產(chǎn)黃青霉A4產(chǎn)胞外葡萄糖氧化酶發(fā)酵工藝優(yōu)化

王周圓，別小妹，呂鳳霞，趙海珍，陸兆新

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇南京210095）

產(chǎn)黃青霉A4產(chǎn)胞外葡萄糖氧化酶發(fā)酵工藝優(yōu)化

王周圓，別小妹，呂鳳霞，趙海珍，陸兆新*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇南京210095）

以產(chǎn)黃青霉A4（Penicillium chrysogenum A4）作為葡萄糖氧化酶胞外酶生產(chǎn)菌株，通過單因素和正交設(shè)計實驗，優(yōu)化提高酶活的發(fā)酵培養(yǎng)基組分。結(jié)果表明：最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分組合為：碳源（葡萄糖）10%、有機氮源（麥芽浸粉）0.5%、無機氮源（NaNO3）1.7%。在最佳培養(yǎng)基上研究得到的發(fā)酵條件為：接種量1 mL、裝液量50 mL、培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時間6 d。在此條件下，葡萄糖氧化酶活力提高到17.2 U/mL，為初始發(fā)酵酶活的17.2倍。

產(chǎn)黃青霉，葡萄糖氧化酶，培養(yǎng)基，發(fā)酵條件，優(yōu)化

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）在分子氧存在下，專一催化β-D-葡萄糖氧化成1，5-葡萄糖酸內(nèi)酯和過氧化氫，而后葡萄糖酸內(nèi)酯又自發(fā)和水結(jié)合產(chǎn)生葡萄糖酸［1］。該酶被廣泛應(yīng)用于食品加工、發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)學(xué)檢測［2-3］。葡萄糖氧化酶主要來源于黑曲霉和青霉［4-5］。目前研究生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的菌種主要是黑曲霉，而對于青霉屬來源的葡萄糖氧化酶研究較少，后者相對前者具有底物親和力更高，易于分離的優(yōu)勢［6］。

近年來，一系列相關(guān)研究的評估證實了產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）的安全性。Houbraken通過分子鑒定證實產(chǎn)青霉素的菌株實際為產(chǎn)紅青霉（P.rubens）而不是產(chǎn)黃青霉［7］。Konishi等通過連續(xù)90 d喂食小鼠的毒理實驗證實產(chǎn)黃青霉在產(chǎn)酶過程中未引起副作用和毒性作用［8］，表明其在發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶方面有很好的應(yīng)用價值。

本實驗利用一株產(chǎn)葡萄糖氧化酶的產(chǎn)黃青霉A4（P.chrysogenum A4），采用單因素和正交設(shè)計實驗優(yōu)化產(chǎn)葡萄糖氧化酶的發(fā)酵培養(yǎng)基組分，采用提高無機氮源NaNO3添加量的方法，顯著提高了胞外酶產(chǎn)量。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，以實現(xiàn)提高酶產(chǎn)量的目的，并為后期改造和進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株產(chǎn)黃青霉A4（P.chrysogenum A4） 本實驗室分離保藏；PDA斜面培養(yǎng)基（g/L） 馬鈴薯200（切碎煮沸30 min，兩層紗布過濾取汁）、葡萄糖20、瓊脂2、pH自然，121℃、30 min滅菌；發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖100、胰蛋白胨4、KH2PO42、MgSO4·7H2O 0.7、NaNO33、CaCO33.5、pH 6，115℃、30 min滅菌；o-dianisdiane（鄰聯(lián)茴香胺）、辣根過氧化物酶美國Sigma公司。

EUTECH pH510酸度計EUTECH公司；HT6029超凈工作臺蘇州進(jìn)化設(shè)備有限公司；5418小型高速離心機德國Eppendorf公司；UV-2450紫外分光光度儀日本Shimadzu公司；DK-8D恒溫水槽上海森信實驗儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1種子液制備挑取1環(huán)孢子劃線接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，30℃靜置培養(yǎng)至長出茂密的孢子。用蘸水的接種環(huán)蘸取孢子，在菌水中配成孢子懸浮液，采用血球計數(shù)法調(diào)整孢子濃度為106個/mL。

1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

1.2.2.1不同碳源對A4產(chǎn)GOD的影響向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加10%（w/w）的蔗糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖代替葡萄糖作為碳源，30℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)4、5 d后分別測定發(fā)酵液粗酶液的酶活，篩選出最佳碳源。

1.2.2.2碳源添加量對A4產(chǎn)GOD的影響分別按8%、9%、10%、11%、12%（w/w）的濃度向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加最佳碳源，30℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)5 d后測定發(fā)酵液粗酶液的酶活，確定最適的碳源添加量。

1.2.2.3不同有機氮源對A4產(chǎn)GOD的影響向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.4%（w/w）的大豆蛋白胨、麥芽浸粉蛋白胨、玉米浸粉代替胰蛋白胨作為有機碳源，30℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)5 d后測定發(fā)酵液粗酶液的酶活，篩選出最佳有機氮源。

1.2.2.4有機氮源添加量對A4產(chǎn)GOD的影響分別按2‰、3‰、4‰、5‰、6‰（w/w）的濃度向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加最佳有機氮源，30℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)5 d后測定發(fā)酵液粗酶液的酶活，確定最適的有機氮源添加量。

1.2.2.5不同無機氮源對A4產(chǎn)GOD的影響向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.3%（w/w）的KNO3、NH4NO3、NH4Cl、（NH4）2HPO4代替NaNO3作為無機碳源，30℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)5 d后測定發(fā)酵液粗酶液的酶活，篩選出最佳無機氮源。

1.2.2.6無機氮源添加量對A4產(chǎn)GOD的影響分別按3‰、5‰、7‰、9‰、11‰、13‰、15‰、17‰、19‰、21‰、23‰（w/w）的濃度向發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加最佳無機氮源，30℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)5 d后測定發(fā)酵液粗酶液的酶活，確定最適的無機氮源添加量。

1.2.2.7培養(yǎng)基成分的正交設(shè)計實驗經(jīng)單因素實驗篩選出的最佳碳源、有機氮源和無機氮源作為正交實驗的三個因素，根據(jù)各物質(zhì)的最適濃度范圍設(shè)計3因素3水平的正交實驗進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。各因素和水平見表1。

表1　因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal test

1.2.3發(fā)酵條件確定初始發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度30℃、接種量1 mL、裝液量50 mL、培養(yǎng)時間5 d。根據(jù)正交設(shè)計實驗得出的最優(yōu)培養(yǎng)基成分組合配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分別按照不同培養(yǎng)溫度（21、24、27、30、33℃）、接種量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL）、裝液量（50、75、100、125、150 mL）和培養(yǎng)時間（1、2、3、4、5、6、7 d）進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)一個發(fā)酵條件在變化時，其他發(fā)酵條件均保持不變。

1.2.4發(fā)酵液粗酶液制備發(fā)酵液4℃、10000 r/min離心5 min，取上清備用。

1.2.5酶活力測定葡萄糖氧化酶的活性測定參考郭瑤的方法并做適當(dāng)修改［9］，取0.21 mmol/L鄰聯(lián)茴香胺溶液2.4 mL、10%（w/w）葡萄糖溶液0.5 mL、60 U/mL辣根過氧化物酶溶液100 μL，混勻后置于35℃恒溫水槽溫育；加入適當(dāng)稀釋后的粗酶液樣品100 μL，顛倒混勻后在460 nm波長處測定吸光度，用預(yù)先滅活的酶液作空白對照。葡萄糖氧化酶的活力單位（U）定義為：每分鐘催化葡萄糖氧化產(chǎn)生1 μmoL H2O2所需的酶量為1個活力單位。

2　結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基成分優(yōu)化

2.1.1碳源種類對產(chǎn)酶的影響不同霉菌發(fā)酵產(chǎn)酶過程中的碳源需求有顯著的選擇性。由圖1可知，添加葡萄糖作為培養(yǎng)基的碳源時，產(chǎn)黃青霉A4的產(chǎn)酶能力最強，添加乳糖、麥芽糖作為碳源時不產(chǎn)酶，與譚瑩等研究的黑曲霉，Semashko等研究的繩狀青霉不同［10-11］。添加蔗糖作為碳源時產(chǎn)黃青霉A4的產(chǎn)酶周期縮短，第5 d從發(fā)酵液中檢測不到酶活。由于葡萄糖相比甘露醇的成本低，后續(xù)實驗進(jìn)一步研究發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度對A4的產(chǎn)酶能力的影響。

圖1　不同碳源對產(chǎn)黃青霉A4產(chǎn)酶的影響Fig.1　Effect of different kinds of carbon sources on GOD production by P.chrysogenum A4

2.1.2葡萄糖濃度對產(chǎn)酶的影響由圖2可知，當(dāng)葡萄糖濃度為9%時，發(fā)酵液的酶活最高。這可能是由于葡萄糖濃度低于9%時，其不足以維持菌絲體生長和產(chǎn)酶所需的碳源；當(dāng)其高于10%時，過高濃度的分解代謝產(chǎn)物如葡萄糖酸抑制了酶的合成［12］，也可能是發(fā)酵液酸濃度過高使蛋白變性，影響酶的活力表達(dá)。

圖2　葡萄糖濃度對產(chǎn)黃青霉A4產(chǎn)酶的影響Fig.2　Effect of glucose concentration on glucose oxidase production by P.chrysogenum A4

2.1.3有機氮源種類對產(chǎn)酶的影響由圖3可知，添加麥芽浸粉作為培養(yǎng)基的有機氮源時，產(chǎn)黃青霉A4的產(chǎn)酶能力最強。后續(xù)實驗進(jìn)一步研究麥芽浸粉的濃度對A4的產(chǎn)酶能力的影響。

圖3　不同有機碳源對產(chǎn)黃青霉A4產(chǎn)酶的影響Fig.3　Effect of different kinds of organic nitrogen sources on GOD production by P.chrysogenum A4

2.1.4麥芽浸粉濃度對產(chǎn)酶的影響氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)（氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物。碳源和氮源的比例直接影響微生物的生長和發(fā)酵產(chǎn)物的積累。霉菌發(fā)酵的碳氮比一般為100∶10。有機氮源（麥芽浸粉）作為緩效氮源可以維持發(fā)酵后期的氮源供應(yīng)。由圖4可知，當(dāng)麥芽浸粉濃度為4‰時，發(fā)酵液的酶活最高。

圖4　麥芽浸粉濃度對產(chǎn)黃青霉A4產(chǎn)酶的影響Fig.4　Effect of malt extract concentration on GOD production by P.chrysogenum A4

2.1.5無機氮源種類對產(chǎn)酶的影響無機氮源作為速效氮源，培養(yǎng)初期可被菌體細(xì)胞迅速利用。但無機氮源的迅速利用常會引起pH的變化。（NH4）2SO4經(jīng)代謝產(chǎn)生H2SO4等酸性物質(zhì)，培養(yǎng)基pH會下降，硝酸鹽經(jīng)代謝產(chǎn)生KOH或NaOH等堿性物質(zhì)，培養(yǎng)基pH會相應(yīng)上升［13］。由圖5可知，添加NaNO3作為培養(yǎng)基的無機氮源時，產(chǎn)黃青霉A4的產(chǎn)酶能力高于添加其他無機氮源。這可能是由于該培養(yǎng)基中含糖量較高，在代謝過程中產(chǎn)生酸性物質(zhì)，而NaNO3經(jīng)代謝產(chǎn)生的堿性物質(zhì)可以中和該酸性物質(zhì)，穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH，保持酶的活力。后續(xù)實驗進(jìn)一步研究NaNO3的濃度對產(chǎn)黃青霉A4產(chǎn)酶能力的影響。

圖5　不同無機碳源對產(chǎn)黃青霉A4產(chǎn)酶的影響Fig.5　Effect of different kinds of inorganic nitrogen sources on GOD production by P.chrysogenum A4

2.1.6NaNO3濃度對產(chǎn)酶的影響由圖6可知，當(dāng)NaNO3濃度為17‰時，發(fā)酵液的酶活最高，達(dá)到12 U/mL。當(dāng)其濃度高于17‰時，由于鈉離子濃度過高導(dǎo)致發(fā)酵液中的滲透壓過高，不利于細(xì)胞正常生長，因此酶活降低。Sámi認(rèn)為葡萄糖氧化酶的產(chǎn)生是絲狀真菌生長過程中重要的活性氧代謝途徑［14］。NaNO3不僅可以作為菌體生長所需的無機氮源。此外，硝酸根（NO3-）具有很強的氧化作用，會提高產(chǎn)黃青霉的活性氧水平，促進(jìn)其合成葡萄糖氧化酶對葡萄糖進(jìn)行氧化作用。黑曲霉產(chǎn)酶所需的最適無機氮源也為硝酸鈉，但硝酸鈉的濃度變化對產(chǎn)酶的影響較小，本研究表明NaNO3濃度對產(chǎn)黃青霉產(chǎn)葡萄糖氧化酶的促進(jìn)作用最顯著［15-16］。

圖6　NaNO3濃度對產(chǎn)黃青霉A4產(chǎn)酶的影響Fig.6　Effect of NaNO3concentration on GOD production by P.chrysogenum A4

2.1.7培養(yǎng)基組分正交優(yōu)化實驗正交實驗結(jié)果見表2。

表2　正交設(shè)計實驗直觀分析表Table 2　Results of orthogonal test

由表2可知，培養(yǎng)基中對產(chǎn)酶能力影響最大的是NaNO3，其次依次是葡萄糖、麥芽浸粉。較好的培養(yǎng)基成分組合為A2B2C2，該組合未在正交設(shè)計實驗中出現(xiàn)，正交組合中酶活最高的組合為A2B1C2，需進(jìn)行一次驗證實驗予以證實。

分別按照A2B1C2和A2B2C2配制發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，在上述同樣條件下進(jìn)行驗證實驗，測得酶活分別為11.69 U/mL和13.03 U/mL，因此選擇A2B2C2為最優(yōu)成分組合，即產(chǎn)黃青霉產(chǎn)葡萄糖氧化酶發(fā)酵培養(yǎng)基最適成分為：碳源（葡萄糖）10%、有機氮源（麥芽浸粉）0.5%、無機氮源（NaNO3）1.7%。以此基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)酵的酶活約為初始發(fā)酵培養(yǎng)酶活的13倍。下步實驗以該優(yōu)化的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，研究培養(yǎng)溫度、接種量、裝液量和培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響。

2.2培養(yǎng)條件的確定

2.2.1培養(yǎng)溫度的確定由圖7可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃時，發(fā)酵液的酶活最高。青霉屬真菌的最適生長溫度為28～30℃，當(dāng)溫度低于或高于30℃時，菌體生長和產(chǎn)物合成速率均變慢。

圖7　培養(yǎng)溫度對產(chǎn)黃青霉A4產(chǎn)酶的影響Fig.7　Effect of culture temperature on GOD production by P.chrysogenum A4

2.2.2接種量的確定接種量的大小與菌的生長繁殖速度相關(guān)。當(dāng)接種量較大時，可以縮短發(fā)酵周期。但接種量過大時，由于菌體生長過快，發(fā)酵液的粘度增加，導(dǎo)致溶解氧不足，同時，葡萄糖氧化酶作為糖基化程度較高的酶，其合成階段需要利用葡萄糖［17］。菌體生長消耗過多的營養(yǎng)物質(zhì)，特別是作為菌體結(jié)構(gòu)物質(zhì)的碳源葡萄糖，影響后期產(chǎn)物的合成［18］。由圖8可知，當(dāng)接種量為1.0 mL時，發(fā)酵液的酶活最高。

圖8　接種量對產(chǎn)黃青霉A4產(chǎn)酶的影響Fig.8　Effect of inoculum amount on GOD production by P.chrysogenum A4

2.2.3裝液量的確定由圖9可知，當(dāng)裝液量為50 mL時，發(fā)酵液的酶活最高。產(chǎn)黃青霉是需氧菌，菌體正常生長和代謝的過程中要保持溶氧速率大于菌體耗氧速率，裝液量過大會降低通氣量，降低溶氧速率，影響菌絲體的生長和酶的合成［19］。

圖9　裝液量對產(chǎn)黃青霉A4產(chǎn)酶的影響Fig.9　Effect of liquid medium volume on GOD production by P.chrysogenum A4

2.2.4發(fā)酵時間的確定由圖10可知，產(chǎn)黃青霉A4在發(fā)酵培養(yǎng)的第6 d酶活達(dá)到最高，為17.2 U/mL，為初始發(fā)酵培養(yǎng)酶活的17.2倍，因此培養(yǎng)時間應(yīng)為6 d。絲狀真菌發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶要經(jīng)孢子萌發(fā)，菌絲生長，產(chǎn)酶三個階段。培養(yǎng)24 h時，鏡檢觀察到孢子開始萌發(fā)生成菌絲，此時開始產(chǎn)生少量的葡萄糖氧化酶。隨著培養(yǎng)時間的增長，菌絲體量增加，菌體內(nèi)的活性氧水平升高，菌體合成葡萄糖氧化酶的速度加快［13］，到第6 d產(chǎn)酶量達(dá)到峰值。第7 d后鏡檢觀察菌絲開始大量斷裂，表明菌體生長進(jìn)入衰亡期。

3　結(jié)論與討論

目前針對葡萄糖氧化酶的研究主要集中在黑曲霉來源的酶，由于黑曲霉分泌機制的限制，大部分的酶都存在于菌絲體中，需要依賴菌體破碎或添加表面活性劑提取酶液［14］。而青霉屬來源的葡萄糖氧化酶屬于胞外酶，更易于分離，減少純化步驟［20］，其中產(chǎn)黃青霉的安全性得到一系列相關(guān)研究的證實，表明其具有很好的應(yīng)用前景。

圖10　培養(yǎng)時間對產(chǎn)黃青霉A4產(chǎn)酶的影響Fig.10　Effect of culture temperature on GOD production by P.chrysogenum A4

本研究通過單因素和正交實驗研究了發(fā)酵培養(yǎng)基的組分和發(fā)酵條件對產(chǎn)黃青霉A4產(chǎn)葡萄糖氧化酶能力的影響并予以優(yōu)化，得到最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基成分組合為：葡萄糖10%、麥芽浸粉0.5%、NaNO31.7%，此時酶活可達(dá)13.03 U/mL，是初始培養(yǎng)基中發(fā)酵酶活的13倍，其中通過優(yōu)化NaNO3的添加量將酶活提高了12倍，在黑曲霉的發(fā)酵優(yōu)化研究中未見相關(guān)報道，可能是由于產(chǎn)黃青霉的氧化代謝水平受硝酸根的影響顯著。在此基礎(chǔ)上得到的最優(yōu)發(fā)酵條件為：接種1 mL孢子懸浮液到50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃的條件下培養(yǎng)6 d，又將酶活提高了1.3倍，達(dá)到17.2 U/mL，為初始酶活的17.2倍。

本研究的菌株產(chǎn)黃青霉A4為野外環(huán)境篩選獲得的原始菌株，培養(yǎng)基中不添加表面活性劑，減少了發(fā)酵過程胞外雜蛋白的產(chǎn)生，張婷研究的黑曲霉經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化后酶活為6.27 U/mL［15］，A4經(jīng)發(fā)酵上清液的酶活經(jīng)優(yōu)化后已達(dá)到17.2 U/mL，后期可以利用誘變，構(gòu)建基因工程菌等方式進(jìn)一步提高酶活。

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Optimization of medium components and fermentation condition for extracellular glucose oxidase production by Penicillium chrysogenum A4

WANG Zhou-yuan，BIE Xiao-mei，LV Feng-xia，ZHAO Hai-zhen，LU Zhao-xin*
（College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

Effects of different kinds of carbon source，organic nitrogen source and inorganic nitrogen source in medium on extracellular glucose oxidase（GOD）production by Penicillium chrysogenum A4 were studied by single-factor tests，respectively.The addition amount of glucose，malt extract and NaNO3were optimized by orthogonal test.Results showed that the optimal addition amounts were as follow：glucose 10%，malt extract 0.5%，NaNO31.7%.Based on the medium with the optimal components，the culture condition was also studied. Results showed that the optimal fermentation condition was as follow：1 mL spore suspension was incubated in 50 mL of culture medium and 30℃for 6 days.The glucose oxidase activity was 17.2 U/mL and 17.2 times that of initial enzyme activity.

Penicillium chrysogenum；glucose oxidase；culture medium；fermentation condition；optimization

TS201.2

A

1002-0306（2015）16-0217-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.036

2014－11－03

王周圓（1991-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：2013108030@njau.edu.cn。

陸兆新（1957-），男，博士，教授，研究方向：酶工程、食品微生物、農(nóng)產(chǎn)品加工，E-mail：fmb@njau.edu.cn。