石榴皮多酚調(diào)控肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡的相關(guān)通路研究

呂　歐，李建科，馬倩倩，梁　俊，趙　偉

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

石榴皮多酚調(diào)控肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡的相關(guān)通路研究

呂歐，李建科*，馬倩倩，梁俊，趙偉

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

探討石榴皮多酚對(duì)成人肝細(xì)胞脂滴形成的影響，對(duì)肝細(xì)胞膽固醇合成限速酶基因及低密度脂蛋白受體基因表達(dá)的調(diào)控作用及其機(jī)制。以石榴皮多酚純化物（PPPs）、安石榴苷（PC）和石榴鞣花酸（EA）為受試物，以體外培養(yǎng)成人正常肝細(xì)胞L-02為研究對(duì)象，采用油紅O染色法觀察肝細(xì)胞內(nèi)脂滴變化情況，利用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增（realtime quantitative，RT-PCR）分析對(duì)肝細(xì)胞膽固醇合成限速酶關(guān)鍵基因HMGCR mRNA、SE mRNA及肝細(xì)胞低密度脂蛋白受體基因LDLR mRNA及其上游基因SREBP-2 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明：石榴皮多酚三種受試物均能減少細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成，以石榴鞣花酸效果最好；與模型組相比較，石榴皮多酚各處理組均可極顯著降低（p＜0.01）肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量；與正常組相比較，石榴皮多酚三種受試物均可使膽固醇合成關(guān)鍵酶HMGCR和SE基因表達(dá)調(diào)控至較低水平，對(duì)LDLR基因和SREBP-2基因表達(dá)則有明顯的上調(diào)作用。石榴皮多酚及其主要成分（安石榴苷和石榴鞣花酸）降低肝細(xì)胞膽固醇及降脂作用的機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)膽固醇合成限速酶基因表達(dá)，上調(diào)肝細(xì)胞低密度脂蛋白受體基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

石榴皮多酚純化物，安石榴苷，石榴鞣花酸，膽固醇

近年來(lái)，關(guān)于植物多酚功能活性的研究比較多，如石榴皮多酚［1-2］、安石榴苷［3-6］、石榴鞣花酸［7-8］在降血脂、抗氧化和調(diào)節(jié)預(yù)防心腦血管疾病等方面具有重要作用。并已清楚安石榴苷、鞣花酸、沒食子酸為石榴皮多酚的主要成分［9-11］。

趙艷紅等研究發(fā)現(xiàn)安石榴苷是石榴皮多酚純化物的主要活性成分［2］。B Cerdá等對(duì)安石榴苷吸收代謝進(jìn)行研究，證明安石榴苷吸收入血的活性形式為鞣花酸［3］。程霜等對(duì)高脂血癥SD大鼠經(jīng)石榴皮多酚提取物飼養(yǎng)28 d后，發(fā)現(xiàn)高脂血癥SD大鼠的血清與肝內(nèi)血清游離脂肪酸、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇含量明顯下降，同時(shí)高密度脂蛋白膽固醇含量也有所增加［12］。李云峰等采用石榴皮提取物對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)動(dòng)物AS形成的防治作用以及對(duì)氧化損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示石榴皮提取物能夠提高小鼠抗氧化防御體系功能、調(diào)節(jié)血脂水平、抑制平滑肌細(xì)胞的遷移和脂質(zhì)蓄積，發(fā)揮抗AS的活性，且其效果要高于石榴果肉提取物，也進(jìn)一步證明石榴皮提取物的降脂活性是高于石榴果肉提取物的［13］。丁瑋等研究發(fā)現(xiàn)石榴皮醇提取物對(duì)高脂血癥模型大鼠也具有較好的降血脂作用，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，石榴皮醇提物給藥組（800、1600 mg/kg）的大鼠較高脂血癥模型組大鼠的膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇均明顯降低，高密度脂蛋白膽固醇、超氧化物歧化酶明顯升高［14］。梁俊等研究了石榴皮多酚提取物對(duì)高脂模型人肝細(xì)胞的降血脂作用與其對(duì)體外的脂質(zhì)過(guò)氧化作用。其結(jié)果顯示石榴皮多酚能夠有效的抑制體外脂質(zhì)過(guò)氧化，能夠明顯地減少脂變肝細(xì)胞內(nèi)脂滴和膽固醇含量。同時(shí)，其研究結(jié)果表明石榴皮多酚主要通過(guò)抑制脂肪變性L-02成人肝細(xì)胞內(nèi)HMGCR基因mRNA的表達(dá)，來(lái)降低HMGCR的活性，最終減少脂肪變性肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量［8，15］。

從以上的研究成果可以看出，石榴皮多酚對(duì)動(dòng)物具有一定的降血脂作用，但其對(duì)人體降血脂作用的研究較少，石榴皮多酚對(duì)人體降血脂作用的分子機(jī)制目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)以正常成人肝細(xì)胞L-02為研究對(duì)象，構(gòu)建成人脂變肝細(xì)胞模型，以石榴皮多酚純化物（PPPs）、石榴鞣花酸（EA）、安石榴苷（PC）為考察對(duì)象，經(jīng)MTT法篩選合適濃度，利用油紅O染色法觀察石榴皮多酚對(duì)脂變肝細(xì)胞內(nèi)脂滴堆積的影響，同時(shí)采用RT-PCR檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)與膽固醇合成相關(guān)基因HMGCR mRNA、SE mRNA表達(dá)水平以及肝細(xì)胞對(duì)膽固醇內(nèi)吞清除相關(guān)基因LDLR mRNA、SREBP-2 mRNA表達(dá)水平，揭示石榴皮多酚對(duì)肝細(xì)胞膽固醇合成及內(nèi)吞清除影響及其分子調(diào)控機(jī)制。以期探明石榴皮多酚對(duì)成人肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成途徑的影響及其作用機(jī)理，為石榴皮多酚在功能食品和醫(yī)藥方面的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

成人正常肝細(xì)胞L-02購(gòu)于武漢大學(xué)典藏細(xì)胞庫(kù)；石榴皮多酚受試物：石榴皮多酚純化物陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院食品營(yíng)養(yǎng)與安全實(shí)驗(yàn)室制備，總多酚含量為87.81%；安石榴苷標(biāo)品（≥96.0%）、石榴鞣花酸標(biāo)品（≥98.0%） 均購(gòu)于美國(guó)sigma公司；油紅O、牛胰島素、二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍(lán)（MTT） 均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季清公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Amresco公司；膽固醇（TC）測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒OMEGA試劑公司；RevertAidTMFirst Stand cDNA Synthesis KitFermentas公司；SYBR Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）寶生物工程（大連）有限公司；HMGCR基因（NM_000859.2）、SE基因（NM_003129.3）、GAPDH基因（NM_001256799.1）、SREBP-2基因（NM_004599.2）、LDLR基因（NM_000527.4） 采用Primer5.0軟件對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析，由上海生物工程有限股份公司合成。

311氣套式型CO2恒溫培養(yǎng)箱美國(guó)Thermo公司；TS100型倒置顯微鏡日本Nikon公司；SW-CJ-1D型超凈工作臺(tái)江蘇吳江市凈化設(shè)備廠；IX71型倒置熒光顯微鏡圖像采集系統(tǒng)美國(guó)Thermo公司；RT-6000型酶標(biāo)儀雷杜公司；微量核酸蛋白測(cè)定儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀美國(guó)Thermo公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)完全培養(yǎng)液由RPMI-1640、10%胎牛血清、1%雙抗、1 μg/mL胰島素配制。成人正常肝細(xì)胞L-02采用RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于培養(yǎng)箱中孵育。孵育條件為溫度37℃、CO2濃度5%、空氣濕度95%。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，用PBS沖洗1～2次，消化3 min，加入1 mL培養(yǎng)液終止反應(yīng)，收集細(xì)胞，1000 r/min離心3 min，棄去上清液，加入新鮮完全培養(yǎng)液，吹打均勻，以1×106cell/瓶的濃度接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，傳代培養(yǎng)［16］。

1.2.2建立肝細(xì)胞脂肪變性模型造模培養(yǎng)液由RPMI-1640、50%胎牛血清、1%雙抗和1 μg/mL胰島素配制。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成人肝細(xì)胞L-02接種于六孔板（1×104cell/孔），待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～60%時(shí)，正常組換用完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)作為對(duì)照，模型組換用造模培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)造模，48 h后進(jìn)行處理。

1.2.3石榴皮多酚對(duì)L-02脂肪變性肝細(xì)胞增殖活力的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝細(xì)胞L-02接種于96孔板內(nèi)，待12 h貼壁后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組處理。正常組用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)96 h，模型組用造模培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后改用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，實(shí)驗(yàn)組分別用含不同濃度（5、10、20、40、80、160、320 μg/mL）PPPs、PC、EA的造模培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h之后繼續(xù)用含相同濃度受試物的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。每組各設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔，進(jìn)行MTT增殖檢測(cè)。于570 nm的波長(zhǎng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光值，計(jì)算各藥物濃度下L-02細(xì)胞的存活率：

1.2.4石榴皮多酚對(duì)L-02脂肪變性肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積的影響根據(jù)受試物MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇安全有效濃度處理細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組如下：正常組用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)96 h，模型組用造模培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后改用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，實(shí)驗(yàn)組分別用含不同濃度（25、50、100 μg/mL）PPPs、PC、EA的造模培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，之后繼續(xù)用含相同濃度受試物的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。待細(xì)胞處理結(jié)束后，采用油紅O染色法檢測(cè)石榴皮多酚對(duì)脂肪變性L-02肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積的影響，并按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定各組細(xì)胞中的膽固醇含量。

油紅O染色法的具體操作如下：將6孔板中待處理的L-02肝細(xì)胞用PBS緩沖溶液漂洗兩次；先用1 mL 4%（w/v）的多聚甲醛溶液在4℃冰箱固定8 min，接著再用PBS清洗細(xì)胞2次；然后每孔避光加入1 mL油紅O染色液，染色10 min，吸棄廢液，用60%（v/v）異丙醇漂洗分化，除去多余的染料，吸棄；最后用倒置熒光顯微鏡的普通光觀察細(xì)胞形態(tài)變化以及細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴形成情況［17］。

1.2.5石榴皮多酚對(duì)L-02脂肪變性肝細(xì)胞膽固醇合成影響機(jī)制研究根據(jù)受試物對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積影響選擇12.5、25 μg/mL作為最佳處理濃度。實(shí)驗(yàn)分組如下：正常組用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)96 h，模型組用造模培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后改用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，實(shí)驗(yàn)組分別用含不同濃度（12.5、25 μg/mL）PPPs、PC、EA的造模培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h之后繼續(xù)用含相同濃度受試物的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。待各組處理結(jié)束后，按照試劑盒說(shuō)明提取各組肝細(xì)胞內(nèi)的總RNA，檢測(cè)純度及完整性并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將所得cDNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或置于-20℃保存，若長(zhǎng)期保存則置于-70℃。表1為各基因的引物序列。

表1　PCR引物序列及產(chǎn)物大小Table 1　The sequenees of primers and the size of PCR produets

以上述所得各處理組cDNA為模板，采用RT-PCR檢測(cè)各組HMGCR基因mRNA、SE基因mRNA、LDLR基因mRNA、SREBP-2基因mRNA的擴(kuò)增情況。熒光定量PCR的擴(kuò)增條件：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s；共40個(gè)循環(huán)；60℃，30 s；溶解曲線，60～95℃。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步統(tǒng)計(jì)后，采用SPSS 17.0進(jìn)行顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1石榴皮多酚對(duì)L-02肝細(xì)胞增殖活力的影響

如圖1所示，當(dāng)石榴皮多酚作用于L-02脂肪變性肝細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率隨著石榴皮多酚濃度的增加而呈逐漸下降的趨勢(shì)，低濃度的石榴皮多酚對(duì)L-02脂肪變性肝細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制，表現(xiàn)為在0～80 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率均在90%以上。但在高濃度的石榴皮多酚作用下，L-02肝細(xì)胞出現(xiàn)了較多的死亡，表現(xiàn)出明顯的增殖抑制效應(yīng)，320 μg/mL的石榴皮多酚純化物作用下細(xì)胞存活率僅為40.12%。故在本實(shí)驗(yàn)中選定0～100 μg/mL作為安全濃度，進(jìn)一步研究受試物作用于細(xì)胞的最佳處理濃度。

圖1　不同濃度石榴皮多酚對(duì)脂變L-02肝細(xì)胞存活率的影響（±s，n=4）Fig.1　The effects of different concentrations of PPPs on the hepatocytes proliferation（±s，n=4）

圖2　石榴皮多酚對(duì)實(shí)驗(yàn)組脂變肝細(xì)胞內(nèi)脂滴影響（400×）Fig.2　The effects of the accumulation of lipid droplets in the experimental groups observed by oil red O staining（400×）

2.2石榴皮多酚對(duì)L-02脂肪變性肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積的影響

2.2.1石榴皮多酚對(duì)細(xì)胞脂滴聚積的影響由圖2可見：與模型組相比，石榴皮多酚純化物、安石榴苷、鞣花酸均能減少肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴。受試物濃度為25 μg/mL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)脂滴較模型組大量減少；受試物濃度為50 μg/mL及100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)脂滴與25 μg/mL處理組無(wú)明顯差異。

2.2.2石榴皮多酚對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響由圖3可見：與正常組相比較，模型組膽固醇含量極顯著升高（p＜0.01）；與模型組相比較，石榴皮多酚各處理組膽固醇含量極顯著降低（p＜0.01）；三個(gè)濃度（25、50、100 μg/mL）之間不具有顯著性差異（p＞0.05）。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選定處理濃度為12.5、25 μg/mL。

圖3　細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的變化Fig.3　Changes of cholesterol levels in cells

2.3石榴皮多酚對(duì)脂變肝細(xì)胞膽固醇合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.3.1石榴皮多酚對(duì)HMGCR基因mRNA、SE基因mRNA表達(dá)量的影響由圖4和圖5可見，與正常組相比，模型組中HMGCR基因mRNA和SE基因mRNA表達(dá)量均極顯著減少（p＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組與正常組比較，石榴皮多酚純化物、安石榴苷及石榴鞣花酸對(duì)膽固醇合成限速酶HMGCR基因mRNA和SE基因mRNA表達(dá)均有抑制作用。肝細(xì)胞脂變模型組比正常組HMGCR基因mRNA、SE基因mRNA表達(dá)量明顯降低的原因可能是，肝細(xì)胞嚴(yán)重脂變導(dǎo)致了細(xì)胞的一些功能降低，以及肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇升高對(duì)膽固醇合成的反饋抑制所致。圖5中實(shí)驗(yàn)組比正常組SE基因mRNA表達(dá)量明顯降低而比模型組有一定上升，可能是因?yàn)槭衿ざ喾訉?duì)肝細(xì)胞膽固醇合成限速酶SE基因mRNA表達(dá)具有一定的雙向調(diào)節(jié)作用，這也是許多天然食品功能因子調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝的共同特點(diǎn)［18-19］。

圖4　各實(shí)驗(yàn)組HMGCR mRNA基因相對(duì)表達(dá)量Fig.4　The relative expressions of HMGCR mRNA in the experimental groups

圖5　各實(shí)驗(yàn)組SE mRNA基因相對(duì)表達(dá)量Fig.5　The relative expressions of SE mRNA in the experimental groups

2.3.2石榴皮多酚對(duì)LDLR基因mRNA表達(dá)量的影響

由圖6可見，與正常組相比，模型組LDLR基因mRNA表達(dá)量明顯減少（p＜0.01）；與模型組相比較，隨著三種受試物濃度的增加，實(shí)驗(yàn)組LDLR基因mRNA的表達(dá)量有所上調(diào)，說(shuō)明石榴皮多酚可促使脂變肝細(xì)胞LDLR基因mRNA上調(diào)；與正常組相比較，25 μg/mL石榴鞣花酸處理組LDLR基因mRNA表達(dá)量極顯著高于正常組（p＜0.01），說(shuō)明石榴皮多酚可上調(diào)肝細(xì)胞LDLR基因mRNA表達(dá)。

LDLR為肝細(xì)胞低密度脂蛋白受體，血液中有75%的低密度脂蛋白（LDL）由肝臟清除，其中90%是通過(guò)低密度脂蛋白受體（LDLR）途徑清除的，LDLR對(duì)調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇平衡，調(diào)節(jié)血液總膽固醇（TC）含量起著關(guān)鍵作用［20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)的石榴皮多酚對(duì)LDLR基因mRNA有顯著上調(diào)作用，說(shuō)明石榴皮多酚可提高肝細(xì)胞對(duì)LDL的內(nèi)吞清除能力，有利于清除血液LDL從而發(fā)揮降血脂作用，加速肝臟對(duì)肝外膽固醇的代謝轉(zhuǎn)化［21-22］。

圖6　各實(shí)驗(yàn)組LDLR mRNA基因相對(duì)表達(dá)量Fig.6　The relative expressions of LDLR mRNA in the experimental groups

2.3.3石榴皮多酚對(duì)SREBP-2基因mRNA表達(dá)水平的影響由圖7可見，與正常組相比，模型組SREBP-2基因mRNA表達(dá)量減少（p＜0.01）；與模型組相比，隨著受試物濃度的增加，SREBP-2基因mRNA的表達(dá)量有所上調(diào)，特別是石榴皮多酚及其主要成分EA可顯著上調(diào)脂變肝細(xì)胞SREBP-2基因mRNA的表達(dá)；與正常組相比，PEA處理組SREBP-2基因mRNA表達(dá)量顯著高于正常組（p＜0.05）?？傊N受試物對(duì)SREBP-2基因mRNA表達(dá)均有一定的劑量依賴性上調(diào)作用，其上調(diào)作用強(qiáng)弱依次為石榴鞣花酸（EA）＞石榴皮多酚純化物（PPPs）＞安石榴苷（PC）。SREBP-2是LDLR的上游基因，SREBP-2基因mRNA表達(dá)上調(diào)可進(jìn)一步使LDLR基因mRNA表達(dá)上調(diào)，這與2.3.2結(jié)果相一致，進(jìn)一步揭示了石榴皮多酚對(duì)膽固醇內(nèi)吞清除的調(diào)控機(jī)制。

圖7　各實(shí)驗(yàn)組HMGCR mRNA基因相對(duì)表達(dá)量Fig.7　The relative expressions of SREBP-2 mRNA in the experimental groups

3　結(jié)論

石榴皮多酚純化物、安石榴苷、鞣花酸三種受試物均可不同程度的抑制肝細(xì)胞內(nèi)脂滴積累，降低高脂模型肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量；石榴皮多酚純化物、安石榴苷、鞣花酸三種受試物對(duì)膽固醇合成關(guān)鍵限速酶HMGCR基因mRNA和SE基因mRNA表達(dá)有下調(diào)作用，并有雙向調(diào)控作用，從而維持肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝平衡；三種受試物均可上調(diào)肝細(xì)胞LDLR基因mRNA及其上游SREBP-2基因mRNA表達(dá)，從而提高肝細(xì)胞對(duì)膽固醇的內(nèi)吞清除能力。

石榴皮多酚純化物、安石榴苷、鞣花酸降低膽固醇及降血脂的機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)膽固醇合成限速酶HMGCR基因mRNA和SE基因mRNA表達(dá)，上調(diào)肝細(xì)胞LDLR基因mRNA及其上游SREBP-2基因mRNA表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，其確切機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

［1］趙艷紅，李建科，李國(guó)榮.石榴皮多酚純化及其抗氧化活性表征［J］.食品科學(xué)，2010，11：31-37.

［2］Mar Larrosa，F(xiàn)rancisco A Toma’s-Barbera’n，Juan Carlos Esp?’n.The dietary hydrolysable tannin punicalagin releases ellagic acid that induces apoptosis in human colon adenocarcinoma Caco-2 cells by using the mitochondrial pathway［J］.Journal of Nutritional Biochemistry，2006，17：611-625.

［3］B Cerdá，R Llorach，José J Cerón，et al.Evaluation of the bioavailability and metabolism in the rat of punicalagin，an antioxidant polyphenofrom pomegranate juice［J］.European Journal of Nutrion，2003，1（42）：18-28.

［4］Pin-Shern Chen，Jih-Heng Li.Chemopreventive effect of punicalagin，a novel tannin component isolated from Terminalia catappa，on H-ras-transformed NIH3T3 cells［J］.Toxicology letter，2006：44-53.

［5］Lee Sang-Ik，Kim Byoung-Soo，Kim Kyoung-Shin，et al. Immune-suppressive activity of punicalagin via inhibition of NFATactivation［J］.BiochemicalandBiophysicalResearch Communications，2008，371：799-803.

［6］Jurenka J.Therapeutic Applications of Pomegranate（Punica granatum L.）：A Review［J］.Alternative Medicine Review，2008，2（13）：128-144.

［7］郭增軍，譚林，徐穎，等.鞣花酸類化合物在植物界的分布及其生物活性［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010（3）：519-524.

［8］梁俊，李建科，趙偉，等.石榴皮多酚體外抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用研究［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，31（2）：159-165.

［9］Al-Muammar MN，Khan F.Obesity：The preventive role of the pomegranate（Punica granatum）［J］.Nutrition，2012：1-10.

［10］Manuel Viuda-Martos，Yolanda Ruiz-Navajas，Juana Fernández-López，et al.Antioxidant properties of pomegranate（Punica granatum L.）bagasses obtained as co-product in the juice extraction［J］.Food Research International，2011，44：1217-1223.

［11］Mustafa ?am.Pressurised water extraction of polyphenols from pomegranate peels［J］.Food Chemistry，2010，123：878-885.

［12］程霜，郭長(zhǎng)江，楊繼軍，等.石榴皮多酚提取物降血脂效果的實(shí)驗(yàn)研究［J］.解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2005，23（3）：160-163.

［13］李云峰.石榴皮抗氧化物質(zhì)提取及其抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用研究［D］.北京：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2004.

［14］丁瑋，孫建新，扎文峰，等.石榴皮醇提物降血脂作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，22（1）：44-47.

［15］梁俊，李建科，劉永峰，等.石榴皮多酚對(duì)脂變L-02肝細(xì)胞膽固醇合成的影響及機(jī)制探究［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2013，32（4）：487-493.

［16］陳慧梅，廖紅，高靜.肝細(xì)胞培養(yǎng)方法研究進(jìn)展［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2002，24（3）：163-166.

［17］田玉旺，李琳，李麗，等.介紹一種改良的油紅O脂肪染色法［J］.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2007（6）：736-736.

［18］殷紅，程桂芳.白藜蘆醇雙向調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子-κB活化和HEK293細(xì)胞增殖［J］.科學(xué)通報(bào)，2005，50（9）：885-889.

［19］羅彤，戚向陽(yáng)，李培培.紫菜多糖雙向免疫調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展［J］.食品科技，2010，35（8）：210-216.

［20］周成江，和彥苓，周立社，等.蒙藥童格勒格-1四種粗提物對(duì)大鼠肝細(xì)胞BRL株低密度脂蛋白受體基因表達(dá)的影響［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用醫(yī)學(xué)，2008，25（3）：186-189.

［21］陳芬，王綠婭，尹衛(wèi)東.低密度脂蛋白受體功能及其影響因素研究進(jìn)展［J］.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2006，14（5）：448-450.

［22］于碧蓮，趙水平，謝湘竹，等.氧化型低密度脂蛋白對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞膽固醇流出的影響［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2007，32（4）：631-636.

Effect of pomegranate peel polyphenols on regulation pathways of cholesterol in hepatic cell

LV Ou，LI Jian-ke*，MA Qian-qian，LIANG Jun，ZHAO Wei
（College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

This paper was aimed to study the effects of pomegranate peel polyphenols on lipid droplet formation of hepatocyte and the expression levels of cholesterol synthesis enzyme gene and low density lipoprotein receptor gene.Pomegranate peel polyphenols（PPPs），punicalagin（PC）and pomegranate ellagic acid（EA）were used as test substances，L-02 human hepatocytes were choosen as experimental cell.The lipid droplets in human hepatocytes were assessed by oil red O staining，and the expression levels of HMGCR mRNA，SE mRNA，low density lipoprotein receptor gene LDLR mRNA and its upstream gene SREBP-2 mRNA was analyzed by RT-PCR.The results showed that these three test substances could reduce the intracellular lipid droplets，and the EA showed better effect.Compared with the model group，PPPs could significantly decrease（p＜0.01）cholesterol.Moreover，compared with the normal group，HMGCR mRNA and SE mRNA were downregulated，whereas LDLR mRNA and SREBP-2 mRNA were up-regulated by pomegranate peel polyphenols. The possible mechanism of regulating cholesterol balance by PPPs and its mian component PC and EA in hepatic cells was via the downregulating cholesterol synthesis enzyme gene expression and upregulating the LDLR gene expression.

pomegranate peel polyphenols；punicalagin；pomegranate ellagic acid；cholesterol

TS255.1

A

1002-0306（2015）16-0222-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.037

2014-10-14

呂歐（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全，E-mail：A992878504@163.com。

李建科（1960-），男，博士，教授，研究方向：食品分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)，E-mail：jiankel@snnu.edu.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171677）。