鄰香草醛縮胱氨酸雙Schiff堿的合成及其對粟酒裂殖酵母細胞生長代謝的熱動力學研究

蔣建宏，李 旭，谷惠文，肖圣雄，胡鈔粟，肖碧源，湯蔣瑩，王文軒，鄧媚瑩，李強國

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鄰香草醛縮胱氨酸雙Schiff堿的合成及其對粟酒裂殖酵母細胞生長代謝的熱動力學研究

蔣建宏1,2，李 旭1,2，谷惠文3,4，肖圣雄1,2，胡鈔粟1,2，肖碧源1,2，湯蔣瑩1,2，王文軒1,2，鄧媚瑩1,2，*李強國1,2

（1. 湘南學院化學與生命科學系，湖南，郴州 423043；2. 湘南稀貴金屬化合物及其應用湖南省重點實驗室，湖南，郴州423043；3. 湖南大學化學化工學院，湖南，長沙 410082；4. 化學生物傳感與計量學國家重點實驗室，湖南，長沙 410082)

用摩爾比為2:1的鄰香草醛(C8H8O3)與L-胱氨酸(C6H12N2O4S2)反應，合成了一種新的雙Schiff堿化合物--雙{2-[(3-巰基丙酸鈉)-2-亞胺基-甲基]-6-甲氧基-苯酚} (OVCS)。通過元素分析、紅外光譜、核磁共振等手段對其組成和結構進行了表征, 確定其化學式為Na2(C22H22N2O8S2)，采用TAM air微量熱儀測定了新合成的Schiff堿化合物(OVCS)在305.15 K時對粟酒裂殖酵母細胞作用的產熱曲線；根據(jù)產熱曲線計算了在OVCS作用下，粟酒裂殖酵母細胞生長代謝的最大發(fā)熱功率P、速率常數(shù)、傳代時間t、抑制率和半抑制濃度C等熱動力學參數(shù)。通過實驗可以發(fā)現(xiàn)隨著OVCS濃度的增加，粟酒裂殖酵母細胞的生長代謝速率常數(shù)、生長代謝的總熱效應Q、最大發(fā)熱功率P均減小，抑制率、達到生長代謝最大功率所需時間t、傳代時間t均增加等規(guī)律，半抑制濃度C為35.99 mg/L(或9.62×10-2mol/L)。實驗結果表明，OVCS對粟酒裂殖酵母細胞有抑制作用，且濃度越大，抑制作用越強。

鄰香草醛；L-胱氨酸；熱動力學參數(shù)；粟酒裂殖酵母細胞

一直以來，席夫堿抗菌活性方面都是人們關注和研究的重點[1]。而鄰香草醛具有較好的抗癌抗菌活性，且鄰香草醛席夫堿要比其它席夫堿（如水楊醛類席夫堿）抗菌抗癌活性更好[2-4]。此外，L-胱氨酸與L-硫氫化氨基丙酸相同, 它廣泛地應用于醫(yī)藥、食品、化妝品等方面[5]，具有調節(jié)人體營養(yǎng)平衡、促進新陳代謝、抗癌、抗病毒等功能。有關鄰香草醛席夫堿化合物抗癌抗菌的報道已有很多，但鄰香草醛與L-胱氨酸雙席夫堿化合物的合成與生物活性還未見報道。將兩種具有抗菌活性的物質結合起來，預測可以加強抗菌效果，對探究新的高效抗菌藥物具有重要意義。

用微量熱法已經(jīng)得到了很多關于藥物對微生物作用的相關信息[6-7]，用微量熱法研究雙{2-[(C3-巰基丙酸鈉)-2-亞胺基-甲基]-6-甲氧基-苯酚}（OVCS）對粟酒裂殖酵母細胞的作用還未見報道。本研究通過微量熱法來探究在305.15 K時OVCS對粟酒裂殖酵母細胞生長代謝的影響。通過對TAM air微量熱儀的數(shù)據(jù)進行一系列的處理和分析，進一步了解OVCS對細胞的作用機理，為探究鄰香草醛類席夫堿的藥理和探求高效低毒的抗菌抗癌藥物提供理論基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

實驗采用3116-2/3239TAM Air 八通道熱導式等溫微量熱儀(瑞典Thermometric AB公司)。描述熱導式熱量計量熱的基本方程是建立在Newton冷卻定律基礎之上的Tian方程(Eq. 1)[8]。

(d/d)t＝Cd()d＋Ck(?T) (1)

式中C?T項表示熱量積累，C為量熱計量熱皿的熱容，CkD(?T)項表示熱量的散失。由于量熱計的環(huán)境溫度恒定，當量熱皿外部區(qū)域為高熱容材料(如鋁散熱片)時，即C＞＞C，則幾乎沒有熱量在量熱皿積累，熱的傳導接近完全，此時Eq.1 變?yōu)椋?)(CkD) ＝?T→0。即在熱導式熱量計中溫升非常小，要求檢測系統(tǒng)有較高的靈敏度。

Bruker 400MHz Advance（瑞士Bruker公司），氘代DMSO做溶劑。

PE-2400元素分析儀（美國Perkin Elmer公司）。

1.1.2 材料

鄰香草醛[純度≥ 99.0%，北順(北京)化學科技有限公司]；L-胱氨酸(純度≥ 99.0%，天津市光復精細化工研究所)；其余試劑均為分析純；實驗用水為三重蒸餾水。

粟酒裂殖酵母細胞(Schizosaccharomyces pombe)由西班牙薩拉曼卡大學(University of Salamanca)Faustino Mollinedo 教授惠贈；YES培養(yǎng)基：5.000 g酵母粉＋30.000 g葡萄糖＋0.225 g亮氨酸＋0.225 g腺嘌呤＋0.225 g賴氨酸＋0.225 g尿嘧啶＋0.225 g組氨酸，溶于1000 mL三次蒸餾水中，于120 ℃高壓滅菌30 min后備用。

1.2 實驗過程

1.2.1 OVCS的合成

稱取0.4 g（10 mmol）氫氧化鈉溶于60 mL無水乙醇中，加入1.2015 g(5 mmol)白色粉末狀L-胱氨酸，攪拌溶解，轉入三頸燒瓶中，再將含有1.5215 g (10 mmol)鄰香草醛20 mL無水乙醇溶液逐滴加入到三頸燒瓶中，40 ℃攪拌加熱回流半小時，抽濾，再用無水甲醇溶解，抽濾提純，將抽濾后溶液進行蒸餾濃縮至出現(xiàn)結晶產物、產品抽濾，用無水乙醇洗滌數(shù)次后，真空干燥，得到黃色固體粉末。

1.2.2 粟酒裂殖酵母細胞及其在OVCS作用下生長代謝熱的測定

采用TAM Air熱導式等溫微量熱儀測定，實驗方法和操作步驟參見文獻[9]。

2 結果與討論

2.1 OVCS的性質、組成及結構

2.1.1 OVCS的性質及元素分析

OVCS為黃色固體粉末，在空氣中極不穩(wěn)定，極易水解，不溶于乙醇、乙醚，易溶于甲醇、乙氰、丙酮和二甲亞砜等溶劑。對其進行元素分析，數(shù)據(jù)表明：測量值與理論值基本一致（結果見表1）。

表1 OVCS的元素分析

2.1.2 OVCS的紅外光譜測定

從圖1的紅外光譜圖可知:-vanillin中出現(xiàn)的1632.95 cm-1處的C=O伸縮振動峰和L-cystine中出現(xiàn)的1590.24 cm-1處的-NH2基團的面內變形振動峰，在OVCS中均消失了，而出現(xiàn)了1636.68 cm-1處的C=N基團的特征吸收峰，發(fā)生了藍移，說明C=O鍵與-NH2發(fā)生了反應，形成了C = N鍵，確定生成了OVCS化合物。此外，在L-cystine中出現(xiàn)的675.00 cm-1處的C-S吸收峰在OVCS的673.42 cm-1處出現(xiàn)，在L-cystine中540.51 cm-1處出現(xiàn)的S-S伸縮振動峰在OVCS的541.14 cm-1處出現(xiàn)，且Ph-O的伸縮振動峰在-vanillin的1295.51 cm-1處和OVCS的1296.59 cm-1處出現(xiàn)，峰值幾乎相同，說明酚羥基沒有發(fā)生變化，而在OVCS中找不到羧基峰，羧基峰已經(jīng)改變，這些均與元素分析結論相同。

波長(cm-1)

2.1.3 OVCS的核磁譜圖

從圖2的核磁譜圖分析數(shù)據(jù)如下（結構式見圖3）：9.96 (s, 2H, 苯環(huán)上酚羥基-OH), 8.40 (s, 2H, 9號位上氫-N=CH), 6.81-6.99 (m, 4H, 苯環(huán)3、5號位上氫), 6.60 (d,= 6.4 Hz, 2H, 苯環(huán)4號位上氫), 6.00 (t,= 7.7 Hz, 2H, 11號位上氫=N-CH), 3.73 (dd,= 7.6, 4.4 Hz, 4H, 13號位上氫-CH2), 3.64 (s, 6H, 苯環(huán)上甲氧基-OCH3)，而羧基應該是以羧酸鹽-COO-形式存在[10]，不是-COOH，故核磁數(shù)據(jù)里面沒有對應的-COOH的質子信號。OVCS中共有22個H。

圖2 OVCS的核磁圖譜

2.1.4 OVCS的結構式

結合元素分析、紅外譜圖分析結果，可確定產物的結構式如下：

圖3 OVCS的結構式

2.2 生物量熱實驗結果與數(shù)據(jù)處理

2.2.1 粟酒裂殖酵母細胞的生長代謝熱曲線

在305.15 K時，保持其它條件不變的情況下，依次加入不同濃度的OVCS溶液到5 mL培養(yǎng)基中，來測定粟酒裂殖酵母細胞的正常生長代謝熱譜曲線，熱譜曲線如圖4所示。

a, 0 mg/L; b, 11.20 mg/L; c, 14.56 mg/L; d, 17.92 mg/L; e, 21.28 mg/L; f, 24.64 mg/L; g, 28.00 mg/L;h, 41.44 mg/L

2.2.2 粟酒裂殖酵母細胞的生長速率常數(shù)和傳代時間t

從圖4的生長代謝熱曲線可以看出，粟酒裂殖酵母細胞的的生長期包括停滯期、指數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰減期等階段。在粟酒裂殖酵母細胞的指數(shù)生長期[11]內，其數(shù)量增長的數(shù)學表達式為：

lnp＝lnp－kt＋(2)

式中，p為粟酒裂殖酵母細胞在時刻的熱輸出功率；為粟酒裂殖酵母細胞在某條件下指數(shù)生長期內的生長數(shù)速率常數(shù)，其值越大，細胞的生長代謝速率越快。將生長代謝熱曲線上指數(shù)生長期階段的曲線，用計算機進行線性擬合，可得到在不同OVCS濃度作用下粟酒裂殖酵母細胞的傳熱速率常數(shù)，又由公式t＝(2)/，可以算出粟酒裂殖酵母細胞在不同OVCS濃度作用下的傳代時間t(見表2)。

2.2.3 粟酒裂殖酵母細胞的抑制率和半抑制濃度C50

藥物對細菌生長代謝過程的抑制率的公式為：

＝(K－K)/K×100% (3)

式中K0為粟酒裂殖酵母細胞未受到藥物作用時生長速率常數(shù),K為粟酒裂殖酵母細胞受到濃度為的藥物作用時的生長速率常數(shù)。半抑制濃度C,即當抑制率為50%時所對應的藥物濃度。

由公式（3）可計算出粟酒裂殖酵母細胞在不同OVCS濃度作用下的抑制率和抑制率為50%時的生長速率常數(shù)(見表2)。再由與的關系，求出半抑制濃度C。半抑制濃度的大小表明了藥物對粟酒裂殖酵母細胞的抑制效果。C越小，藥物對粟酒裂殖酵母細胞抑制效果越好，抗菌活性越強。OVCS對粟酒裂殖酵母細胞的半抑制濃度為35.99 mg/L。

2.2.4 粟酒裂殖酵母細胞生長的最大產熱功率P，最大產熱功率時間t和總放熱量Q

從圖4的生長代謝產熱曲線可以讀出最大產熱功率P以及最大產熱功率時間t(見表2)，它們的大小實際上代表了粟酒裂殖酵母細胞生長獲得最大活性時的產熱功率以及獲得最大活性所需的時間?？偡艧崃?i>Q可直接通過對每條生長代謝產熱曲線的積分得到(見表2)，它的大小反映了不同OVCS濃度作用下，粟酒裂殖酵母細胞生長代謝的強弱情況，Q越小，說明該濃度下，OVCS對細胞生長代謝的抑制作用越強。

2.2.5 生長速率常數(shù)與濃度的關系

粟酒裂殖酵母細胞生長代謝速率常數(shù)對OVCS濃度進行Logistic曲線擬合, 得到如圖5所示關系。由圖可知，隨著OVCS濃度的增加，粟酒裂殖酵母細胞的生長速率常數(shù)呈S型曲線逐漸減小，表明OVCS對粟酒裂殖酵母細胞有抑制作用。得到曲線方程為：

[0 ≤(OVCS)≤ 41.44 mg/L]；相關系數(shù)＝0.99737。

表2 305.15 K時，粟酒裂殖酵母細胞在不同藥物濃度作用下生長期的熱動力學參數(shù)

(mg/L), 配合物濃度；(S?1)生長速率常數(shù)；(%)，抑制率；Q(w)，總放熱量；P(w)，最大發(fā)熱功率；t(S)，達到最大發(fā)熱功率所需時間；t(min)，傳代時間；線性匹配相關系數(shù)。

圖5 粟酒裂殖酵母細胞的生長速率常數(shù)k與OVCS濃度c的關系

2.2.6 抑制率與濃度的關系

OVCS對粟酒裂殖酵母細胞抑制率與它的濃度的進行Logistic曲線擬合，得到如圖6所示關系。由圖可知，隨著OVCS濃度的增加，OVCS對粟酒裂殖酵母細胞的抑制率呈S曲線增加，表示OVCS濃度越大，抑制作用越強。得到曲線方程為：

[0 ≤(OVCS)≤ 41.44 mg/L]；相關系數(shù)＝0.99737。

圖6 OVCS對粟酒裂殖酵母細胞的抑制率與它濃度的關系

Fig.6 Inhibitive rate () ofwith different concentrations of OVCS()

2.2.7 生長代謝的總熱效應total與濃度的關系

粟酒裂殖酵母細胞生長代謝的總熱效應Q對OVCS濃度進行Logistic曲線擬合，得到如圖7所示關系。由圖7可知，隨著OVCS濃度的增加，粟酒裂殖酵母細胞生長代謝的總熱效應Q呈S曲線逐漸減小，表明OVCS濃度越大，對粟酒裂殖酵母細胞的抑制作用就越大。得到曲線方程為：

[0 ≤(OVCS)≤ 41.44 mg/L]；相關系數(shù)＝0.99962。

圖7 粟酒裂殖酵母細胞生長代謝的總熱效應Q與OVCS濃度的關系

Fig.7 The total thermal effect (Q) ofwith different concentrations of OVCS()

2.2.8 最大發(fā)熱功率P與濃度的關系

粟酒裂殖酵母細胞的最大發(fā)熱功率P與OVCS濃度的關系，如圖8所示。由圖8可知，OVCS濃度的增加，使粟酒裂殖酵母細胞的最大發(fā)熱功率P呈下降趨勢，表明OVCS對粟酒裂殖酵母細胞有抑制作用。

圖8 粟酒裂殖酵母細胞的最大發(fā)熱功率Pmax與濃度c的關系

2.2.9 達到生長代謝最大功率所需時間t與濃度的關系

粟酒裂殖酵母細胞達到生長代謝最大功率所需時間t與OVCS濃度進行Logistic曲線擬合，如圖9所示關系。由圖9可知，隨著OVCS濃度的增加，粟酒裂殖酵母細胞達到生長代謝最大功率所需時間t呈S型曲線增大。得到曲線方程為：

[0 ≤(OVCS)≤ 41.44 mg/L]；相關系數(shù)＝0.99949。

圖9 粟酒裂殖酵母細胞生長代謝最大功率所需時間t與OVCS濃度的關系

Fig.9 The maximum power required to achieve the growth metabolism timetofwith different concentrations of OVCS()

2.2.10 傳代時間t與濃度的關系

粟酒裂殖酵母細胞傳代時間t與OVCS濃度進行Logistic曲線擬合，得到如圖10所示關系。由圖10可知，隨著OVCS濃度的增加，粟酒裂殖酵母細胞傳代時間t呈S曲線增加，表明OVCS濃度越大，抑制作用增強。得到曲線方程為：

[0 ≤(OVCS)≤ 41.44 mg/L]；相關系數(shù)＝0.99908。

圖10 粟酒裂殖酵母細胞傳代時間t與OVCS濃度的關系

Fig.10 The generation time (t)ofwith different concentrations of OVCS()

3 結論

用摩爾比為2:1的鄰香草醛與L-胱氨酸反應，合成了一種新的雙Schiff堿化合物——雙{2-[(3-巰基丙酸鈉)-2-亞胺基-甲基]-6-甲氧基-苯酚}（OVCS），其分子式為Na2(C22H22N2O8S2)。用TAM air微量熱儀探究了新合成的Schiff堿化合物(OVCS)在305.15 K時對粟酒裂殖酵母細胞生長代謝的影響。根據(jù)得到的產熱曲線進行的一系列分析，結果顯示：隨著OVCS濃度的增加，生長速率常數(shù)、總熱效應Q、最大發(fā)熱功率P均減小，而抑制率、最大功率的時間t、傳代時間t均增加。

實驗表明：在所研究的濃度范圍內，OVCS對粟酒裂殖酵母細胞的生長都起抑制作用，且隨著濃度的增大，其抑制作用越強，而抑制作用的機理還有待進一步探究。

參考文獻：

[1] 蔣建宏, 李旭, 肖圣雄, 等. 2-{[4-氨基-5-（3,4,5-三甲氧基-芐基）-嘧啶-2-亞胺基]-甲基}-6-甲氧基-苯酚與酵母細胞和牛血清白蛋白的相互作用[J].高等學?；瘜W學報, 2014, 35 : 831-838.

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Synthesis and thermokinetic study on the S.growth metabolism of a novel bis-Shciff base derived from-vanillin and L-cystine

JIANG Jian-hong1,2, LI Xu1,2, GU Hui-wen3,4, XIAO Sheng-xiong1,2, HU Chao-su1,2, XIAO Bi-yuan1,2,TANG Jiang-ying1,2,WANG Wen-xuan1,2, DENG Mei-ying1,2,*LI Qiang-guo1,2

(1.Department of Chemistry and Life Science, Xiangnan University, Chenzhou, Hunan 423043, China;2. Hunan Provincial Key Laboratory of Xiangnan Rare-Precious Metals Compounds and Applications,Chenzhou,Hunan 423043,China;3.School of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan University, Changsha, Hunan 410082, China; 4. State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Chemistry and Chemical Engineering, Changsha, Hunan 410082, China)

A novel Schiff base named Bis{2-[(3-mercapto propionic acid sodium-2-ylimino)-methyl]-6- methoxy-phenol}(abbreviated as OVCS) was synthesized using 2:1 molar ratio of-vanillin (C8H8O3) and L-cystine (C6H12N2O4S2). Elemental analysis, IR and NMR spectroscopy were employed to characterize the composition and structure of OVCS. The analytical results show that the molecular formula of the Schiff base is Na2(C22H22N2O8S2). The thermokinetic properties of the action of OVCS on the growth metabolism ofwere investigated by a TAM air isothermal calorimetry at 305.15 K. Some thermokinetic parameters of growth metabolism of, such as the maximum heating power (P), growth rate constant (), generation time (t), inhibition rate () and half inhibitory concentration (C) were calculated. Experimental results indicate that the values of, QandPofdecrease, while the value of,tandtofincreased with the increase of the concentrations of OVCS. TheCvalue of OVCS was found to be 35.99 mg/L (or 9.62×10-2mol/L). From this work, one can reach a conclusion that OVCS possesses inhibitory effect on the growth metabolism of, and the greater the concentration, the stronger the inhibition.

-vanillin; L-cystine; thermokinetic property;cell

1674-8085(2015)06-0029-07

O641；O633.12

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2015.06.007

2015-06-06；修改日期：2015-09-08

國家自然科學基金項目(21273190)；湖南省科技計劃項目(2013FJ3033, 2012TP4021-6, 2010FJ3053)；湘南學院科研基金項目(2013YJ36；2014XJ52)；湘南學院大學生研究性學習和創(chuàng)新性實驗計劃項目(校發(fā)[2013]15號)

蔣建宏(1984-)，男，湖南邵陽人，助教，碩士，主要從事生物熱化學研究(Email:jiangjianhong927@163.com);

李 旭(1980-)，男，湖南郴州人，實驗師，碩士，主要從事熱化學研究(Email: 51571435@163.com );

谷惠文(1987-)，男，湖南衡陽人，博士生，主要從事分析化學研究(Email: gruyclewee@hnu.edu.cn );

肖圣雄(1975-)，男，湖南郴州人，副教授，碩士，主要從事熱化學研究(Email:54xsx@163.com);

胡鈔粟(1991-)，女，湖南益陽人，湘南學院化學與生命科學系應用化學專業(yè)2011級本科生(E-mail:huchaosu@163.com);

肖碧源(1994-)，女，湖南邵陽人，湘南學院化學與生命科學系應用化學專業(yè)2012級本科生(E-mail:1586769784@qq.com);

湯蔣瑩(1995-)，女，浙江寧波人，湘南學院化學與生命科學系應用化學專業(yè)2013級本科生(E-mail:615874992@qq.com);

王文軒(1995-)，女，湖南瀏陽人，湘南學院化學與生命科學系藥學專業(yè)2013級本科生(E-mail:1352645558@qq.com);

鄧媚瑩(1995-)，女，湖南湘潭人，湘南學院化學與生命科學系藥學專業(yè)2013級本科生(E-mail 1416146668@qq.com);

*李強國(1963-)，男，湖南郴州人，二級教授，主要從事生物熱化學研究(Email:liqiangguo@163.com).