響應(yīng)面分析法優(yōu)化蝦蛄鹽溶蛋白快速提取工藝

周景麗，張坤生，任云霞

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

響應(yīng)面分析法優(yōu)化蝦蛄鹽溶蛋白快速提取工藝

周景麗，張坤生*，任云霞

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

為了縮短蝦蛄鹽溶蛋白的提取時(shí)間并得到最佳提取條件，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選出最佳輔助提取方式，并應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化蝦蛄鹽溶蛋白的提取條件，確定最佳提取條件為：磁力攪拌時(shí)間為24 min，NaCl濃度為0.11 mol/L，提取液pH為6.36，料液比為1∶3 g/mL，此時(shí)蝦蛄鹽溶蛋白含量達(dá)22.46 mg/g，與預(yù)測值（22.71 mg/g）相差0.25 mg/g。

蝦蛄，鹽溶蛋白，快速提取，響應(yīng)面法

蝦蛄（Oratosquilla oratoria）屬節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、口足目、蝦蛄科，俗稱“螳螂蝦”“琵琶蝦”“蝦爬子”等［1］。蝦蛄肉質(zhì)鮮嫩，分布廣泛，營養(yǎng)豐富而受消費(fèi)者喜愛［2］。目前對蝦蛄中生物活性物質(zhì)提取的研究主要集中在工藝提?。?-4］及活性成分的提?。?-6］。

Motoyama［7］及蔡秋鳳［8］的研究表明，與其他蝦類相比，口蝦蛄肌肉粗提物中的肌肉蛋白極易發(fā)生分解，所以對蝦蛄中鹽溶蛋白的快速提取的研究顯得尤為重要。占劍峰等［9］研究了對蝦鹽溶蛋白的提取條件對于熱誘導(dǎo)凝膠特性的研究影響，但并未有效的縮短蝦蛄鹽溶蛋白的提取時(shí)間。王偉等［10］采用響應(yīng)面法優(yōu)化了鴨胸肉鹽溶蛋白證明了響應(yīng)面法的有效性。響應(yīng)面法優(yōu)化蝦蛄鹽溶蛋白的研究還未曾報(bào)道。

本文通過對蝦蛄鹽溶蛋白提取過程中影響因素的分析，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取蝦蛄鹽溶蛋白提取的最佳輔助提取方式，并應(yīng)用響應(yīng)面分析法對蝦蛄鹽溶蛋白的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高蝦蛄鹽溶蛋白的含量，得到最佳的鹽溶蛋白提取工藝，為蝦蛄的進(jìn)一步綜合利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蝦蛄購買于天津市金元寶濱海農(nóng)產(chǎn)品交易市場；考馬斯亮藍(lán)G250天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；牛血清白蛋白（BSA） Sigma試劑公司；無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；氯化鈉、85%磷酸天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；化學(xué)試劑均為分析純。

FA2004A型電子天平上海精天儀器有限公司；IKAT10型高速組織勻漿機(jī)德國IKA公司；Avanti J-E型高效離心機(jī)美國貝克曼庫爾特有限公司；UV-7504型紫外可見分光光度計(jì)上海欣茂儀器有限公司；EL20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)梅特勒-托利多儀器有限公司；磁力攪拌器天津市歐諾儀器儀表有限公司；JY92型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)浙江寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；MAS-1型微波萃取儀上海新儀微波化學(xué)科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1預(yù)處理及蝦蛄肉鹽溶蛋白提取將購買的鮮活蝦蛄分裝于PP750mL塑料餐盒（長約17.5 cm，寬約12 cm，高約5.5 cm）中，每盒分裝約0.5 kg，-18℃以下凍藏，使用前于4℃下解凍。參考SUN［11］和邱春強(qiáng)［12］的方法，改進(jìn)如下：將解凍后的蝦蛄去頭，去甲殼，去凈腸腺及蝦黃，將蝦蛄肉與一定濃度的鹽溶液按一定比例混合后，在10000 r/min的轉(zhuǎn)速下用高速組織勻漿機(jī)攪成肉漿狀，并采用適當(dāng)?shù)妮o助提取方法提取適當(dāng)時(shí)間后，在4℃10000 r/min下離心10 min，收集上清液，該上清液即為鹽溶蛋白，用去離子水稀釋上清液后測定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.2蝦蛄鹽溶蛋白的測定參考曹建康［13］的方法進(jìn)行蝦蛄鹽溶蛋白含量的測定。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)蝦蛄鹽溶蛋白提取過程中，影響提取率的主要因素為輔助提取方式、提取時(shí)間、NaCl濃度、提取液pH、料液比。

取蝦蛄肉5 g，加入4倍體積的pH為6.5的磷酸鹽緩沖液，并要求NaCl濃度0.10 mol/L。在10000 r/min的轉(zhuǎn)速下均質(zhì)30 s，采用水?。囟葹?0℃）、磁力攪拌（攪拌速度600 r/min，攪拌溫度4℃）、超聲波（功率設(shè)定為20 W，超聲時(shí)間10 s，間隙時(shí)間10 s），微波（功率設(shè)定為20 W）4種方法輔助提取，分別提取5 min、10 min。將勻漿液用紗布過濾，在10000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集上清液，用去離子水稀釋上清液后測定蛋白質(zhì)濃度，選取蛋白含量最高的作為最優(yōu)輔助提取方式。

以蛋白含量為指標(biāo)，利用最優(yōu)輔助提取方式，在NaCl濃度為0.10 mol/L，提取液pH為6.5，料液比為1∶4，提取時(shí)間為30 min條件下確定最佳提取時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、NaCl濃度（0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 mol/L）、提取液pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、料液比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6）g/mL

1.2.4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)Box-Behnken中心設(shè)計(jì)原理［14］，應(yīng)用Design Expert 8.0.4軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以磁力攪拌時(shí)間、NaCl濃度、提取液pH、料液比四個(gè)因素為自變量，并以-1、0、1分別代表自變量的低、中、高水平，蝦蛄鹽溶蛋白含量為響應(yīng)值設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中24個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)零點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)因素見表1。

表1　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1　The levels and factors of response surface experimental

1.2.5最佳條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)利用Design Expert 8.0.4軟件獲得了各個(gè)因素的最佳條件組合，結(jié)合實(shí)際可操作性進(jìn)行適當(dāng)修正，在修正后的條件下進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.2.6數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)用設(shè)計(jì)分析軟件為Design Expert 8.0，采用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素實(shí)驗(yàn)及分析

2.1.1輔助提取對蝦蛄鹽溶蛋白提取的影響水浴、微波、超聲波及磁力攪拌輔助提取對蝦蛄鹽溶蛋白提取的影響見圖1。由圖1可以看出，在提取時(shí)間一定時(shí)，磁力攪拌輔助提取要明顯優(yōu)于其他三種輔助提取方式；輔助提取方式一定時(shí)，在輔助提取時(shí)間為10～50 min內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長，超聲波輔助提取與磁力攪拌輔助提取蛋白增加的速度優(yōu)于靜置提取。磁力攪拌輔助提取的優(yōu)點(diǎn)是可以在4℃下操作，且在提取過程中沒有溫度的升高，不會影響蝦蛄中的蛋白質(zhì)活性成分。而超聲波及微波輔助提取在室溫下操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示功率設(shè)為20 W，提取5 min，溫度分別可達(dá)39℃和42℃，提取10 min，溫度可達(dá)53℃和60℃。溫度可以影響蝦蛄中蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，加熱破壞了肌原纖維蛋白的空間結(jié)構(gòu)，使巰基暴露出來，被氧化成二硫鍵，導(dǎo)致蛋白的完全變形和聚集［15］。隨著溫度上升，變性速度加快［16］。比較而言，磁力攪拌法不產(chǎn)生高溫，設(shè)備要求簡單，操作簡單，是一種值得推廣的，具有應(yīng)用前景的輔助提取方式。

圖1　輔助提取方式與蛋白含量的關(guān)系Fig.1　Effect of assisted extraction methods on protein content

圖2　磁力攪拌時(shí)間與蛋白含量的關(guān)系Fig.2　Effect of magnetic stirring time on protein content

2.1.2磁力攪拌時(shí)間對蝦蛄鹽溶蛋白提取的影響不同磁力攪拌時(shí)間對蝦蛄鹽溶蛋白提取的影響見圖2。由圖2可以看出，磁力攪拌時(shí)間在10～20 min時(shí)，蛋白含量隨攪拌時(shí)間的延長而明顯提高，說明蛋白質(zhì)浸出的速度較快；在20～50 min，隨攪拌時(shí)間的延長，蛋白濃度增加的速度緩慢，說明鹽溶蛋白已基本溶出。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因是前者的蛋白質(zhì)滲透壓高于后者［17］，后者蛋白質(zhì)已基本溶出。

2.1.3NaCl濃度對蝦蛄鹽溶蛋白提取的影響不同的NaCl濃度對蝦蛄鹽溶蛋白提取的影響見圖3。由圖3可以看出，NaCl濃度在0.1 mol/L時(shí)，蛋白含量最高；NaCl濃度在0.02～0.1 mol/L范圍內(nèi)時(shí)，蛋白含量隨NaCl濃度升高而逐漸增大；NaCl濃度在0.1～0.18 mol/L范圍內(nèi)時(shí)，蛋白含量隨NaCl濃度升高而逐漸減小。原因可能是NaCl濃度在0.02～0.1 mol/L范圍內(nèi)時(shí)，NaCl對蛋白質(zhì)的作用主要表現(xiàn)為鹽溶作用，會增加蛋白質(zhì)分子與水分子的作用，從而使蛋白質(zhì)在溶液中的溶解度增大；NaCl濃度在0.1～0.18 mol/L范圍內(nèi)時(shí)，蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析，不利于蛋白質(zhì)的溶解［18］。

圖3　NaCl濃度與蛋白含量的關(guān)系Fig.3　Effect of extraction solution concentration of NaCl on protein content

2.1.4提取液pH對蝦蛄鹽溶蛋白提取的影響不同的提取液pH對蝦蛄鹽溶蛋白提取的影響見圖4。由圖4可以看出，在pH為6.5時(shí)，蛋白提取效果最佳；pH在5.5～6.5范圍內(nèi)時(shí)，蛋白含量隨pH升高而逐漸增大；pH在6.5～7.5范圍內(nèi)時(shí)，蛋白含量隨pH升高而逐漸減小。這是由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)以上或以下的pH時(shí)，蛋白質(zhì)分子攜帶同種符號的凈電荷而相互排斥，阻止了單個(gè)分子聚集成沉淀，因此溶解度較大［19］。

圖4　提取液pH與蛋白含量的關(guān)系Fig.4　Effect of extraction solution pH value on protein content

2.1.5料液比對蝦蛄鹽溶蛋白提取的影響不同的料液比對蝦蛄鹽溶蛋白提取的影響見圖5。由圖5可以看出，料液比在1∶2～1∶3時(shí)，蛋白含量隨料液比的提高而明顯提高；在1∶3～1∶6，隨攪拌時(shí)間的延長，蛋白濃度增加的速度緩慢。料液比對蛋白質(zhì)溶解度的影響主要是由于在蛋白質(zhì)表層形成的水化層使蛋白質(zhì)顆粒彼此不能接近，因此在一定范圍內(nèi)，溶劑量越大，蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性越好，溶解度越大［20］。但料液比增加到一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)已基本溶出，蛋白含量趨于平緩。

圖5　料液比與蛋白含量的關(guān)系Fig.5　Effect of material-liquid ratio on protein content

2.2響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

根據(jù)表2的結(jié)果，通過多元回歸和逆向消除獲得二次多項(xiàng)回歸模型，二次響應(yīng)曲面模型擬合于方程：

Y=23.4+0.36X1+0.3X2+0.12X3-1.2X4+0.2X1X2-0.12X1X3+0.83X1X4-0.06X2X3+0.62X3X4-1.47X12-0.27X22-0.26X32-0.86X42

回歸模型的顯著性檢驗(yàn)和方差分析見表3。由表3可知，該模型的F值為16.32，p＜0.0001，表明模型極顯著。失擬項(xiàng)的F值為3.33，p=0.1289＞0.05，故失擬項(xiàng)不顯著，模型選擇合適?；貧w模型決定系數(shù)R2= 0.9423，矯正決定系數(shù)R2Adj=0.8845，說明回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以通過該回歸方程確定蝦蛄鹽溶蛋白的最佳提取工藝條件。

方差分析表明，磁力攪拌時(shí)間對蛋白含量的影響顯著，NaCl濃度、料液比對蛋白含量的影響極顯著，從各變量顯著性檢驗(yàn)p值的大小，可以看出影響蝦蛄鹽溶蛋白含量的各因素按大小排序依次為：料液比＞NaCl濃度＞磁力攪拌時(shí)間＞提取液pH。磁力攪拌時(shí)間×料液比、提取液pH×料液比、磁力攪拌時(shí)間平方項(xiàng)、NaCl濃度平方項(xiàng)、提取液pH平方項(xiàng)、料液比平方項(xiàng)對蛋白含量的影響極顯著。

根據(jù)回歸方程，作出三維響應(yīng)面圖和等高線圖。三維響應(yīng)面圖可以顯示響應(yīng)面的變化趨勢和最大值點(diǎn)［21］。等高線圖可以直觀反映兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示兩因素交互作用顯著［22］。

由圖6～圖11可以看出，磁力攪拌時(shí)間×料液比、提取液pH×料液比極顯著，表現(xiàn)為等高線圖形較扁平，其他因素間的交互作用不顯著。由圖8可以看出，磁力攪拌時(shí)間與料液比對蛋白含量均有影響，二者均呈二次曲線形式，隨著磁力攪拌時(shí)間的延長與料液比的增大，蛋白含量先增加后減小，說明磁力攪拌時(shí)間與料液比之間有極顯著的協(xié)同作用，二者的協(xié)同作用可能會影響蛋白含量。由圖11可以看出，提取液pH與料液比對蛋白含量均有影響，隨著提取液pH的增大，蛋白含量逐漸下降，隨著料液比的增加，蛋白含量先增加后減小。

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2　Design and results of response surface experiment

圖6　磁力攪拌時(shí)間和NaCl濃度的響應(yīng)面Fig.6　Response surface plot of magnetic stirring time and extraction solution concentration of NaCl

表3　回歸模型方差分析Table 3　Variance analysis of regression model

圖7　磁力攪拌時(shí)間和提取液pH的響應(yīng)面Fig.7　Response surface plot of magnetic stirring time and extraction solution pH

圖8　磁力攪拌時(shí)間和料液比的響應(yīng)面Fig.8　Response surface plot of magnetic stirring time and material-liquid ratio

圖9　NaCl濃度和提取液pH的響應(yīng)面Fig.9　Response surface plot of extraction solution concentration of NaCl and extraction solution pH

圖10　NaCl濃度和料液比的響應(yīng)面Fig.10　Response surface plot of extraction solution concentration of NaCl and material-liquid ratio

圖11　提取液pH和料液比的響應(yīng)面Fig.11　Response surface plot of extraction solution pH and material-liquid ratio

2.3最佳條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用Design Expert 8.0.4軟件獲得了各個(gè)因素的最佳條件組合為：磁力攪拌時(shí)間為24.14 min，NaCl濃度為0.11mol/L，提取液pH為6.36，料液比為1∶2.98 g/mL，蛋白含量響應(yīng)值為22.71 mg/g?？紤]到實(shí)際的可操作性，將以上最佳條件修正為：磁力攪拌時(shí)間為24 min，NaCl濃度為0.11 mol/L，提取液pH為6.36，料液比為1∶3 g/mL，在此條件下進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，得到蝦蛄鹽溶蛋白含量的平均值為（22.46±0.78）mg/g。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design Expert 8.0.4，通過二次回歸設(shè)計(jì)得到了蛋白含量與磁力攪拌時(shí)間、NaCl濃度、提取液pH、料液比四個(gè)自變量關(guān)系的回歸模型，模型表明磁力攪拌時(shí)間對蛋白含量的影響顯著，NaCl濃度、料液比、磁力攪拌時(shí)間×料液比、提取液pH×料液比對蛋白含量的影響極顯著，并得到蝦蛄鹽溶蛋白的最佳提取工藝條件：磁力攪拌時(shí)間為24 min，NaCl濃度為0.11 mol/L，提取液pH為6.36，料液比為1∶3 g/mL。此時(shí)蝦蛄鹽溶蛋白含量可達(dá)（22.46±0.78）mg/g。

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Optimization of salt-soluble protein from oratoria by response surface methodology

ZHOU Jing-li，ZHANG Kun-sheng*，REN Yun-xia
（Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

To optimize the fast extraction condition for the oratosquilla oratoria salt-soluble protein，the best assisted extraction methods was obtained on the basis of single-factor investigation.The optimize extraction conditions were as follow：extraction solution pH of 6.36，extraction solution concentration of NaCl was 0.11 mol/L，material to water ratio at 1∶3，and magnetic stirring extraction-duration of 24 min.The salt-soluble protein content could reach 22.46 mg/g，and the theory predicted value（22.71 mg/g）differs by 0.25 mg/g.

oratosquilla oratoria；the salt-soluble protein；the fast extraction；response surface methodogy

TS201.2

B

1002-0306（2015）16-0279-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.048

2014－12－16

周景麗（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品加工與貯藏，E-mail：zhoujingli1110@126.com。

張坤生（1957-），男，博士，教授，研究方向：食品加工與貯藏，E-mail：zhksheng@tjcu.edu.cn。

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD37B06-07）。