高壓結(jié)合熱處理對豬肉中過氧化氫酶活性的影響

孫　娟，黃業(yè)傳，王艷榮

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621010）

高壓結(jié)合熱處理對豬肉中過氧化氫酶活性的影響

孫娟，黃業(yè)傳*，王艷榮

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621010）

為研究不同壓力（200～600 MPa）結(jié)合不同熱處理溫度（30～50℃）和處理時(shí)間（10～30 min）后對豬肉中過氧化氫酶（CAT）活性的影響，以豬背最長肌為實(shí)驗(yàn)原料，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：壓力和溫度是影響CAT活性的最顯著因素，壓力和溫度及壓力和保壓時(shí)間對CAT活性的影響均有極顯著交互作用（p＜0.01），且影響CAT活性的臨界溫度隨壓力的升高呈線性下降趨勢，影響CAT活性的臨界保壓時(shí)間隨壓力的升高呈線性上升趨勢。CAT活性最高的處理?xiàng)l件是600 MPa、30℃、10 min，其活性為1.679 U/mg prot。

高壓，熱處理，豬肉，過氧化氫酶活性

上世紀(jì)初日本發(fā)明了現(xiàn)代意義上的第一臺(tái)高壓設(shè)備并應(yīng)用于果醬等食品的滅菌處理上，標(biāo)志著高壓技術(shù)應(yīng)用于食品加工的開端［1］。超高壓能破壞蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，使氫鍵、二硫鍵和離子鍵等非共價(jià)鍵發(fā)生斷裂，改變蛋白質(zhì)性質(zhì)，達(dá)到抑制或殺滅食品中有害微生物和酶的目的，能最大限度的延長食品保質(zhì)期。高壓還能改善食品本身的特性，如營養(yǎng)、風(fēng)味、嫩度、凝膠性［2］等。與傳統(tǒng)的熱處理方式相比，高壓處理則是一種冷殺菌技術(shù)，對食品的營養(yǎng)和感官品質(zhì)破壞更?。?］，能很好地保持食物的色、香、味和營養(yǎng)成分，還能改善食物的某些性質(zhì)，如改變?nèi)獾哪鄱龋?-5］、影響肉的色澤［6-10］等。但高壓處理也會(huì)產(chǎn)生對食品品質(zhì)不利的因素，如在一定壓力下處理肉制品能加快肉中肌內(nèi)脂肪氧化，從而導(dǎo)致肉制品品質(zhì)敗壞［11］，并且導(dǎo)致脂肪氧化［12-13］產(chǎn)生游離自由基［14］，影響肉質(zhì)品安全性，對人體健康造成一定的威脅。

動(dòng)物肌肉中的脂肪氧化酶、脂肪酶等能加速脂肪氧化或降解，產(chǎn)生的自由基能夠促使疾病的發(fā)生和機(jī)體的衰老［15-16］，而抗氧化酶可以清除自由基，能夠抑制或者減緩脂肪氧化，起到維持肉品品質(zhì)的作用。過氧化氫酶（CAT）廣泛存在于需氧微生物及動(dòng)植物的主要組織中，它的主要作用就是催化過氧化氫分解為水與分子氧，減少過氧化氫對機(jī)體的損害，起到保護(hù)細(xì)胞的作用［17］。超高壓對酶的作用效果一方面是較低的壓力能激活一些酶，使酶的活性增加；另一方面較高壓力可導(dǎo)致酶完全失活。一般對高壓結(jié)合低溫處理殺滅肉制品中一些耐壓微生物的研究較多［18-22］，但有關(guān)高壓結(jié)合熱處理對肉品中過氧化氫酶活性影響的報(bào)道卻很少［23］，高壓結(jié)合熱處理對CAT活性是否有顯著影響，有必要進(jìn)行研究。

本研究以豬肉背最長肌中CAT活性為測定指標(biāo)，研究壓力（200～600 MPa）結(jié)合溫度（30～50℃）處理10～30 min對豬肉中CAT活性的影響，為高壓結(jié)合熱處理在肉制品中的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

土豬購于四川綿陽市青義鎮(zhèn)青義市場，6～8個(gè)月月齡，體重80～110 kg，早上宰殺，取新鮮背最長肌；氯化鈉四川成都市聯(lián)合化工試劑研究所，分析純；CAT可見光試劑盒江蘇南京建成生物工程研究所。

HPP.L2-800/1型食品高壓設(shè)備天津華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司；DZ400-DZ（2L）型真空封裝機(jī)四川成都瑞昌儀器制造有限公司；TDL-60B型低速臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；FSH-2A型可調(diào)高速勻漿器金壇市金玻實(shí)驗(yàn)儀器廠；HH4型數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇常州澳華儀器有限公司；UV1000型單光束紫外可見分光光度計(jì)上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1材料選取買市售同一頭豬的新鮮背最長肌約4 kg，快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，去掉表面可見脂肪、筋膜及結(jié)締組織，切成長寬高約1 cm左右的小塊，迅速混合均勻后按每份10 g左右分裝于透明聚乙烯包裝中，實(shí)驗(yàn)室條件下利用真空封裝機(jī)封裝，封裝后的樣品馬上進(jìn)行高壓處理或冷凍備用。

將真空包裝且解凍24 h后的豬肉樣品按照設(shè)定的壓力、溫度和時(shí)間進(jìn)行處理，經(jīng)處理的樣品立即置于4℃冷藏待測，每組處理設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。超高壓設(shè)備的工作參數(shù)為：壓力范圍0～800 MPa，升壓速度約為50 MPa/s，卸壓速度約為100 MPa/s?？岫刘プ鳛楦邏禾幚淼膫鲏航橘|(zhì)。

1.2.2CAT活性測定取3 g左右高壓處理后的豬肉組織，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)所確定的最佳取樣濃度10%制備上清液，根據(jù)過氧化氫酶試劑盒說明，在405 nm處測定吸光值，再通過吸光值及蛋白質(zhì)含量計(jì)算出CAT的活力。根據(jù)試劑盒說明，將CAT活力定義為每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol的H2O2為1個(gè)酶活性單位（U）。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室及設(shè)備能達(dá)到的實(shí)驗(yàn)條件對單因素實(shí)驗(yàn)水平行進(jìn)設(shè)計(jì)。

1.2.3.1溫度對CAT活性影響的研究在預(yù)備實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，750 MPa，10min以及20、30、40、45、50、55、60℃處理豬肉組織后立即測酶活。

1.2.3.2壓力對CAT活性影響的研究用200、400、500、600、650、700、750 MPa在50℃條件下處理豬肉組織10 min后立即測定CAT活性。

1.2.3.3時(shí)間對CAT活性影響的研究在650 MPa、50℃條件下將豬肉組織處理0、5、10、15、20、25、30 min后立即測CAT活性。

1.2.4響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上以壓力、溫度、保壓時(shí)間為實(shí)驗(yàn)自變量，CAT活性為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.1中的Central Composite Design響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)程序進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)［24］，設(shè)計(jì)得到實(shí)驗(yàn)組數(shù)為20，其中包括6個(gè)0水平點(diǎn)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels of RSM experiment

1.3統(tǒng)計(jì)方法

所有酶活測定結(jié)果利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用最小二乘法進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸統(tǒng)計(jì)分析，其基本模型如下：

Y=β0+∑βiXi+∑βiiXii2+∑βijXiXj

式中：β0，βi，βii，βij是回歸系數(shù)；Xi，Xj代表不同自變量；Y代表響應(yīng)變量CAT的活性。

2　結(jié)果與分析

2.1溫度對CAT活性的影響

不同溫度對CAT活性的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1　溫度對CAT活性的影響Fig.1　Effect of temperature on CAT activity

從圖1中可以看出用超高壓750 MPa、處理10 min的條件下CAT活性隨著溫度的升高先降低后升高，出現(xiàn)了激活現(xiàn)象，激活臨界值約為50℃左右；在20～50℃范圍內(nèi)，隨溫度升高CAT活性基本呈直線降低趨勢；從50℃以后隨著溫度的升高CAT的活性又開始急劇地升高（p＜0.01）。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是在超高壓750 MPa處理豬肉時(shí)，豬肉組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了極大破壞，使得部分CAT活性有所降低，當(dāng)CAT全部暴露出后在適宜的溫度范圍CAT活性又增加。有關(guān)高壓結(jié)合熱處理對CAT活性影響的研究幾乎沒有，所以無法對比其他學(xué)者的研究結(jié)果。溫度對CAT活性可能有激活現(xiàn)象，激活機(jī)理有待進(jìn)一步研究。酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度對酶活性的影響主要包括兩方面：一方面隨著溫度的升高，酶的活性逐漸增大，因?yàn)樯邷囟饶軌蚣せ蠲傅拇呋钚?，使酶的活性升高；另一方面繼續(xù)升高溫度酶會(huì)變性失活，使得酶的活性逐漸降低。

2.2壓力對CAT活性的影響

不同壓力對CAT活性的影響情況如圖2所示。

圖2　壓力對CAT活性的影響Fig.2　Effect of pressure on CAT activity

由圖2可以看出50℃、10 min處理?xiàng)l件下，隨著壓力的增大，CAT活性呈線性降低趨勢，700 MPa時(shí)CAT活性降到最低，但沒有完全失活。由圖1的結(jié)果可知50℃時(shí)CAT活性最低，當(dāng)處理壓力由200 MPa增加至700 MPa時(shí)，CAT結(jié)構(gòu)受到壓力的不可逆破壞，其活性逐漸降低。700 MPa以上處理CAT幾乎全部失活。很多有關(guān)高壓的研究是基于對肉制品感官性狀和脂肪氧化的研究，對CAT活性的研究幾乎沒有，如Sato等研究認(rèn)為，不同形式的處理過程如絞碎、加熱、高壓等都會(huì)引起肉類肌纖維膜系統(tǒng)的破壞，將導(dǎo)致易氧化的脂類成分曝露于空氣中，與氧氣充分結(jié)合，從而加速了脂肪氧化［25］。

有研究報(bào)道高壓處理會(huì)影響抗氧化酶的活性，如Serra發(fā)現(xiàn)豬肉原料600 MPa高壓處理后進(jìn)行火腿加工，抗氧化酶的活性會(huì)降低，但成品火腿中仍能檢測到較高的酶活［25］；Clariana發(fā)現(xiàn)400 MPa壓力處理火腿時(shí)超氧化物歧化酶的活性會(huì)增加，而600 MPa對火腿中抗氧化酶活性影響不大［26］。

2.3時(shí)間對CAT活性的影響

圖3顯示不同保壓時(shí)間對CAT活性的影響情況。

由圖3可知，650 MPa、50℃處理?xiàng)l件下，在0～10 min保壓時(shí)間之內(nèi)，CAT活性隨著保壓時(shí)間的增加呈先增強(qiáng)后降低趨勢。因?yàn)樵?0℃溫度處理下隨著時(shí)間的增加CAT活性逐漸增加，同時(shí)高壓條件破壞了豬肉的結(jié)構(gòu)組織，細(xì)胞外CAT活性降低；10 min后，隨著保壓時(shí)間的繼續(xù)增加，壓力破壞了組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使得胞內(nèi)的CAT充分釋放出來，CAT活性隨即增加，其最高活性低于10 min前的最高活性但沒有完全失活，所以其活性呈先升高后趨于穩(wěn)定的趨勢。Chenh研究發(fā)現(xiàn)原料肉中過氧化氫酶活性被抑制后，貯藏期間脂肪氧化明顯增加［27］。

圖3　保壓時(shí)間對CAT活性的影響Fig.3　Effect of holding time on CAT activity

2.4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1建立回歸模型及顯著性分析響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　響應(yīng)面方案及響應(yīng)值Table 2　Program of RSM and response value

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件，對表2中的酶活數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可得到關(guān)于CAT活性（Y）對壓力、溫度以及保壓時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程，其表達(dá)式如下：

Y=-2.290+6.986×10-3A+0.129B+0.020C-1.514× 10-4AB-8.306×10-5AC-1.713×10-4BC-2.837×10-7A2-1.149×10-3B2+3.532×10-3C2

回歸模型方程的方差分析結(jié)果見表3。

由表3響應(yīng)曲面二次回歸模型方差分析可知，本回歸模型的顯著性（F檢驗(yàn)）檢驗(yàn)結(jié)果極顯著（p＜0.01），失擬性檢驗(yàn)結(jié)果不顯著（p＞0.05），決定系數(shù)（R2）和校正決定系數(shù)（R2Adj）分別為0.9792和0.9415，信噪比（Adeq Precision）為24.221，大于臨界值4，這些結(jié)果證明本回歸模型擬合效果較好、可靠性高，可充分地反映各變量之間的關(guān)系，能夠進(jìn)一步用于分析壓力、溫度以及保壓時(shí)間對CAT活性的交互作用以及對CAT活性進(jìn)行預(yù)測。

回歸模型中各因素對CAT活性影響的顯著性情況由表3可知：一次項(xiàng)A（壓力）、B（溫度）對CAT活性的影響都是極顯著（p＜0.01）的，C（保壓時(shí)間）對CAT活性的影響是顯著的（p＜0.05）。而所有二次項(xiàng)中只有因素B2對CAT活性的影響是極顯著的（p＜0.01），因素A2和因素C2對CAT活性的影響不顯著。交互項(xiàng)AB與AC對CAT活性有極顯著影響（p＜0.01），但BC的交互作用對CAT活性影響不顯著。

響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)中評價(jià)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)因素對響應(yīng)變量交互作用的方法主要是根據(jù)回歸模型繪制響應(yīng)曲面，通過它們的形狀可以反映出兩實(shí)驗(yàn)因素交互作用的顯著情況［28］。

表3　響應(yīng)曲面二次回歸模型方差分析結(jié)果Table 3　ANOVA results for response surface quadratic model

2.4.2壓力和溫度對CAT活性的交互作用圖4顯示了固定保壓時(shí)間C為20 min時(shí)，壓力和溫度對CAT活性的交互影響情況。

從圖4可以看出壓力和溫度對CAT活性的影響具有明顯的交互作用。時(shí)間固定在20 min，處理溫度不變時(shí)，CAT活性隨壓力的增加而減小。處理壓力不變時(shí)，隨著溫度的升高，CAT活性先增大后減小，因此存在溫度臨界值。當(dāng)處理壓力為200 MPa時(shí)，溫度的臨界值在40℃左右；當(dāng)處理壓力增加到280 MPa時(shí)，溫度臨界值在35℃左右；壓力繼續(xù)增加到360 MPa時(shí)，溫度臨界值約為30℃，說明升高處理壓力能減小使CAT活性值變化的臨界溫度。

2.4.3壓力和時(shí)間對CAT活性的交互作用圖5顯示了固定溫度時(shí)壓力和保壓時(shí)間對CAT活性具有明顯的交互作用。

圖4　壓力和溫度對CAT活性交互影響的響應(yīng)曲面Fig.4　Response surface of the interactive effect of pressure and temperature on CAT activity

圖5　壓力和時(shí)間對CAT活性交互影響的響應(yīng)曲面Fig.5　Response surface of the interactive effect of pressure and time on CAT activity

溫度固定在40℃，保壓時(shí)間不變時(shí)，CAT活性隨壓力的增加而減小，這與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。當(dāng)處理壓力不變時(shí)，隨著保壓時(shí)間的延長，CAT活性先減小后增大，這與保壓時(shí)間對CAT活性影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，因此存在時(shí)間臨界值。當(dāng)處理壓力為280 MPa時(shí)，處理時(shí)間臨界值約為15 min；當(dāng)處理壓力增加到360 MPa時(shí)，時(shí)間臨界值是23 min左右；壓力繼續(xù)增加到440 MPa時(shí)，時(shí)間臨界值約在30 min，說明升高處理壓力能增加使CAT活性值變化的臨界保壓時(shí)間。

為了得到高壓結(jié)合熱處理豬肉過程中CAT活性最佳的處理?xiàng)l件，對模型的二次多項(xiàng)回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)并令其等于零，求解得到CAT活性最佳的處理?xiàng)l件為600 MPa，30℃，10 min，代入回歸方程得到此處理?xiàng)l件下CAT的理論活性為1.914 U/mg prot。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化后的高壓結(jié)合熱處理?xiàng)l件600 MPa，30℃，10 min進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)測豬肉中CAT平均酶活為1.679 U/mg prot，與理論酶活值相比低了0.235 U/mg prot，說明利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到高壓結(jié)合熱處理豬肉中過氧化氫酶活性的條件參數(shù)比較準(zhǔn)確，具有一定的實(shí)用參考意義。

3　結(jié)論

在高壓結(jié)合熱處理豬肉過程中，壓力和溫度、壓力和保壓時(shí)間對CAT活性的影響有極顯著（p＜0.01）交互作用。壓力和保壓時(shí)間一定的情況下，CAT活性隨著溫度的升高先降低后增加；溫度和保壓時(shí)間一定的情況下，CAT活性隨著壓力的升高而減?。粶囟群蛪毫σ欢ǖ那闆r下，CAT活性隨著保壓時(shí)間的延長呈波動(dòng)趨勢，先減小再增大后趨于穩(wěn)定。由響應(yīng)面得到高壓結(jié)合熱處理豬肉的最優(yōu)參數(shù)是600 MPa，30℃，10 min，最優(yōu)參數(shù)下的酶活為1.679 U/mg prot。由于在肉制品的高壓處理過程中，多種處理因素同時(shí)起作用，因此研究它們的交互作用對高壓結(jié)合熱處理豬肉組織后CAT的活性的影響及酶活性的變化規(guī)律有著非常重要的指導(dǎo)意義，也為進(jìn)一步探究豬肉的脂肪氧化與抗氧化酶活性的變化規(guī)律及兩者的關(guān)系奠定一定的理論基礎(chǔ)。

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Effect of high pressure combined thermal treatment on catalase activity of pork

SUN Juan，HUANG Ye-chuan*，WANG Yan-rong
（College of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China）

In order to study the effect of different test conditions（200～600 MPa，10～30 min and 30～50℃）on the catalase（CAT）activity of pork.Use longissimus muscle as experimental materials and a response surface method（RSM）was applied on the basis of the analysis of the single factor experimental results.The results of RSM showed that pressure and temperature were the most significant factors on the CAT activity.Pressure and temperature as well as pressure and holding time had significant（p＜0.01）interactive on CAT activity，while the critical temperatures influencing the activity of CAT linearly decreased with pressure increasing and the critical holding time influencing the activity of CAT linearly increased with pressure increasing.The highest CAT activity processing conditions was 600 MPa，30℃，10 min，and its activity was 1.679U/mg prot.

high pressure；thermal treatment；pork；catalase activity

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0208-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.034

2014-12-03

孫娟（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：化學(xué)工程，E-mail：631160547@qq.com。

黃業(yè)傳（1975-），男，博士，副教授，研究方向：肉制品加工與酶工程，E-mail：hyc2005@sina.com。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31271892）；西南科技大學(xué)博士基金（12zx7110）。