冠狀動(dòng)脈結(jié)扎（孫絡(luò)疏失）模型大鼠心肌組織梗死區(qū)及缺血區(qū)ICAM-1、VCAM-1基因表達(dá)的研究*

霍 旺 張俊修 李紹旦 楊明會(huì) 劉 毅

（中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院中醫(yī)院，北京 100853）

冠狀動(dòng)脈結(jié)扎（孫絡(luò)疏失）模型大鼠心肌組織梗死區(qū)及缺血區(qū)ICAM-1、VCAM-1基因表達(dá)的研究*

霍 旺 張俊修 李紹旦 楊明會(huì)△劉 毅

（中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院中醫(yī)院，北京 100853）

目的 探討“孫絡(luò)疏失”模型大鼠心肌組織梗死區(qū)及缺血區(qū)細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）基因表達(dá)變化規(guī)律。方法 選取心電圖正常雄性SD大鼠60只，并隨機(jī)分為假手術(shù)組、造模30min組、造模1 h組、造模6 h組、造模12 h組和造模24 h組，共6組，每組10只。通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支建立“孫絡(luò)疏失”模型，假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。各組大鼠按分組時(shí)間點(diǎn)于梗死區(qū)及缺血區(qū)各取部分心肌組織，利用Real-Time PCR方法檢測(cè)“孫絡(luò)疏失”模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死區(qū)及缺血區(qū)ICAM-1、VCAM-1基因表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠梗死區(qū)中ICAM-1 mRNA表達(dá)自結(jié)扎后12 h開始顯著升高并持續(xù)至結(jié)扎后24 h（P＜0.01）；而在缺血區(qū)中ICAM-1 mRNA表達(dá)在結(jié)扎后6 h開始顯著升高并持續(xù)至結(jié)扎后24 h（P＜0.01）。VCAM-1 mRNA表達(dá)方面，梗死區(qū)中VCAM-1 mRNA表達(dá)在結(jié)扎后24 h顯著升高（P＜0.01）；而在缺血區(qū)內(nèi)VCAM-1 mRNA表達(dá)在結(jié)扎后1 h即可顯著升高并持續(xù)至結(jié)扎后24 h（P＜0.01）。結(jié)論“孫絡(luò)疏失”早期即可出現(xiàn)炎癥因子異常表達(dá)，且缺血區(qū)內(nèi)炎癥因子的過(guò)度表達(dá)要早于同時(shí)段的梗死區(qū)域。

孫絡(luò)疏失 心肌缺血 ICAM-1 VCAM-1 大鼠

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“孫絡(luò)”即為經(jīng)絡(luò)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中最末端最細(xì)小的層次，是人體運(yùn)行氣血的最小功能單位［1］。吳以嶺院士提出“脈絡(luò)-血管系統(tǒng)病”理論，并認(rèn)為“孫絡(luò)”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)之微循環(huán)具有同一性［2］。因此，微血管病變導(dǎo)致器官組織功能、結(jié)構(gòu)的病理改變與“孫絡(luò)”受損進(jìn)而導(dǎo)致孫絡(luò)病的病理變化具有密切相關(guān)性。冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙是急性心肌梗死經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療過(guò)程中常見的并發(fā)癥，是影響冠狀動(dòng)脈微循環(huán)灌注的主要原因，是決定急性心梗患者遠(yuǎn)期預(yù)后不良和死亡率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［3］。但目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對(duì)冠脈微循環(huán)障礙的治療缺乏系統(tǒng)、規(guī)范、特效的方法。本課題組在既往研究基礎(chǔ)上提出營(yíng)衛(wèi)承制調(diào)平理論，并反映了血管病變作為復(fù)雜性疾病在生理、病理、治療以及轉(zhuǎn)歸等不同階段的內(nèi)在規(guī)律［4］，以期發(fā)揮中醫(yī)藥整體調(diào)節(jié)以及多層面、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，在冠脈微循環(huán)障礙性疾病中做出一定的突破。本研究以脈絡(luò)學(xué)說(shuō)為指導(dǎo)思想，以結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支的方法建立 “孫絡(luò)疏失”模型，并探討“孫絡(luò)疏失”病理狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為脈絡(luò)學(xué)說(shuō)認(rèn)識(shí)、治療冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙提供一定的數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（220± 20）g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-（軍）2012-0004。按每籠5只飼養(yǎng)于獨(dú)立通氣籠具系統(tǒng)內(nèi)，溫度（22±1）℃，濕度（50±5）%，每天光照與黑夜時(shí)間各12 h。實(shí)驗(yàn)期間造模、取材等操作均在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，添加飼料、換水等由專人負(fù)責(zé)管理。

1.2 主要試劑 烏拉坦 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)T2011110）；注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號(hào)：F3047216）；RNA pure超純總RNA快速提取試劑盒 （博邁德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：67691288）；Trans Script First-strand cDNA Synthesis Super Mix（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：I10725）；Trans StartGreen qPCR Super Mix（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：I10830）。

1.3 主要儀器 電子秤（長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司，EPS-2001）；小動(dòng)物心電圖機(jī)（北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司，F(xiàn)X-211）；動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技有限公司，ALC-V9）；超凈工作臺(tái)（北京長(zhǎng)城空氣凈化工程公司）；高速離心機(jī) （Perkin Elmer VICTOR X5）；Step One Plus Real-Time PCR System（Applied Biosystems）；Multiskan MK3酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4 造模及分組 選取心電圖正常大鼠60只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組、造模30min組、造模1 h組、造模6 h組、造模12 h組和造模24 h組，共6組，每組10只?！皩O絡(luò)疏失”大鼠模型參照文獻(xiàn)［5］，大鼠以20%烏拉坦按5mL/kg腹腔注射麻醉后，經(jīng)口氣管插管連接呼吸機(jī)，設(shè)定呼吸頻率80次/min、潮氣量15mL/kg、呼吸比1∶1。于大鼠左側(cè)胸壁3～4肋間橫向開胸，暴露心臟，撕開心包膜，在冠狀動(dòng)脈左側(cè)主干處，左心耳下方約2～3mm處以左心耳與肺動(dòng)脈圓錐間左冠狀靜脈主干為標(biāo)志結(jié)扎（假手術(shù)組只穿線，不接扎），進(jìn)針深度約1～1.5mm，寬約2.0mm，逐層關(guān)閉胸腔，待大鼠自主呼吸恢復(fù)后，移除呼吸機(jī)。以室壁運(yùn)動(dòng)減弱，結(jié)扎下部心肌組織顏色變白，心電圖可見胸前各個(gè)導(dǎo)聯(lián)的ST段抬高、T波高聳為造模成功標(biāo)志，造模后每只大鼠一次性注射青霉素鈉40萬(wàn)U預(yù)防感染。

1.5 梗死區(qū)及缺血區(qū)細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）mRNA、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）mRNA表達(dá)各組大鼠到達(dá)分組時(shí)間點(diǎn)后，取左心室前壁梗死區(qū)及缺血區(qū)心肌組織約100mg置于液氮中，-80℃冰箱保存待測(cè)。利用總RNA快速提取試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定純度并定量。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件均參照說(shuō)明書設(shè)定。采用2-ΔΔct方法計(jì)算相對(duì)定量mRNA。引物由Invitrogen公司根據(jù)GenBank所發(fā)布的序列設(shè)計(jì)并合成，引物序列參見表1。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有數(shù)據(jù)均以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

由表2，3可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠梗死區(qū)中ICAM-1mRNA表達(dá)自結(jié)扎后12 h開始顯著升高并持續(xù)至結(jié)扎后24 h（P＜0.01）；而在梗死區(qū)中，VCAM-1mRNA表達(dá)在結(jié)扎后24 h顯著升高（P＜0.01），其余各組表達(dá)并無(wú)明顯變化。而與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血區(qū)ICAM-1mRNA表達(dá)在結(jié)扎后6 h開始顯著升高并持續(xù)至結(jié)扎后24 h（P＜0.01）。與之類似，模型組大鼠缺血區(qū)VCAM-1mRNA表達(dá)在結(jié)扎后1 h即可顯著升高并持續(xù)至結(jié)扎后24 h（P＜0.01）。

表2 各組大鼠梗死區(qū)ICAM-1、VCAM-1mRNA表達(dá)（±s）

表2 各組大鼠梗死區(qū)ICAM-1、VCAM-1mRNA表達(dá)（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.01。下同。

組 別 n ICAM-1mRNA VCAM-1mRNA假手術(shù)組 10 1.01±0.18 1.00±0.10造模30min組 10 0.79±0.53 1.49±0.32造模1 h組 10 1.76±0.94 1.46±0.24造模6 h組 10 1.99±1.05 1.18±0.16造模12 h組 10 4.01±2.26* 1.39±0.2造模24 h組 10 5.40±2.88* 4.54±0.46*

表3 各組大鼠缺血區(qū)ICAM-1、VCAM-1mRNA表達(dá)（±s）

表3 各組大鼠缺血區(qū)ICAM-1、VCAM-1mRNA表達(dá)（±s）

組 別 n ICAM-1mRNA VCAM-1mRNA假手術(shù)組 10 1.00±0.12 1.01±0.11造模30min組 10 2.09±0.39 1.30±0.10造模1 h組 10 1.10±0.21 2.51±0.68*造模6 h組 10 6.39±2.04* 4.75±0.50*造模12 h組 10 6.90±1.80* 4.55±0.68*造模24 h組 10 5.91±1.94* 5.04±0.80*

3 討 論

3.1 關(guān)于孫絡(luò)疏失模型 “孫絡(luò)疏失”是在絡(luò)病學(xué)理論基礎(chǔ)上提出的新概念?！懊}絡(luò)-血管系統(tǒng)病”理論認(rèn)為，脈絡(luò)與中小血管以及微循環(huán)具有密切相關(guān)性，孫絡(luò)作為脈絡(luò)分支的最末端結(jié)構(gòu)與微循環(huán)相對(duì)應(yīng)，二者在結(jié)構(gòu)分布、生理功能、病理變化等方面均具有同一性［6-7］。因此，“孫絡(luò)疏失”的病變基礎(chǔ)在微循環(huán)，“疏”指數(shù)量的減少，“失”是“疏”的進(jìn)一步發(fā)展，造成了小范圍內(nèi)的“孫絡(luò)”消失，同時(shí)“疏失”也指功能的缺失［8］。結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支建立的急性心肌缺血模型，已被廣泛證實(shí)其微血管密度顯著降低［9］，與“孫絡(luò)疏失”之結(jié)構(gòu)概念變化相對(duì)應(yīng)；而心肌梗死后左心功能的病理改變也與“孫絡(luò)疏失”后營(yíng)衛(wèi)氣化功能失司而致“孫絡(luò)”滲灌氣血濡養(yǎng)臟腑的功能受損表現(xiàn)相一致［10］。因此，可以選擇通過(guò)結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支的方法來(lái)建立心之絡(luò)病“孫絡(luò)疏失”的病理模型。

3.2 “孫絡(luò)疏失”模型血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子動(dòng)態(tài)變化 ICAM-1、VCAM-1是由血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的一類黏附分子，屬于免疫球蛋白超家族成員。二者分別通過(guò)與白細(xì)胞表面相應(yīng)的配體CD11/CD18復(fù)合物以及VLA-4結(jié)合的方式，促進(jìn)白細(xì)胞的滾動(dòng)黏附和炎性滲出，在介導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及血栓形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，心肌缺血后細(xì)胞黏附分子表達(dá)明顯升高［11］，促進(jìn)了炎癥反應(yīng)進(jìn)程，進(jìn)一步加重缺血引起的損傷，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的破壞。因此，細(xì)胞黏附分子水平能夠反映血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及炎癥反應(yīng)的程度［12-13］。

本研究結(jié)果表明，梗死區(qū)ICAM-1mRNA的表達(dá)在結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支造成“孫絡(luò)疏失”后12 h開始顯著升高，并持續(xù)至結(jié)扎24 h。梗死區(qū)中VCAM-1 mRNA表達(dá)在結(jié)扎后24 h開始顯著升高。而在模型組大鼠缺血區(qū)中ICAM-1mRNA表達(dá)在結(jié)扎后6 h開始顯著升高并持續(xù)至結(jié)扎后24 h。與之類似，模型組大鼠缺血區(qū)內(nèi)VCAM-1mRNA表達(dá)在結(jié)扎后1 h即可顯著升高并持續(xù)至結(jié)扎后24 h，均早于二者在梗死區(qū)內(nèi)的表達(dá)。此結(jié)果提示，“孫絡(luò)疏失”早期即可出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并且缺血區(qū)域內(nèi)的炎癥變化進(jìn)程要早于同時(shí)段的梗死區(qū)域?！皩O絡(luò)”即微血管僅有一層血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的完整對(duì)于微循環(huán)正常生理功能的發(fā)揮起到至關(guān)重要的作用。此次研究表明，由ICAM-1以及VCAM-1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)作為關(guān)鍵因素參與了“孫絡(luò)疏失”病理變化過(guò)程，引起微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，最終導(dǎo)致微循環(huán)障礙，這對(duì)于了解“孫絡(luò)疏失”的病理變化過(guò)程，以及應(yīng)用絡(luò)病理論保護(hù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制炎癥反應(yīng)，改善微循環(huán)等方面均具有重要意義。

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Study of Gene Expression of ICAM-1 and VCAM-1 in Myocardium Infarct Area and Ischemic Area of Model Rats with the Pattern of Loosened and Weakened Minute Collaterals in the Domain of TCM by Coronary Artery Ligation

HUO Wang，ZHANG Junxiu，LI Shaodan，et al. Traditional Chinese Medicine Hospital，People′s Liberation Army General Hospital，Beijing 100853，China

Objective：To explore the change law of intercellular cell adhesion molecule-1（ICAM-1）and vascular cell adhesion molecule-1（VCAM-1）in model rats with the pattern of loosened and weakened minute collaterals in the domain of Chinese medicine by coronary artery ligation.Methods：A total of 60 male Sprague-Dawley rats with regular ECG performance were randomized divided into the sham-operation group，the 30 min-modeling group，the 1 h-modeling group，the 6 h-modeling group，the 12 h-modeling group and the 24 h-modeling group.The model of loosened and weakened minute collaterals in heart was established by ligation of the left anterior descending coronary artery，while the sham group was punctured without ligation.The gene expression of ICAM-1 and VCAM-1 in different areas and time points were detected by Real-time qPCR method.Results：Compared with the sham group，the gene expression of ICAM-1 in the infarct zone was significantly increased after ligation from 12 h to 24 h（P＜0.01）.And in the ischemic area，it was significantly increased after ligation 6 h and continued to ligation 24 h（P＜0.01）.And the VCAM-1mRNA expression in the infarct zonewas significantly increased after ligation 24 h（P＜0.01），whereas it was significantly increased in the ischemic area after ligation 1h and continued to ligation 24 h （P＜0.01）.Conclusion：The infiltration of inflammatory cell can occur in the acute phase of loosened and weakened minute collaterals and eventually lead to the damage of endothelial cell. Meanwhile，the inflammatory changes occur earlier in ischemic area than the infarct region.

Decrease of minute collaterals；Myocardial ischemia；ICAM-1；VCAM-1；Rat

R285.5

A

1004-745X（2015）05-0757-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.05.002

2015-03-02）

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2012B518601C）

△通信作者（電子郵箱：ymh9651@sina.com）