復(fù)方黑面神軟膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

蕭俊祺　彭偉文　李圣鵬　董旺鳳

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山市中醫(yī)院，廣東中山528400）

復(fù)方黑面神軟膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

蕭俊祺彭偉文李圣鵬董旺鳳

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山市中醫(yī)院，廣東中山528400）

目的：提高復(fù)方黑面神軟膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜鑒別法對復(fù)方黑面神軟膏成分中的當(dāng)黑面神、苦參、蛇床子、白鮮皮、地膚子進(jìn)行定性鑒別，用高效液相色譜法測定復(fù)方黑面神軟膏中表兒茶素和苦參中苦參堿的含量。結(jié)果：在選定的薄層色譜條件下，色譜斑點清晰，分離效果好，無干擾；表兒茶素含量在0.008 4～0.033 6 g/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=1.000，測定的平均回收率為97.7%，RSD為1.4%（n=6）；苦參堿含量在0.014 7～0.058 8 g/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.999，測定的平均回收率為97.6%，RSD為1.5%（n=6）。結(jié)論：建立的定性、定量方法較簡便、準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好。

復(fù)方黑面神軟膏；薄層色譜鑒別；高效液相色譜法

復(fù)方黑面神軟膏由黑面神、苦參、蛇床子、白鮮皮和五味子5味中藥組成，具有消炎止癢的功效，用于濕疹、蕁麻疹、皮膚瘙癢、過敏性皮炎、漆過敏、陰道炎、外陰瘙癢、帶狀皰疹等的治療。本研究的前期藥理實驗已證實，黑面神全株水提液具有顯著的抗炎止癢作用［1］、免疫抑制作用、抗皮膚Ⅰ型超敏反應(yīng)作用［2］，且黑面神全株水提物具有較好的體外抑菌作用，對小鼠慢性皮炎、濕疹具有很好的治療作用，驗證了其具有消炎止癢藥效。廣東的濕熱天氣適合各類病菌的生存繁衍，是多類皮膚病的高發(fā)區(qū)。然而，價格便宜、含中藥有效成分的皮膚外用藥種類仍較少。開發(fā)出安全有效、使用方便、價格便宜的中藥制劑有著迫切的市場需求。因此對黑面神進(jìn)行研究，既可以為黑面神屬植物化學(xué)成分的分類奠定基礎(chǔ)也可以為進(jìn)一步研究開發(fā)黑面神奠定基礎(chǔ)。若在已有基礎(chǔ)上對黑面神進(jìn)一步深入研究，有望開發(fā)出一種治療皮膚病的外用新藥。

1　材料與儀器

1.1儀器

Agilent 1100 series高效液相色譜儀；BS224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，d= 0.000 1 g）；jj200型電子天平（常熟市雙杰測試儀廠）；電子JA-1203天平（上海天平儀器廠，d= 0.001 g）；DK-8D電熱恒溫三孔水槽（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；UV-2550型紫外-可見分光光度儀（日本島津）；KQ3200E醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（鞏義市英峪華中儀器廠）；東方-A型直熱式電熱恒溫干燥箱（廣州東方電熱干燥設(shè)備廠）；Good see-Ⅰ薄層色譜攝影儀（上海科哲生化科技有限公司）。

1.2試藥

黑面神枝葉購自廣州至信藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)鑒定學(xué)教研室鑒定為大戟科黑面神屬植物Breynia fruticosa（L.）Hook.f.的干燥嫩枝葉。表兒茶素對照品（批號：110878-200102），苦參堿對照品（批號：0805-9804），苦參對照藥材（批號：121019-201407），蛇床子對照品（批號：110822-200305），蛇床子對照藥藥材（批號：121030-200405），白鮮皮對照藥材（批號：978-9301），地膚子對照藥材（批號：121148-200803）均為中國食品藥品檢定研究院提供。甲醇為色譜純，水為屈臣氏蒸餾水，磷酸為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1薄層色譜鑒別（TLC）

2.1.1黑面神［3］稱取復(fù)方黑面神軟膏5 g，加甲醇20 mL，放置1 h，濾過，濾液濃縮至5 mL，作為黑面神供試品溶液。另取黑面神對照藥材同法制成對照藥材溶液以及同法制成陰性樣品溶液。再取表兒茶素對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。吸取上述4種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（1∶2∶0.2∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以25%磷鉬酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性樣品無干擾。見圖1。

圖1　黑面神的TLC圖

2.1.2苦參稱取復(fù)方黑面神軟膏5 g，加濃氨試液0.3 mL，三氯甲烷25 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為苦參供試品溶液；另取苦參對照藥材同法制成對照藥材溶液，再取與供試品相應(yīng)量的苦參陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。最后取苦參對照品適量，加乙醇制成0.2 mg/mL的對照品溶液。照TLC（《中國藥典》2010年一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇-氨水（5.2∶0.7∶0.6）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以改良的碘化鉍鉀試液，熱風(fēng)吹干。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同的橙色斑點。見圖2。

圖2　苦參的TLC圖

2.1.3蛇床子［4］稱取復(fù)方黑面神軟膏3 g，加乙醇50 mL超聲處理5 min，放置，取上清液作為供試品溶液，另取蛇床子對照藥材4 g加水100 mL煮沸30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇5 mL同法制成對照藥材溶液，再取與供試品相應(yīng)量的蛇床子陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液，最后取蛇床子對照品溶液，加乙醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。照TLC法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述4種溶液各6 μL分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-正己烷（3∶3∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣品無干擾。見圖3。

2.1.4白鮮皮［5］稱取復(fù)方黑面神軟膏4 g，加甲醇30 mL超聲處理20 min，濾過，濾液加中性氧化鋁（100～200目）1.5 g振搖2 min濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取與供試品相應(yīng)量的白鮮皮陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液，另取白鮮皮對照藥材1 g加水40 mL煮沸并保持微沸30 min脫脂棉濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解作為對照藥材溶液。取上述3種溶液各5 μL分別點于同一用0.5%氫氧化鈉溶液制成的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-丙酮-濃氨水（20∶20∶1）的上層液為展開劑，展開，取出，晾干，以10%的硫酸乙醇溶液顯色，加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣品無干擾。見圖4。

圖3　蛇床子的TLC圖

圖4　白鮮皮的TLC圖

2.1.5地膚子［6］稱取復(fù)方黑面神軟膏5 g，加乙醇40 mL，鹽酸3 mL，加熱回流2 h靜置，傾出上清液，清液濃縮至約5 mL，加水20 mL，混勻，置分液漏斗中，加石油醚（60～90℃）振搖提取2次，每次約20 mL，合并醚液，蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取地膚子對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液，再取與供試品相應(yīng)量的地膚子陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。照TLC（《中國藥典》2010年版1部附錄ⅥB）試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-醋酸乙酯-氯仿（20∶8∶5）為展開劑，取出，晾干，噴以磷鉬酸試液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。見圖5。

圖5　地膚子的TLC圖

2.2含量測定

2.2.1色譜條件Boston Green ODS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）流動相甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫（程序見表1），流速1.0 mL/min?？鄥A檢測波長220 nm，表兒茶素檢測波長280 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL。在此條件下供試品溶液中苦參堿和表兒茶素的峰與相鄰峰能達(dá)到基線分離，其保留時間分別為10.056 min和48.333 min。理論塔板數(shù)按苦參堿峰計算應(yīng)不低于4 000，表兒茶素峰應(yīng)不低于3 600。

2.2.2溶液的制備

2.2.2.1對照品溶液的制備精密稱取表兒茶素對照品8.4 mg，加50%甲醇制成每1 mL含0.84 mg的溶液，搖勻，即得；精密稱取苦參堿對照品14.7 mg，加甲醇制成每1 mL含1.47 mg的溶液，搖勻，即得。

表1　梯度洗脫程序（%）

2.2.2.2供試品溶液的制備黑面神供試品溶液的制備：取本品約2 g，精密稱定，用20 mL 50%甲醇溶解轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，超聲20 min，50%甲醇定容，搖勻，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液?？鄥⒐┰嚻啡芤旱闹苽洌喝”酒芳s2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入濃氨試液1 mL充分浸潤膏體后，精密加入三氯甲烷20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率140 W，頻率42 kHz）30 min，放冷，離心，取上清液5 mL，減壓回收至干，殘渣用50%甲醇溶解轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2.3陰性溶液的制備按照處方量制備不含黑面神的陰性樣品和不含苦參的陰性樣品，按照制備供試品的制備方法制備陰性對照溶液，即得。

2.2.2.4HPLC測定分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計算表兒茶素和苦參堿的含量，色譜圖見圖6。陰性樣品溶液在與對照品色譜峰相同保留時間處無色譜峰出現(xiàn)。

2.2.3含量測定的方法學(xué)考察

2.2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密吸取“2.2.2”中苦參堿和表兒茶素對照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，4.0 mL置5 mL量瓶中，苦參堿用甲醇稀釋至刻度，表兒茶素用50%甲醇稀釋至刻度，在“2.2.1”條件下進(jìn)樣分析。以進(jìn)樣濃度（g/L）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程分別為：

苦參堿：

圖6　復(fù)方黑面神軟膏HPLC圖

Y=1 714.9X-3.835 5（r=0.999 9），

表兒茶素：

Y=13 346X+11.632（r=1.000 0）。

2.2.3.2精密度試驗精密吸取同一濃度的對照品溶液，在“2.2.1”條件下進(jìn)樣6次，測得苦參堿和表兒茶素含量，結(jié)果顯示RSD分別為0.57%和0.46%。表明實驗儀器精密度良好。

2.2.3.3穩(wěn)定性試驗取同一份供試品溶液，在室溫下放置0，2，4，8，12，24，48 h后分別進(jìn)樣，依法測定，結(jié)果見表2～3，軟膏中表兒茶素的平均含量為1.444 mg/盒，RSD為1.1%（n=7）；軟膏中苦參堿的平均含量為2.458 mg/盒，RSD為2.0%（n=7）。結(jié)果表明：供試品溶液在48 h內(nèi)測定結(jié)果基本穩(wěn)定。

表2　復(fù)方黑面神軟膏中表兒茶素穩(wěn)定性考察

表3　復(fù)方黑面神軟膏中苦參堿穩(wěn)定性考察

2.2.3.4重復(fù)性試驗取同一復(fù)方軟膏中的樣品約5 g，精密稱定，各6份，按正文“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依法測定，結(jié)果見表4～5。復(fù)方黑面神軟膏中表兒茶素的平均含量為1.433 mg/盒，RSD為2.5%（n=6）；軟膏中苦參堿的平均含量為4.433 mg/盒，RSD為1.0%（n=6）。結(jié)果表明該方法有良好的重現(xiàn)性。

表4　復(fù)方黑面神軟膏中表兒茶素重復(fù)性試驗

表5　復(fù)方黑面神軟膏中苦參堿重復(fù)性試驗

2.2.3.5加樣回收率試驗取已知含量的同一軟膏中的樣品約5 g，精密稱定，各6份，分兩組，分別精密加入表兒茶素對照品溶液0.350 mg和苦參堿對照品溶液0.600 mg，按正文“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依法測定，計算回收率，結(jié)果見表6～7。復(fù)方黑面神軟膏中表兒茶素平均回收率為97.7%，RSD為1.4%（n=6）；復(fù)方黑面神軟膏中苦參堿平均回收率為97.6%，RSD為1.5%（n=6）。結(jié)果表明表兒茶素和苦參堿的加樣回收試驗良好，符合定量分析要求。

2.2.3.6樣品含量測定取復(fù)方黑面神軟膏的樣品3批，按正文“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依法測定，計算供試品中表兒茶素和苦參堿的含量，結(jié)果見表8～9。

表6　復(fù)方黑面神軟膏中表兒茶素回收率試驗

表7　復(fù)方黑面神軟膏中苦參堿回收率試驗

表8　復(fù)方黑面神軟膏中表兒茶素的含量測定

3　討論

表9　復(fù)方黑面神軟膏中苦參堿的含量測定

黑面神軟膏中TLC法參考文獻(xiàn)較少，實驗難度較大。根據(jù)于健東等［7］TLC法鑒別兒茶中兒茶素和表兒茶素文獻(xiàn)，用正丁醇-醋酸-水（3∶2∶1）為展開劑，5%硫酸乙醇溶液為顯色劑105℃加熱顯色時，得到黑面神軟膏中表兒茶素的薄層色譜斑點不清晰且拖尾嚴(yán)重。后用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（70∶10∶20∶0.5）為展開劑，10%硫酸乙醇試液為顯色劑時，發(fā)現(xiàn)展開距離太短，斑點模糊。經(jīng)過多次試驗摸索最終確定使用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（70∶10∶30∶0.5）為展開劑，25%磷鉬酸乙醇溶液為顯色劑，在110℃加熱顯色，所得結(jié)果斑點清晰分離度好。

其余4味藥參考文獻(xiàn)較多，在參照相關(guān)文獻(xiàn)并進(jìn)行預(yù)實驗后鑒別效果理想，苦參、蛇床子、白鮮皮、地膚子均獲得很好的分離效果，薄層斑點清晰，且陰性無干擾。

在本次實驗中，所建立的HPLC，操作流程比較簡單，測量的結(jié)果比較準(zhǔn)確且靈敏度較高，從而產(chǎn)品的質(zhì)量可以得到穩(wěn)定的控制，也為復(fù)方黑面神軟膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制提供一定的依據(jù)。

［1］彭偉文，譚泳怡，梅全喜，等.黑面神水提物抗炎作用實驗研究［J］.今日藥學(xué)，2012，22（3）：145-147.

［2］彭偉文，戴衛(wèi)波，梅全喜，等.黑面神水提物抗皮膚I型超敏反應(yīng)的研究［J］.中國藥房，2013，24（19）：1747-1748.

［3］袁建平，呂艷，黃興富，等.金芥麥配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［J］.中國藥師，2012，15（5）：643-644.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：296.

［5］王春桃，符洪.白山片的薄層色譜鑒別方法研究［J］.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8（6）：1036-1037.

［6］林以慈，何昭斌，孫虹，等.歸芍止癢顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32（9）：2182-2184.

［7］于健東，王鋼力，高天兵，等.薄層色譜法鑒別兒茶中兒茶素和表兒茶素［J］.中國藥師，2000，3（1）：3.

Study on Quality Standard for Compound Breynia Fruticosa Ointment

Xiao Junqi，Peng Weiwen，Li Shengpeng，Dong Wangfeng（Zhongshan Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong Zhongshan 528400，China）

Objective：To improve the quality standard for compound Breynia fruticosa ointment.Methods：The Breynia fruticosa，Sophora flavescens，F(xiàn)ructus cnidii，Cortex dictamni and Fructus kochiae scopariae in the ointment were qualitatively identified by thin layer chromatography（TLC），while the contents of L-Epicatechin in Breynia fruticosa and matrine in Sophora flaves cens were determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.Results：Under the selected condition，the spots on TLC plates were clear without interference.The linear range of L-Epicatechin content was 0.008 4～0.033 6 g/L（r=1.000），while the mean recovery rate was 97.7%，with a RSD of 1.4%（n=6）.However，the linear range of matrine content was 0.014 7～0.058 8 g/L（r=0.999），while the mean recovery rate was 97.6%，with a RSD of 1.5%（n=6）.Conclusion：The developed methods for qualitative and quantitative determinations were simple，accurate，sensitive and reproducible.

Compound Breynia Fruticosa Ointment；Thin Layer Chromatography（TLC）；High Performance Liquid Chromatography（HPLC）

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.12.004

2015-00-00）

廣東省中山市科技局項目（20102A033）

蕭俊祺，男，藥師。研究方向：中藥制劑開發(fā)。E-mail：602045059@qq.com

彭偉文，男，主任中藥師，教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥制劑開發(fā)。通訊作者E-mail：pww200688@21cn.com