淡水魚腸道中抗芽孢桿菌性乳酸菌的篩選與鑒定

繆璐歡，杜靜芳，馬歡歡，呂欣然，李　瑩，白鳳翎，儀淑敏，勵建榮

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013）

淡水魚腸道中抗芽孢桿菌性乳酸菌的篩選與鑒定

繆璐歡，杜靜芳，馬歡歡，呂欣然，李瑩，白鳳翎*，儀淑敏，勵建榮

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013）

從淡水魚腸道中篩選對芽孢桿菌具有較強(qiáng)拮抗活性的乳酸菌，結(jié)果表明：從鯉魚腸道分離的菌株LY-19對蠟樣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的抑菌直徑分別為16.89 mm和17.43 mm，活性主要來自無細(xì)胞上清液，在pH3.0～4.5范圍內(nèi)保持抗菌活性，經(jīng)中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶處理后喪失部分抑菌活性，對α-淀粉酶不敏感，在40～121℃范圍內(nèi)處理30 min后其拮抗活性基本不變，初步判定乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)為II型非糖基化類細(xì)菌素。根據(jù)生理生化特性和16S rDNA鑒定為清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）。

淡水魚腸道，乳酸菌，拮抗，芽孢桿菌，鑒定

芽孢桿菌在不利條件下能夠形成具有特殊抵抗力的芽孢，污染食品后因具有耐熱性而易殘留，其中嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）和地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）是導(dǎo)致食品腐敗的主要因素［1］。儀淑敏等［2］研究發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）是冷藏金線魚魚丸中的優(yōu)勢腐敗菌，Rahmati等［3］研究表明海產(chǎn)品中存在導(dǎo)致食源性疾病的蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）。我國相關(guān)食品的標(biāo)準(zhǔn)中并沒有明確蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）的殘留限量值，愛爾蘭對其在碎肉卷、丸狀肝灌腸和煙熏魚中的殘留限量有明確的規(guī)定：滿意值＜102CFU/g，臨界值103～104CFU/g，不滿意值104～105CFU/g，大于105CFU/g時不可接受［4］。

對水產(chǎn)品而言，控制食品中芽孢桿菌的傳統(tǒng)方法明顯存在不足，物理法會影響產(chǎn)品的品質(zhì)，化學(xué)法則存在一定的殘留安全隱患。比較而言，生物防腐具有無損無毒的特點(diǎn)，可提高食品的安全性與穩(wěn)定性，是控制食品中芽孢桿菌的最佳選擇。乳酸菌（lacticacid bacteria，LAB）通過生態(tài)位競爭、形成酸性環(huán)境和產(chǎn)生拮抗性代謝產(chǎn)物等方式較好地控制食品中的腐敗和致病微生物［5］，細(xì)菌素如乳酸鏈球菌素能有效殺死或抑制引起食品腐敗的革蘭氏陽性菌，如肉毒桿菌（Clostridium botulinum）、單增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）等［6］。Yang等［7］研究表明在米粉發(fā)酵中通過添加乳酸菌可有效抑制蠟樣芽孢桿菌菌株YSP-A3-2的生長。Mentes等［8］從酵頭中分離的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LMO25和食品乳桿菌（L.alimentarius）LMO7在全麥面包中具有抑制地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）的活性。水產(chǎn)品中致病菌主要來自環(huán)境、加工過程中污染以及本身固有的天然細(xì)菌類群，包括單增李斯特氏菌（L.monocytogenes）、沙門氏菌（Salmonella sp.）、埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和致病性弧菌等［9］。Robertson等［10］從大西洋鮭魚中分離1株肉食桿菌（Carnobacterium sp.），研究發(fā)現(xiàn)它對殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）、弧菌（Vibrio sp.）和魯氏耶爾森菌（Yersinia ruckeri）等魚類致病菌具有抑制作用。發(fā)酵乳制品、泡菜、發(fā)酵香腸、酵頭和發(fā)酵魚制品等都是拮抗性乳酸菌的重要來源，非發(fā)酵食品如魚腸道也是拮抗魚類致病菌乳酸菌的棲息地［11-16］。本文從淡水魚腸道中分離篩選對芽孢桿菌具有拮抗活性的乳酸菌，從中篩選熱穩(wěn)定性菌株，為控制水產(chǎn)品中芽孢桿菌引起的腐敗和食源性疾病奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鯽魚、鯉魚、鰱魚、草魚、鳙魚和鏡鯉錦州市水產(chǎn)市場；地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）ACCC 11091中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）CMCC 63301中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心；MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基北京奧博星生物技術(shù)有限公司；胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和α-淀粉酶華藍(lán)化學(xué)有限公司；乳酸菌生化鑒定管杭州天和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、DNA marker-D、Taq PCR Master Mix上海生工生物工程有限公司。

DL-CJ-2N型超級潔凈工作臺東聯(lián)哈爾（北京）儀器制造有限公司；LRH系列生化培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MOTIC BA300數(shù)碼顯微鏡日本麥克奧迪（MOTIC）；5804R冷凍高速離心機(jī)、PCR儀德國Eppendorf公司；Quantity one凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司；GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋致微（廈門）儀器有限公司；IKA Vortex GENIUS 3振蕩器德國IKA公司；水系針筒過濾器上海興亞凈化材料廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1乳酸菌菌株分離在無菌條件下，分別刮取鯽魚、鯉魚、鰱魚、草魚、鳙魚、鏡鯉腸粘膜及內(nèi)容物10 g置于90 mL滅菌生理鹽水中，應(yīng)用IKA Vortex GENIUS 3振蕩器充分振蕩5 min后在1%CaCO3的MRS培養(yǎng)基劃線接種，37℃培養(yǎng)48 h。挑取有溶鈣圈的白色菌落進(jìn)一步分離純化，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)。

1.2.2拮抗性乳酸菌菌株篩選分別取分離菌株24 h MRS培養(yǎng)液10.0 mL，經(jīng)8000 r/min 4℃離心5 min的菌體溶于10 mL無菌生理鹽水中，取上清液用0.45 μm濾器過濾獲得無細(xì)胞上清液（cell-free supernatants，CFS），參照文獻(xiàn)［17］利用牛津杯打孔法對供試菌株B.licheniformis ACCC 11091和B.cereus CMCC 63301進(jìn)行拮抗性實(shí)驗(yàn)，其中供試菌株菌液濃度為106CFU/mL，篩選對芽孢桿菌具有拮抗活性的菌株。

1.2.3乳酸菌無細(xì)胞提取物抗菌作用研究酶活性測定［18-19］：將乳酸菌CFS調(diào)至pH7.0，分別加入中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和α-淀粉酶，使終濃度為1 mg/mL；將乳酸菌CFS調(diào)pH2.0，加入胃蛋白酶，使終濃度為1 mg/mL。在37℃水浴中孵育2 h，調(diào)pH與乳酸菌CFS相同，按1.2.2方法測定拮抗活性。

pH耐受性測定：用1 mol/L HCl調(diào)MRS液體培養(yǎng)基至與乳酸菌CFS分別相同的pH，用1 mol/L HCl或NaOH將乳酸菌CFS分別調(diào)節(jié)pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，按1.2.2方法測定拮抗活性。

熱穩(wěn)定性測定：對乳酸菌CFS分別在40、60、80、100、121℃條件下處理30 min后，按1.2.2方法測定拮抗活性。

1.2.4乳酸菌菌株鑒定生理生化鑒定：對篩選的乳酸菌菌株參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定［20-21］。

分子生物學(xué)鑒定：取對數(shù)期的乳酸菌培養(yǎng)物，DNA快速抽提試劑盒提取DNA。通用引物為：27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACGG YTACCTTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：上下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，Taq PCR Master Mix 12.5 μL，超純水9.5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃2 min，94℃1 min，60℃1 min，72℃90 s，循環(huán)30次，4℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序序列登陸GenBank進(jìn)行BLAST同源性比較，應(yīng)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

應(yīng)用SPSS12.0分析數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示,用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)(%)表示,率的比較采用)X2檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.5實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件進(jìn)行分析處理。

2　結(jié)果與討論

2.1菌株分離

從鯽魚、鯉魚、鰱魚、草魚、鳙魚和鏡鯉腸道中共分離獲得137個菌落，經(jīng)革蘭氏染色和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)初步鑒定出44株乳酸菌，純化后按來源和挑取順序命名。

2.2拮抗性乳酸菌菌株篩選

從44株乳酸菌中篩選出21株對B.cereus CMCC 63301和B.licheniformis ACCC 11091具有拮抗作用的乳酸菌，圖1中A圖是菌株LY-19的菌體和CFS對106CFU/mL B.cereus CMCC 63301的抑菌效果圖，可以看出CFS具有明顯的抑菌作用，菌體沒有拮抗活性。圖1中B圖是菌株LY-19和LY-7的CFS對106CFU/mL B.licheniformis ACCC 11091的抑菌作用結(jié)果，可以看出水平方向菌株LY-19的抑菌圈明顯，而垂直方向的菌株LY-7沒有抑菌活性。

圖1　乳酸菌菌體及CFS對蠟樣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的拮抗作用Fig.1　Antagonistic effects of LAB on B.cereus CMCC 63301 and B.licheniformis ACCC 11091

表1是21株乳酸菌CFS對B.cereus CMCC 63301和B.licheniformis ACCC 11091的拮抗作用結(jié)果，從中可以看出，菌株LY-19、LY-21、JY-22、JL-18對芽孢桿菌的拮抗作用較強(qiáng)，其中，4株菌對B.cereus CMCC 63301和B.licheniformis ACCC 11091的平均抑菌直徑分別為16.89 mm和16.47 mm，菌株LY-19的抑菌直徑分別為16.89 mm和17.43 mm，因此，選擇菌株LY-19進(jìn)行抑菌活性研究。

2.3拮抗作用研究

2.3.1酶對抑菌活性的影響菌株LY-19 CFS經(jīng)中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶處理后的抑菌結(jié)果見表2，從中可以看出拮抗活性均有不同程度下降，與CFS存在顯著性差異（p＜0.05），其中對木瓜蛋白酶的敏感性最高，對B.cereus CMCC 63301和B.licheniformis ACCC 11091抑制活性分別降低了12.55%和29.03%，對蛋白酶敏感表明該抑菌活性物質(zhì)是蛋白質(zhì)［22］。而經(jīng)α-淀粉酶處理的拮抗活性基本不變，表明該菌株的抑菌物質(zhì)為非糖基化類蛋白質(zhì)［19］。因此，可初步判斷菌株LY-19形成的拮抗物質(zhì)可能是乳酸菌素。

表1　淡水魚腸道中乳酸菌CFS對芽孢桿菌的拮抗作用Table 1　Antagonistic effects against Bacillus spp.of LAB CFS from freshwater fish intestinal

表2　酶處理對菌株LY-19拮抗芽孢桿菌活性的影響Table 2　Effect of proteases treatment on the antagonistic activity of strain LY-19 CFS against Bacillus spp.

表3　pH對菌株LY-19拮抗芽孢桿菌活性的影響Table 3　Effect of pH on the antagonistic activity of strain LY-19 CFS against Bacillus spp.

2.3.2pH對抑菌活性的影響表3是LY-19 CFS在不同pH條件下對芽孢桿菌的拮抗結(jié)果，從中可以看出，與CFS（pH3.8）相比對兩株芽孢桿菌的拮抗作用隨著pH升高而逐漸下降，當(dāng)上升至pH5.0時，抑菌圈消失。當(dāng)pH低于3.8時，其抑菌效果高于CFS，表明其抑菌作用來自CFS和酸性物質(zhì)的疊加效應(yīng)；當(dāng)pH高于3.8時，由于pH升高減弱了CFS中抑菌物質(zhì)的活性，可能由于該抑菌物質(zhì)在酸性條件下比較穩(wěn)定［23］。同時也表明，LY-19的抑菌活性不只來源于乳酸菌的酸性代謝產(chǎn)物。Campos等［24］報道了來自大菱鲆的乳酸菌是通過產(chǎn)生細(xì)菌素抑制病原菌單增李斯特氏菌（L.monocytogenes）和金黃色葡萄球菌（St.aureus）的生長，而非乳酸或乙酸等有機(jī)酸的作用結(jié)果。

2.3.3熱處理對抑菌活性的影響圖2為菌株LY-19 CFS經(jīng)40、60、80、100、121℃加熱處理30 min后的抑菌活性變化情況，從中可以看出，熱處理后的CFS抑菌活性變化不大。其中，經(jīng)121℃處理30min對B.cereus CMCC 63301的抑制活性稍有下降，而對B.licheniformis ACCC 11091的抑制活性基本不變。Chahad等［25］從鱸魚和海鯉中分離的乳酸菌對肉食桿菌（Carnobacterium sp.）、芽孢桿菌（Bacillus sp.）和單增李斯特氏菌（L.monocytogenes）等致病菌具有拮抗活性，經(jīng)熱處理后仍具有抑菌活性，經(jīng)鑒定其活性物質(zhì)為Ⅱ型乳酸菌素，與本文研究結(jié)果相符。

圖2　熱處理對菌株LY-19拮抗芽孢桿菌活性的影響Fig.2　Effect of thermal treatment on the antagonistic activity of strain LY-19 CFS against Bacillus spp.

2.4菌株鑒定

生理生化鑒定：對菌株LY-19的生理生化鑒定結(jié)果見表4，查閱文獻(xiàn)［20-21］可初步斷定菌株為清酒乳桿菌（Lb.sakei）。

表4　菌株LY-19的生理生化鑒定結(jié)果Table 4　Physiological and biochemical test results of strain LY-19

分子生物學(xué)鑒定：圖3是菌株LY-19的16S rDNA基因擴(kuò)增電泳圖，從圖3中可以看到在1500 bp處出現(xiàn)特異性亮帶，表明目標(biāo)片段被成功擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將菌株測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。從圖4中可以看出，菌株LY-19與Lb.sakei（KJ 560867、KJ 531395和KJ 812206）在同一個分支上，同源性為100%，因此結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果，確定菌株LY-19為清酒乳桿菌（Lb.sakei）。

圖3　菌株LY-19的16S rDNA基因擴(kuò)增電泳圖Fig.3　PCR amplification of 16S rDNA gene of strain LY-19

圖4　菌株LY-19的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4　The phylogenetic tree for sequences of strain LY-19

3　結(jié)論

從淡水鯉魚腸道中分離出一株對蠟樣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌具有拮抗活性的乳酸菌LY-19，通過形態(tài)學(xué)、生理生化分析和16S rDNA序列測定，鑒定該菌株為清酒乳桿菌（Lb.sakei）。菌株LY-19 CFS的抑菌活性在酸性條件下比較穩(wěn)定，經(jīng)蛋白酶處理可降低抑菌作用，對121℃熱處理十分穩(wěn)定，初步判定該菌株的抑菌物質(zhì)為非糖基化類的乳酸菌素類物質(zhì)。

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Screening and identification of lactic acid bacteria with antagonistic Bacillus spp.derived from freshwater fish intestine

MIAO Lu-huan，DU Jing-fang，MA Huan-huan，LV Xin-ran，LI Ying，BAI Feng-ling*，YI Shu-min，LI Jian-rong
（College of Food Science and Technology，Bohai University，F(xiàn)ood Safety Key Lab of Liaoning Province，National&Local Joint Engineering Research Center of Storage，Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products，Jinzhou 121013，China）

Lactic acid bacteria（LAB）strains with strong antagonistic activity to Bacillus spp.were isolated from freshwater fish intestine in the study.The results showed that the diameters of inhibiting Bacillus cereus and Bacillus licheniformis by strain LY-19 from carp intestinal were 16.89 mm and 17.43 mm，respectively.The antagonistic activity was mainly from cell-free supernatants（CFS）.The antibacterial activity of CFS kept within pH3.0～4.5，and lowered by treating with neutral protease，pepsin and papain，but was not sensitive to α-amylase. The antagonistic activity remained by thermal treatment from 40℃to 121℃for 30 min.The inhibitory substance of LAB produced was preliminary determined as type II non-glycosylation bacteriocin.Strain LY-19 was identified as Lactobacillus sakei according to physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis.

freshwater fish intestine；lactic acid bacteria；antagonism；Bacillus spp.；identification

TS254.4

A

1002-0306（2015）16-0188-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.030

2014-11-18

繆璐歡（1991-），女，碩士研究生，研究方向：食品質(zhì)量與安全控制，E-mail：miaoluhuan2013@163.com。

白鳳翎（1964-），男，博士，教授，研究方向：食品質(zhì)量與安全控制和食品微生物學(xué)，E-mail：baifling@163.com。

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃課題（2012BAD29B06）；遼寧省高校學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)課題（LT2014024）。