閆媛媛,胡文忠,姜愛(ài)麗,鄒 宇,穆師洋,宋春璐
(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連116600)
茉莉酸甲酯和乙烯利處理對(duì)鮮切富士蘋(píng)果抗氧化酶活力和苯丙烷代謝的影響
閆媛媛,胡文忠*,姜愛(ài)麗,鄒宇,穆師洋,宋春璐
(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連116600)
為研究外源信號(hào)分子茉莉酸甲酯(MeJA)和乙烯(Eth)對(duì)鮮切果蔬抗氧化酶活力和苯丙烷代謝的影響,以鮮切富士蘋(píng)果為實(shí)驗(yàn)材料,利用MeJA和乙烯利浸泡處理,在10℃下貯藏,分析貯藏期間抗氧化酶類(lèi)多酚氧化酶(PPO)、過(guò)氧化物酶(POD)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的變化。結(jié)果表明:與空白對(duì)照相比,MeJA和乙烯利可以顯著提高鮮切富士蘋(píng)果PPO和POD活性(p<0.05),降低APX活性下降速率。兩種處理都可以提高PAL的活性,乙烯利對(duì)增強(qiáng)PAL活性效果更顯著(p<0.05)。兩種外源信號(hào)分子可以提高鮮切蘋(píng)果的抗氧化能力及苯丙烷代謝能力,啟動(dòng)鮮切蘋(píng)果的防御反應(yīng),提高果實(shí)抗性。
鮮切蘋(píng)果,乙烯利,茉莉酸甲酯,抗氧化能力,苯丙烷代謝
鮮切果蔬是一種新鮮方便、營(yíng)養(yǎng)豐富、100%可食用產(chǎn)品,在國(guó)內(nèi)外越來(lái)越受到消費(fèi)者歡迎。然而切割過(guò)程產(chǎn)生的機(jī)械傷害破壞了新鮮果蔬的天然保護(hù)層,影響了鮮切果蔬的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及衛(wèi)生質(zhì)量。研究表明,機(jī)械傷害等脅迫條件可誘導(dǎo)活性氧分子大量積累對(duì)植物造成氧化傷害[1],此時(shí),植物抗氧化防御系統(tǒng)中的抗氧化物酶類(lèi)如抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、過(guò)氧化物酶(PPO)、多酚氧化酶(POD)等可以通過(guò)清除活性氧分子,從而有效誘導(dǎo)植物的適應(yīng)性響應(yīng)機(jī)制反應(yīng)。同時(shí),苯丙烷代謝系統(tǒng)作為生成酚類(lèi)物質(zhì)的主要次生代謝途徑[2],在植物抗逆境脅迫和適應(yīng)性防御反應(yīng)中起著重要作用。鮮切果蔬的組織細(xì)胞感受到切割傷害刺激后,能夠誘發(fā)產(chǎn)生傳遞信息和引起細(xì)胞反應(yīng)化學(xué)物質(zhì)茉莉酸(JA)和乙烯(Eth)含量顯著增加,其作為感知受傷脅迫的信號(hào)分子,進(jìn)而誘導(dǎo)一系列與防御反應(yīng)有關(guān)的基因表達(dá),如抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵酶PPO、POD、APX,苯丙烷代謝關(guān)鍵酶PAL等防御蛋白酶活性[3],導(dǎo)致防御反應(yīng)過(guò)程中次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累,促使果蔬形成防御結(jié)構(gòu),提高果蔬抗性[4]。近年來(lái),隨著鮮切果蔬的迅速發(fā)展,對(duì)鮮切果蔬的需求量和種類(lèi)日益增加,果蔬經(jīng)鮮切加工后所造成的傷害刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其適應(yīng)性響應(yīng)的研究已引起采后果蔬生物學(xué)界的廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用MeJA和乙烯利處理鮮切富士蘋(píng)果,為探明MeJA和乙烯作為抗脅迫信號(hào)分子對(duì)鮮切蘋(píng)果抗氧化酶活性及苯丙烷代謝產(chǎn)生的影響,以期為MeJA和乙烯利在鮮切水果保鮮方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1.1材料與儀器
富士蘋(píng)果購(gòu)于大連開(kāi)發(fā)區(qū)樂(lè)購(gòu)超市;MeJA日本東京化成工業(yè)柱式會(huì)社;乙烯利美國(guó)Solarbio公司;聚乙烯吡咯烷酮、過(guò)氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚、硼酸、四硼酸鈉、β-硫基乙醇、L-苯丙氨酸、抗壞血酸次氯酸鈉國(guó)產(chǎn)分析純。
電子天平梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;DK-S26型電熱恒溫水浴鍋上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;BR4i型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)法國(guó)Jouan;Lambda-25型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)美國(guó)PE;T-25型勻漿器德國(guó)IKA;UV-2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)尤尼柯上海儀器有限公司;PCU-CS200ME型組合式氣調(diào)冷庫(kù)大連冷凍機(jī)股份有限公司。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1原料預(yù)處理選用色澤一致、無(wú)病蟲(chóng)害和無(wú)機(jī)械損傷的富士蘋(píng)果為實(shí)驗(yàn)材料,購(gòu)買(mǎi)當(dāng)天貯藏于實(shí)驗(yàn)室5℃的冷庫(kù)中備用。先用200 μL/L次氯酸鈉溶液清洗2 min,晾干。在10℃冷庫(kù)中用次氯酸鈉溶液處理過(guò)的不銹鋼刀片將蘋(píng)果削皮去核,切成直徑10 mm,厚度為3 mm的圓片。切好后的蘋(píng)果分別置于10 μmol/L茉莉酸甲酯(10%的乙醇溶液配制)、10 μL/L乙烯利(10%的乙醇溶液配制)、10%乙醇空白溶液中,浸泡30 min,瀝干后各樣品分裝在經(jīng)過(guò)紫外線殺菌的PE塑料淺盤(pán)中,25~30 μm聚乙烯保鮮膜密封包裝。將處理好的樣品置于10℃冷庫(kù)貯藏,待測(cè),每處理樣品5 g,重復(fù)三次。
1.2.2PPO活性的測(cè)定
1.2.2.1酶提取液的制備取5 g樣品,加0.1 g聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)于20 mL經(jīng)4℃預(yù)冷的0.2 mol/L磷酸提取緩沖液(pH=6.4)中,冰浴研磨勻漿,并于4℃、12000 r/min離心30 min,取上清液為酶的粗提液,低溫保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2.2PPO活性測(cè)定參照Galeazzi等[5]的方法并加以改進(jìn),將0.5 mL粗酶提取液加入3 mL 0.5 mol/L的鄰苯二酚溶液(用0.2 mol/L pH6.4的磷酸鹽緩沖液配成)中,加蓋迅速混勻,5 s后開(kāi)始掃描并記錄10 s內(nèi)398 nm處吸光度值變化,酶活性以ΔOD398nm·min-1·g-1FW表示,重復(fù)3次。
1.2.3POD活性的測(cè)定酶提取液與PPO相同。POD活性測(cè)定:參照J(rèn)iang等[6]的方法并加以改進(jìn),將2.5 mL 0.025 mol/L愈創(chuàng)木酚加入0.2 mL粗酶液,用0.2 mL 0.25 mol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)。反應(yīng)開(kāi)始15 s后記錄反應(yīng)體系每隔30 s的290 nm下吸光值的變化,酶單位以ΔOD290nm·min-1·g-1FW表示,重復(fù)3次。
1.2.4APX活性的測(cè)定
1.2.4.1酶提取液稱(chēng)取5.0 g樣品置于經(jīng)預(yù)冷的研缽里,加入20 mL經(jīng)4℃預(yù)冷的提取緩沖液,冰浴研磨勻漿后,于4℃、12000 r/min離心30 min,收集上清液即為粗酶提取液,低溫保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.4.2APX活性的測(cè)定參照曹建康等[7]的方法并加以修改,APX反應(yīng)體系由2 mL 100 mmol/L磷酸緩沖液(pH7.5,含1 mmol/L EDTA),0.8 mL 3 mmol/L抗壞血酸,100 μL粗酶液和0.5 mL 0.5 mmol/L H2O2組成,最后加入H2O2啟動(dòng)酶促反應(yīng)。從啟動(dòng)后15 s開(kāi)始記錄反應(yīng)體系在290 nm的吸光度值,酶單位以ΔOD290nm·min-1·g-1FW表示,重復(fù)測(cè)定3次。
1.2.5PAL活性的測(cè)定
1.2.5.1酶提取液稱(chēng)取5.0 g樣品置于經(jīng)預(yù)冷的研缽里,加入20 mL經(jīng)4℃預(yù)冷的pH8.8硼酸-硼砂提取緩沖液,冰浴研磨勻漿后,于4℃、12000 r/min離心30 min,收集上清液即為酶提取液,低溫保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.5.2PAL活性的測(cè)定參照曹建康等[7]的方法并加以修改,取1支試管,加入3 mL 50 mmol/L pH8.8硼酸-硼砂緩沖液和0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸溶液,在37℃預(yù)保溫10 min,再加入0.1 mL酶液,混合后,迅速測(cè)定該混合液在290 nm處的吸光值作為反應(yīng)的初始值(OD0)。然后將反應(yīng)管置于37℃保溫60 min。保溫結(jié)束時(shí),再立即測(cè)定反應(yīng)混合液在290 nm處的吸光值作為反應(yīng)的終止值(OD1)。均以蒸餾水作為參照進(jìn)行調(diào)零。根據(jù)保溫前后樣品管溶液吸光值的變化計(jì)算PAL活性,重復(fù)3次。
1.3數(shù)據(jù)分析
采用Excel 2007統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果取三次測(cè)定的平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差,以SPSS進(jìn)行顯著性分析。
2.1貯藏期間鮮切富士蘋(píng)果抗氧化酶類(lèi)的變化
2.1.1貯藏期間鮮切富士蘋(píng)果PPO活性的變化多酚氧化酶(PPO)是一種以銅為輔基的酶,能催化多種簡(jiǎn)單酚類(lèi)物質(zhì)氧化形成具有抗菌性的醌類(lèi)物質(zhì),同時(shí)也是末端氧化酶的主要部分[8]。當(dāng)植物組織受到機(jī)械傷害時(shí),PPO可以迅速感應(yīng),活性顯著升高,促進(jìn)木質(zhì)素以及抗菌醌類(lèi)物質(zhì)的形成,對(duì)植物組織起到一定的防御保護(hù)作用。由圖1可知,貯藏期間鮮切蘋(píng)果的PPO活性變化呈雙峰值趨勢(shì),分別在第2 d和第6 d達(dá)到最大值。在貯藏第2 d時(shí),MeJA處理組和乙烯利處理組PPO活性均顯著高于空白對(duì)照組(p<0.05),可能是因?yàn)樵谫A藏期間切割傷害誘導(dǎo)了蘋(píng)果組織內(nèi)部存在的PPO,使其活性可以在短時(shí)間迅速上升[9]。在貯藏第6 d時(shí),PPO活性達(dá)到最高值,MeJA處理組和乙烯利處理組PPO的活性顯著高于空白對(duì)照組(p<0.05),由此可見(jiàn)MeJA和乙烯利可以有效提高PPO的活性,且兩者效果一致[10]。在貯藏后期,三組處理樣品PPO活性幾乎沒(méi)有差異,說(shuō)明MeJA和乙烯利處理對(duì)鮮切蘋(píng)果抗性盡管有所增加,但由于PPO也是導(dǎo)致褐變的關(guān)鍵酶,褐變也隨之增加[11]。
圖1 茉莉酸甲酯和乙烯利處理對(duì)鮮切蘋(píng)果PPO活性的影響Fig.1 Effect of MeJA and ethylene treatments on PPO activity of fresh-cut apple
2.1.2貯藏期間鮮切富士蘋(píng)果POD活性的變化POD是果蔬體內(nèi)普遍存在的一種重要的氧化還原酶,催化過(guò)氧化氫、氧化酚類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生醌類(lèi)化合物,且與CAT、SOD協(xié)同作用,清除過(guò)剩的自由基,使體內(nèi)自由基維持正常的動(dòng)態(tài)水平,一般將其視為鮮切果蔬抗氧化代謝的重要指標(biāo)[12]。由圖2可知,POD活性變化呈先升高后下降的趨勢(shì)。在貯藏初期,三組處理樣品的POD活性沒(méi)有明顯差異,在貯藏第4 d時(shí),MeJA處理組和乙烯利處理組的POD活性開(kāi)始高于空白對(duì)照組,在貯藏第6 d時(shí),差異顯著(p<0.05),說(shuō)明MeJA和乙烯利對(duì)POD的活性有提高作用。在貯藏第8 d時(shí),空白對(duì)照組的POD活性顯著高于MeJA處理組和乙烯利處理組(p<0.05),可能是因?yàn)镻OD除了作為H2O2的清除劑之外,在特定的情況下,也能與NADH等反應(yīng)產(chǎn)生O2-/H2O2[13]。POD可將可溶性酚類(lèi)物質(zhì)氧化成醌類(lèi)物質(zhì)的同時(shí)分解H2O2,減輕氧化脅迫,并抑制H2O2作為第二信使對(duì)其他代謝途徑的影響[14]。在貯藏期MeJA和乙烯利處理能夠有效提高POD活性,這對(duì)于及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)部的自由基,提高果蔬適應(yīng)性防御能力非常重要[15]。
圖2 茉莉酸甲酯和乙烯利處理對(duì)鮮切蘋(píng)果POD活性的影響Fig.2 Effect of MeJA and ethylene treatments on POD activity of fresh-cut apple
2.1.3貯藏期間鮮切富士蘋(píng)果APX活性的變化APX催化抗壞血酸氧化為單脫氫抗壞血酸,同時(shí)將過(guò)氧化氫(H2O2)還原成H2O,達(dá)到清除過(guò)氧化氫自由基的目的[16]。蘋(píng)果經(jīng)切割處理后,抗壞血酸聚集到傷口附近阻止黑色素聚集,降低MDA含量[17],APX作為以抗壞血酸為電子供體的轉(zhuǎn)移性強(qiáng)的過(guò)氧化物酶,通過(guò)催化抗壞血酸與H2O2發(fā)生氧化還原反應(yīng),清除植物體內(nèi)的活性氧H2O2,提高果蔬的抗氧化能力[18]。如圖3所示,鮮切蘋(píng)果在貯藏期間APX酶的活性呈先急劇下降后保持平緩的趨勢(shì)。在貯藏0 d時(shí),MeJA處理組和乙烯利處理組APX活性均極顯著低于空白對(duì)照組(p<0.01),可能是因?yàn)闄C(jī)械傷害導(dǎo)致APX活性的急劇下降。在貯藏中期,MeJA處理組和乙烯利處理組的APX活性有所上升,并在第6 d時(shí)顯著高于空白對(duì)照組(p<0.05),說(shuō)明二者均可以提高APX活性,這可以有效提高果實(shí)組織內(nèi)的過(guò)氧化氫自由基清除能力,提高鮮切蘋(píng)果抗性具有重要意義,本研究結(jié)果與鄭亞男等[19]研究結(jié)果一致。
圖3 茉莉酸甲酯和乙烯利處理對(duì)鮮切蘋(píng)果APX活性的影響Fig.3 Effect of MeJA and ethylene treatments on APX activity of fresh-cut apple
圖4 茉莉酸甲酯和乙烯利處理對(duì)鮮切蘋(píng)果PAL活性的影響Fig.4 Effect of MeJA and ethylene treatments on PAL activity of fresh-cut apple
2.2貯藏期間鮮切富士蘋(píng)果PAL活性的變化
PAL催化L-苯丙氨酸脫氨生成肉桂酸和氨,是苯丙氨酸代謝途徑的限速酶,參與了多種激發(fā)子誘導(dǎo)的抗性[20],增強(qiáng)了鮮切果蔬對(duì)機(jī)械傷害的防御能力。由圖4可知,PAL活性的變化呈先上升后下降的趨勢(shì)。在貯藏前期,MeJA處理組和乙烯利處理組的樣品PAL的活性顯著高于空白對(duì)照組(p<0.05),尤其是在第4 d和第6 d時(shí),MeJA和乙烯利處理明顯提高了PAL酶的活性。然而在貯藏后期PAL的活性有所下降,且乙烯利處理組和空白對(duì)照組的PAL活性沒(méi)有明顯差異,可能是因?yàn)楹笃谫A藏時(shí)間過(guò)長(zhǎng),蘋(píng)果組織內(nèi)部苯丙烷代謝趨于平衡穩(wěn)定狀態(tài),MeJA對(duì)PAL活性的影響效果不顯著(p>0.05)。但是總體而言,在貯藏初中期,MeJA和乙烯利處理對(duì)于PAL酶的活性有顯著提高作用,可以提高蘋(píng)果內(nèi)部植保素和木質(zhì)素的生成速率,來(lái)修復(fù)機(jī)械脅迫對(duì)細(xì)胞的傷害。
切割處理對(duì)果蔬產(chǎn)生的機(jī)械傷害會(huì)造成果蔬組織的破裂,果蔬原有的保護(hù)系統(tǒng)遭受破壞,使酶和底物的區(qū)域化被打破,酶與底物直接接觸發(fā)生各種生理生化反應(yīng),導(dǎo)致果蔬組織褐變、細(xì)胞膜脂過(guò)氧化和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失等[21]。MeJA和乙烯可作為受傷脅迫信號(hào)分子,啟動(dòng)果蔬防御反應(yīng)機(jī)制,達(dá)到維持組織內(nèi)部代謝平衡,保持果蔬品質(zhì)的效果。
鮮切果蔬的抗氧化能力與苯丙氨酸代謝可作為果蔬受到機(jī)械傷害適應(yīng)性響應(yīng)的重要指標(biāo)。PPO、POD、APX均是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶,與CAT、SOD協(xié)同作用分解組織內(nèi)部的簡(jiǎn)單的酚類(lèi)物質(zhì),清除過(guò)剩的自由基,使體內(nèi)自由基維持在一個(gè)較低的水平,提高果蔬的抗氧化能力[22],其中CAT與APX等酶在調(diào)節(jié)H2O2含量變化的過(guò)程中所起到的作用不同,APX需要還原性底物,并對(duì)H2O2具有較高的親和力[23]。本研究發(fā)現(xiàn),MeJA和乙烯利可以提高PPO活性高峰的出現(xiàn),提高PPO的活性,在短時(shí)間內(nèi)可以促進(jìn)木質(zhì)素的形成,盡管可以提高鮮切蘋(píng)果的抗性,褐變也隨之增加。MeJA和乙烯利處理組POD、APX的活性顯著高于空白對(duì)照組,鮮切蘋(píng)果組織內(nèi)的活性氧得到及時(shí)清除,有效提高果實(shí)抗氧化能力。苯丙氨酸代謝活性增強(qiáng)是果蔬誘導(dǎo)抗性后的典型反應(yīng),PAL是苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶,參與了多種激發(fā)子誘導(dǎo)的抗性,其活性的增強(qiáng)可以有效增強(qiáng)植物對(duì)病原侵染抵抗能力,與PPO協(xié)同作用代謝產(chǎn)物木質(zhì)素可作為植物的防御屏障[24]。本研究結(jié)果表明,MeJA和乙烯利處理組與空白對(duì)照組比較可以顯著提高PAL活性,并且MeJA處理組PAL活性高于乙烯利處理組,說(shuō)明MeJA能夠更加有效的提高PAL活性,提高組織對(duì)機(jī)械傷害的適應(yīng)性。
本研究得到的結(jié)果表明,MeJA和乙烯利對(duì)鮮切蘋(píng)果的PPO、POD、APX活性的提高均有一定作用,且MeJA和乙烯利作用效果差異不顯著。對(duì)于PAL而言,MeJA和乙烯利處理導(dǎo)致其活性顯著升高,且MeJA處理比乙烯利處理效果更加顯著。綜上所述,MeJA和乙烯利可以通過(guò)增強(qiáng)鮮切蘋(píng)果的抗氧化和苯丙烷代謝的能力,增強(qiáng)果實(shí)組織對(duì)機(jī)械傷害的適應(yīng)性。
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Effect of antioxidant enzyme activity and phenylpropanoid metabolism to jasmonic acid methyl ester(MeJA)of and ethephon treatments for fresh-cut apple
YAN Yuan-yuan,HU Wen-zhong*,JIANG Ai-li,ZOU Yu,MU Shi-yang,SONG Chun-lu
(College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China)
In order to determine the effect of two exogenous signal molecules—jasmonic acid methyl ester(MeJA)and ethephon onantioxidant enzyme activity and phenylpropanoid metabolism for fresh-cut fruit and vegetables,fresh-cut apple was taken as material,and treated with exogenous ethephon and MeJA,stored at 10℃. Antioxidant system enzymes PPO,POD,APX and phenylpropanes metabolic system enzymes PAL were analyzed.The results indicated that MeJA and ethylenecould effectively improved fresh-cut Fuji apple PPO and POD activity,and slowed down the decline rate of APX activity.The effects of exogenous ethylene and MeJA on PPO、POD and APX were similar.MeJA and ethephon could effectively improve PAL activity,and the effect of ethylene was more obvious.The two signal molecules could improve the ability of antioxidant system and phenylpropanes metabolic system,and started defense reaction of fresh-cut apple and increased fruit resistance.
fresh-cut apple;ethephon;jasmonic acid methyl ester;antioxidant enzyme activity;phenylpropanoid metabolism
TS201.1
A
1002-0306(2015)16-0324-05
10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.057
2014-10-30
閆媛媛(1990-),女,在讀碩士研究生,研究方向:食品加工與質(zhì)量安全控制,E-mail:yanyuanyuansw@163.com。
胡文忠(1959-),男,教授,研究方向:食品加工與質(zhì)量安全控制,E-mail:hwz@dlnu.edu.cn。
國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD38B05);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31340038,31172009,31471923)。