力攪拌器攪拌30 min。分別加入10 mL大豆色拉油。用內(nèi)切式勻漿機(jī)在20 000 r·min-1條件下分散乳化1 min。分別在乳化后0、10 min取50 μL乳狀液于試管中,加入5 mL 0.1%SDS混勻,在500 nm時(shí)測定吸光度,乳化性及乳化穩(wěn)定性用如下公式計(jì)算:
乳化活力指數(shù)EAI(m2·g-1)=(2×2.303×A0)/[0.25×Protein weight(g)]
乳化穩(wěn)定指數(shù)ESI(min)=A0×Δt/ΔA
式中,A0、A10為乳狀液在0和10 min時(shí)吸光度;ΔA=A0-A10;Δt=10 min
1.3.6起泡性及起泡穩(wěn)定性的測定
參照Klompong等方法[18]。稱取100 mg不同反應(yīng)時(shí)間MRPs樣品,用20 mL pH 3.0~8.0的緩沖溶液溶解。用磁力攪拌器在室溫下攪拌30 min。將全部溶液轉(zhuǎn)移至50 mL量筒內(nèi),讀出此時(shí)溶液體積(V1),然后將溶液轉(zhuǎn)移到燒杯中,用內(nèi)切式勻漿機(jī)在20 000 r·min-1下攪打2 min,然后馬上轉(zhuǎn)移到50 mL量筒中讀出體積(V2)。
起泡性(%)=(V2/V1)×100%
回家的一路,阿里都在車上打瞌睡。他起得很早,于是困了。阿里在夢中不僅見到了母親,并且還得到許多好吃的東西。于是他臉上浮出笑容。車晃動著,阿里睡著的頭隨著汽車顛簸的節(jié)奏一甩一甩。阿東便伸手將他的頭靠在自己肩頭。阿里立即以一種愜意的方式枕著阿東,他連醒都沒醒。
經(jīng)攪打形成的泡沫靜止放置60 min后,讀出泡沫的體積記為(V3)。
起泡穩(wěn)定性(%)=(V3/V2)×100%
1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果表示為Mean±SD。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1(分析軟件,St Paul,MN)軟件包中Linear Models程序進(jìn)行,差異顯著性(P<0.05)分析使用Tukey HSD程序。采用Sigmaplot 11.0軟件作圖。
2.1美拉德修飾對豬血漿蛋白抗氧化肽溶解性影響
由圖1可知,隨著美拉德反應(yīng)修飾時(shí)間的延長,PPPH與D-半乳糖形成的MRPs的溶解性也隨之增大(P<0.05),并且反應(yīng)修飾6 h的樣品的溶解性顯著高于其他處理組(P<0.05)。同時(shí),在不同的pH值范圍內(nèi)(3.0~8.0),反應(yīng)修飾6 h的樣品的溶解性均超過86.1%,隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行,半乳糖和蛋白肽逐漸通過次級力形成較弱的復(fù)合物,有利于蛋白的溶解[19]。由于等電點(diǎn)緣故,所有處理組的樣品在pH為5.0時(shí),溶解性均達(dá)到最低點(diǎn),而在其他pH條件下溶解性均高于84.5%。
2.2美拉德修飾對豬血漿蛋白抗氧化肽表面疏水性的影響
由圖2可知,隨著美拉德反應(yīng)修飾時(shí)間的延長,各處理組得到的MRPs的表面疏水性隨之降低(P<0.05),反應(yīng)修飾6 h的樣品表面疏水性顯著低于其他處理組(P<0.05)。另外,不同pH對表面疏水性影響顯著(P<0.05),在pH為3.0時(shí),表面疏水性均達(dá)到最大,隨著pH增大,各樣品表面疏水性逐漸降低(P<0.05)。
2.3美拉德修飾對豬血漿蛋白抗氧化肽乳化性以及乳化穩(wěn)定性的影響
蛋白質(zhì)的乳化特性通常用乳化活力指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定指數(shù)(ESI)表示。由圖3可知,與D-半乳糖發(fā)生美拉德反應(yīng)修飾后,所得MRPs的EAI和ESI均有不同程度改善,隨著美拉德反應(yīng)修飾時(shí)間的延長,乳化性和乳化穩(wěn)定性的改善程度隨之增加(P< 0.05)。pH對EAI和ESI的影響與對溶解性的影響一致,不同反應(yīng)修飾時(shí)間的MRPs在pH為5.0時(shí),其EAI和ESI均達(dá)到最低。Klompong等研究發(fā)現(xiàn)[18],較高的溶解性會促進(jìn)肽在乳化相中的分散和吸附。當(dāng)體系的pH為5.0時(shí),MRPs溶解性降到最低,從而使得大分子在乳化相的活動受到限制,致使乳化性和乳化穩(wěn)定性降低。
2.4美拉德修飾對豬血漿蛋白抗氧化肽起泡性以及起泡穩(wěn)定性的影響
結(jié)果見圖4。
圖1 pH對不同美拉德反應(yīng)修飾時(shí)間的豬血漿蛋白抗氧化肽溶解性的影響Fig. 1 Solubility of porcine plasma protein antioxidant peptides modified using Maillard reaction with differentreaction times as influenced by pHs
圖2 pH對不同美拉德反應(yīng)修飾時(shí)間的豬血漿蛋白抗氧化肽表面疏水性的影響Fig. 2 Surface hydrophobicity of porcine plasma protein antioxidant peptides modified using Maillard reaction withdifferent reaction times as influenced by pHs
圖3 pH對不同美拉德反應(yīng)修飾時(shí)間的豬血漿蛋白抗氧化肽乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig. 3 Emulsifying activity index (EAI) and emulsion stability index (ESI) of porcine plasma protein antioxidant peptides modified using Maillard reaction with different reaction times as influenced by pHs
經(jīng)過美拉德反應(yīng)修飾的PPPH相對于未處理的樣品,隨著反應(yīng)修飾時(shí)間的延長,起泡性和起泡穩(wěn)定性均顯著提高(P<0.05)。其中,反應(yīng)6 h的樣品提高幅度最大(P<0.05)。當(dāng)pH為5.0時(shí),各處理組樣品的起泡性和起泡穩(wěn)定性最差(P<0.05),而且在pH 為8.0時(shí)的堿性條件下,各處理組樣品的起泡性和起泡穩(wěn)定性均達(dá)到最大(P<0.05),可見起泡性和起泡穩(wěn)定性與樣品的溶解度有一定關(guān)聯(lián)。
圖4 pH對不同美拉德反應(yīng)修飾時(shí)間的豬血漿蛋白抗氧化肽起泡性和起泡穩(wěn)定性的影響Fig. 4 Foaming ability and foam stability of porcine plasma protein antioxidant peptides modified using Maillard reaction with different reaction times as influenced by pHs
對于食品加工中的添加組分而言,溶解性是最重要的功能性質(zhì),其他功能性質(zhì)(如乳化性、起泡性等等)以溶解性為前提。經(jīng)美拉德反應(yīng)修飾后的豬血漿蛋白抗氧化肽溶解性增大原因主要是,糖類具有較多的親水基團(tuán),使美拉德反應(yīng)修飾后的蛋白肽-糖復(fù)合物中存在大量羥基基團(tuán),使整個(gè)分子的溶解性得到提高[20]。Achouri等將含有11S部分的大豆球蛋白與葡萄糖在50℃[21]、65%相對濕度條件下加熱,進(jìn)行美拉德反應(yīng),結(jié)果表明,加熱到24 h,反應(yīng)體系溶解性逐漸增加。
表面疏水性是蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì),用于評價(jià)蛋白空間構(gòu)象,與蛋白的功能性質(zhì)相關(guān)。蛋白質(zhì)表面疏水性反映蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸相對含量。經(jīng)美拉德反應(yīng)修飾后,豬血漿蛋白抗氧化肽疏水集團(tuán)通過疏水相互作用聚集,埋藏在分子內(nèi)部,分子表面大多被親水集團(tuán)占據(jù),致使表面疏水性呈降低趨勢[22]。表面疏水性還與環(huán)境體系中的pH有顯著關(guān)聯(lián)。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)[23],鷹嘴豆分離蛋白在pH為3.0時(shí)表面疏水性最大,而在pH為9.0時(shí)表面疏水性達(dá)到最小。
乳化性是蛋白質(zhì)重要功能特性,與蛋向質(zhì)的品質(zhì)密切相關(guān),直接影響蛋白質(zhì)在食品行業(yè)中的有效利用。經(jīng)美拉德反應(yīng)修飾后的蛋白肽的乳化性及乳化穩(wěn)定性均有所提高,這是由于經(jīng)熱處理后,原來隱藏在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來,親油性增強(qiáng)[24]。同時(shí)由于糖添加可增加油/水乳化體系中水相的黏度,會稍微下降油/水界面張力,增加乳化液的乳化穩(wěn)定性[25]。
泡沫是一種具有雙相性的膠體系統(tǒng),其中含有大量連續(xù)的液相和被分散的汽相。起泡性和起泡穩(wěn)定性是表示起泡性質(zhì)的最基本指標(biāo)[26]。在本試驗(yàn)中,經(jīng)美拉德反應(yīng)修飾后的豬血漿蛋白抗氧化肽的起泡性及起泡穩(wěn)定性均有所提高,但最差的起泡性及起泡穩(wěn)定性出現(xiàn)在pH為5.0時(shí),與溶解性變化一致,這是因?yàn)榈鞍椎娜芙庑詫Φ鞍椎钠鹋菪再|(zhì)具有重要影響,蛋白質(zhì)起泡性主要取決于其可溶部分,蛋白質(zhì)高溶解性是良好起泡性及起泡穩(wěn)定性的先決條件,蛋白質(zhì)只有具有一定溶解性,才會有效向油水界面和氣液界面擴(kuò)散,但不溶解蛋白質(zhì)粒子在穩(wěn)定泡沫中由于提高了表面粘度而產(chǎn)生有益作用[27]。
經(jīng)美拉德反應(yīng)修飾后的豬血漿蛋白抗氧化肽功能特性顯著提高。溶解性、起泡及起泡穩(wěn)定性、乳化及乳化穩(wěn)定性隨反應(yīng)時(shí)間增加而逐漸增大,表面疏水性則隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而降低。同時(shí),各功能性質(zhì)均隨環(huán)境體系中pH改變而變化。因此,美拉德反應(yīng)修飾可有效改善豬血漿蛋白抗氧化肽功能特性,應(yīng)用于食品加工業(yè)中,可為抗氧化肽有效利用提供新途徑。
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Improvement of functional properties of procine plasma protein
antioxidant peptides via maillard reaction modification
/LIU Qian1, NIU Haili1, LI Jing1, 2, LU Yan1, GENG Rui1, KONG Baohua1, LI Donghai1(1. School of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Harbin Institute of Product Quality and Inspection, Harbin 150036, China)
Abstract:This study mainly investigated the influence of functional properties of procine plasma protein antioxidant peptides via Maillard reaction modification. Porcine plasma protein hydrolysate (PPPH) were mixed with D-galactose with the ratio of 1?3 (W/W) to formulate a reaction system and then heated at 90℃for 0, 1 and 6 h, in order to get maillard reaction products (MRPs) of different reaction times. Solubility, surface hydrophobicity, emulsifying activity index (EAI) and emulsion stability index (ESI), foaming ability and foam stability were determined. The results showed that the functional properties of porcine plasma protein antioxidant peptides have significantly improved via the Maillard reaction modification. Solubility, EAI and ESI, foaming ability and foaming stability were significantly increased as the heating time increased (P<0.05), as well as the surface hydrophobicity of MRPs were significantly decreased as the heating time increased (P<0.05). Additionally, the functional properties of
MRPs were obviously affected by pH values (P<0.05). Therefore, Maillard reaction modification could significantly improve the functional properties of procine plasma protein antioxidant peptides, and also could be used as an emulsifier and as a foaming agent in food industry.
Key words:procine plasma protein antioxidant peptides; D-galactose; maillard reaction modification; functional properties
*通訊作者:孔保華,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工。E-mail: kongbh@163. com
作者簡介:劉騫(1981-),男,副教授,博士,碩士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工。E-mail: liuqian_neau@hotmail. com
基金項(xiàng)目:黑龍江省教育廳普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃項(xiàng)目(1253G007);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(新教師類)(20122325120018);國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(31301450)
收稿日期:2014-05-04
文章編號:1005-9369(2015)02-0018-06
文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A
中圖分類號:S855.1+2