復(fù)合酶解裂壺藻渣制備抗氧化肽的工藝研究

武　瓊，胡　　曉，楊賢慶，*，李來好，吳燕燕，郝淑賢，林婉玲，黃　卉，鄧建朝

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003；2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東廣州510300）

復(fù)合酶解裂壺藻渣制備抗氧化肽的工藝研究

武瓊1，2，胡曉2，楊賢慶2，*，李來好2，吳燕燕2，郝淑賢2，林婉玲2，黃卉2，鄧建朝2

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003；2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東廣州510300）

以提取油脂后的裂壺藻渣為原料采用蛋白酶進(jìn)行酶解，以水解度、蛋白回收率及產(chǎn)物抗氧化活性為指標(biāo)，確定最佳復(fù)合酶解工藝。結(jié)果表明，在pH為7.5，水解溫度為50℃，料水比為1∶12（w/w），加酶量為0.5%（E/S，w/w）條件下，采用復(fù)合蛋白酶與Alcalase 2.4 L復(fù)配方式（1∶1，w/w）酶解裂壺藻渣6 h后的產(chǎn)物水解效果與抗氧化活性均優(yōu)于其他單酶或復(fù)合酶解產(chǎn)物。在此條件下，酶解產(chǎn)物的水解度為11.15%，蛋白回收率為70.82%，羥自由基半抑制濃度IC50為1.656 mg/mL，還原力為1.417（濃度3 mg/mL），具有較好抗氧化活性。

裂壺藻，復(fù)合酶解，抗氧化肽，工藝

裂壺藻（S.limacinum），又名裂殖壺菌，是破囊壺菌科一類單細(xì)胞球形的海洋真菌類微藻。裂壺藻可以在異養(yǎng)條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，可進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。由于不易被氧化，使用沒有污染水質(zhì)的危害。裂壺藻中油脂含量豐富，占細(xì)胞干重的40%以上，其中多不飽和脂肪酸（PUFA）含量高，DHA的含量可高達(dá)50%，還含有豐富的維生素和必需氨基酸等營養(yǎng)成分，裂壺藻及其制品已在水產(chǎn)苗種培育方面引起了廣泛關(guān)注［1］。此外，隨著國內(nèi)外微藻產(chǎn)DHA藻油的成功商業(yè)化生產(chǎn)，其產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用在嬰幼兒配方奶粉、酸奶、餅干、飲料及高端保健食品等多個(gè)方面［2］。裂壺藻作為目前國際公認(rèn)的最佳DHA生產(chǎn)菌種，我國衛(wèi)生部已于2007年將其批準(zhǔn)作為新資源食品以推廣應(yīng)用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，海洋微藻中含有較多的生物活性成分［3-10］。微藻中多肽活性主要表現(xiàn)在抗氧化、抗腫瘤、抗菌及AEC抑制等方面［11-14］。微藻蛋白中蘊(yùn)含較多活性肽段，可以從中進(jìn)一步提取功能活性多肽，為實(shí)際生產(chǎn)生活提供幫助。裂壺藻經(jīng)提取多不飽和脂肪酸后所產(chǎn)生的藻渣中蛋白質(zhì)含量可高達(dá)40%以上，然而目前這些藻渣大多被當(dāng)成飼料或肥料處理，蛋白資源未得到充分開發(fā)與利用。本文以工業(yè)化提取油脂后的裂壺藻渣為原料，以蛋白回收率、水解度及自由基清除率為指標(biāo)，先后利用單酶及多酶復(fù)合酶解的方法尋找制備裂壺藻抗氧化肽的較優(yōu)工藝，以期為工業(yè)提取藻油后的藻渣廢料的高值化利用提供新的思路和方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

脫脂裂壺藻渣（蛋白含量約40%，水分含量約4%）來源于廣東潤科生物工程有限公司；Alcalase 2.4 L蛋白酶丹麥諾維信公司；風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶均購自廣州齊云生物技術(shù)有限公司；鄰二氮菲廣州化學(xué)試劑廠；甲醛溶液、雙氧水、氫氧化鈉、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅、溴甲酚綠、鹽酸、硼酸溶液、乙醇、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、硫酸亞鐵、還原型谷胱甘肽以上試劑均購自廣州齊云生物技術(shù)有限公司，分析純。

DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海一恒；BS 224S型電子精密天平Sartorius；Delta320精密pH計(jì)METTLER TOLEDO；UV2550型紫外可見分光光度計(jì)日本島津；DK-S24型恒溫水浴鍋上海森信實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋常州澳華儀器有限公司；KjeltecTM2300型蛋白自動(dòng)分析儀丹麥FOSS。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1酶解工藝流程稱取10 g藻渣于適當(dāng)體積燒杯中，按不同水料比加水，攪拌均勻，調(diào)節(jié)最適pH，待讀數(shù)穩(wěn)定后酶總量按底物質(zhì)量的0.5%添加，后將燒杯置于水浴鍋恒溫水解。酶解結(jié)束后，將酶解液再置于沸水浴中滅酶處理10 min，之后取出冷卻至室溫，離心，取上清液量取體積，分裝于-20℃冷凍備用。各種蛋白酶分別按照制劑廠家提供的最佳條件進(jìn)行水解，如表1所示。

表1　各蛋白酶酶活及水解條件比較Table 1　The comparison of various enzymatic hydrolysis conditions

為減少實(shí)驗(yàn)復(fù)雜程度，本文首先通過五種不同來源的蛋白酶，在各自最適反應(yīng)條件下分別酶解原料藻渣6 h，從中選出了3種優(yōu)質(zhì)酶類（風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、Alcalase 2.4 L蛋白酶）。將篩選出的三種酶分別進(jìn)行有關(guān)酶解時(shí)間（實(shí)驗(yàn)點(diǎn)為2、4、6、8 h，實(shí)驗(yàn)固定料水比1∶12）、料水比（實(shí)驗(yàn)點(diǎn)為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14，實(shí)驗(yàn)固定酶解時(shí)間6 h）的因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最后再將優(yōu)化后的酶解工藝用以進(jìn)行復(fù)配酶解并與單酶酶解效果進(jìn)行比較，以確定原料最佳的復(fù)配酶解方案。復(fù)配過程中，由于3種優(yōu)質(zhì)酶具有相同的最適反應(yīng)溫度及相似的最適pH，故不需進(jìn)行更復(fù)雜深入的條件優(yōu)化，可直接采用50℃及pH7.5進(jìn)行反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)全程均以水解度、蛋白回收率及酶解物抗氧化活性作為指標(biāo)，判斷反應(yīng)程度及產(chǎn)物活性。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置兩組平行，計(jì)算偏差標(biāo)注誤差線。

復(fù)配酶解（多種酶同時(shí)加入），酶總量按底物質(zhì)量的0.5%添加，兩兩復(fù)配（1∶1，w/w）與三酶復(fù)配（1∶1∶1）的水解效果進(jìn)行比較分析。

1.2.2水解度測定方法采用甲醛電位滴定法［15］測量酶解液中游離氨基態(tài)氮的含量。

水解度（DH）（%）=（酶解液游離氨基氮含量/原料總氮含量）×100

1.2.3蛋白回收率測定方法采用半微量凱氏定氮法［16］分別測定酶解液中總氮含量及原料中總氮含量。

蛋白回收率（P）（%）=（酶解液中總氮含量/原料總氮含量）×100

1.2.4羥自由基清除能力測定參照J(rèn)in等［17］的測定方法并加以修改。損傷管：取0.3 mL 5 mmol/L鄰二氮菲乙醇溶液加入0.2 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）和1 mL去離子水，混勻后加入0.3 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液，混勻再加入0.2 mL 0.1%（V/V）H2O2，37℃水浴60 min，10000 r/min離心10 min后于536 nm測吸光值A(chǔ)j。樣品管：取0.3 mL 5 mmol/L鄰二氮菲乙醇溶液加入0.2 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4），以1 mL樣品溶液代替去離子水，混勻后加入0.3 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液，混勻再加入0.2 mL 0.1%（V/V）H2O2，37℃水浴60 min，10000 r/min離心10 min后于536 nm測吸光值A(chǔ)i?？瞻坠埽喝?.3 mL 5 mmol/L鄰二氮菲乙醇溶液加入0.2 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）和1 mL去離子水，混勻后加入0.3 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液，再加入0.2 mL去離子水代替H2O2混勻，同樣至于37℃水浴60 min，10000 r/min離心10 min后于536 nm測吸光值為A0。每組實(shí)驗(yàn)做兩組平行對照。

清除率計(jì)算公式如下：清除率（%）=（Ai-Aj）/（A0-Aj）×100

對樣品溶液分別做梯度稀釋，測定各自不同濃度下的羥自由基清除率，經(jīng)線性回歸后計(jì)算出自由基清除率為50%時(shí)的樣品酶解液蛋白濃度，即IC50。

1.2.5還原力測定參照Ahmadi等［18］的測定方法并加以修改。取待測樣液1 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀溶液1 mL，0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH6.6）1 mL，混勻后于50℃水浴保溫20 min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸（TCA）1 mL，振蕩混勻后離心（10000 r/mim，10 min）。取上清液1 mL，加入1 mL去離子水和0.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的FeCl3溶液，振蕩混勻后置于50℃保溫10 min，體系變?yōu)樗{(lán)色，再于700 nm下測量吸光值。

2　結(jié)果與分析

2.1五種不同蛋白酶水解條件及效果比較分析

各酶均按各自生產(chǎn)說明的最適反應(yīng)條件以相同料水比水解6 h，其水解效果及產(chǎn)物活性如表2所示。

表2　各蛋白酶酶水解效果比較Table 2　The comparison of various enzymatic hydrolysis effect

由表2可知，裂壺藻渣在經(jīng)過五種不同蛋白酶水解相同時(shí)間后，水解度具有一定差異，但都普遍較低。其中胰蛋白酶酶解液水解度為4.97%，水解效果最好的復(fù)合蛋白酶為9.46%。水解度的差異是由于不同酶的酶切位點(diǎn)不同，而多酶的水解度均普遍偏低，推測其原因可能與原料在水中溶解性質(zhì)不佳有關(guān)，以致較難被蛋白酶水解。五種酶解液的蛋白回收率差異比較明顯，最高可達(dá)54.05%，最低為38.13%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水解相同時(shí)間后，五種酶解液中復(fù)合蛋白酶的酶解液抗氧化活性最高，羥自由基的半抑制濃度（IC50）為2.74 mg/mL，相對較差的胰蛋白酶酶解液半抑制濃度為3.42 mg/mL。

綜合來看，采用5種不同蛋白酶酶解裂壺藻，其酶解液的水解度、蛋白回收率和抗氧化活性均有一定差異。但其中復(fù)合蛋白酶的水解效果最好，水解度與蛋白回收率均最高，抗氧化活性也最強(qiáng)；其次，風(fēng)味蛋白酶和Alcalase 2.4 L蛋白酶的酶解液也具有較高的蛋白回收率和水解度，以及較好的抗氧化活性。因此，從5種蛋白酶中選擇復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和Alcalase 2.4 L蛋白酶繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)工藝研究。

2.2不同酶解時(shí)間水解效果比較分析

由圖1可以看出，隨著酶解時(shí)間的增長，風(fēng)味蛋白酶和Alcalase 2.4 L蛋白酶酶解液的水解度變化不大，復(fù)合蛋白酶酶解液水解度有所增加，但增長幅度不大，推測原因可能與樣品溶解性質(zhì)有關(guān)。由圖2可知，酶解液的蛋白回收率隨時(shí)間變化明顯，呈現(xiàn)先增長后降低的趨勢。但綜合兩圖來看，不論水解時(shí)間多長，復(fù)合蛋白酶酶解液的水解度與蛋白回收率均高于另外兩種。

圖1　不同酶解時(shí)間對水解度的影響Fig.1　Effect of time on hydrolysis degree

圖2　不同酶解時(shí)間對蛋白回收率的影響Fig.2　Effect of time on protein recovery

由圖3可知，不同酶解時(shí)間對裂壺藻酶解液的羥自由基清除能力實(shí)際影響不大，三種酶解液的半抑制濃度IC50均維持在3 mg/mL左右。其中，復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶酶解液的抗氧化活性基本呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。陳美珍等［19］研究大豆分離蛋白的清除羥自由基活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶解大于某個(gè)時(shí)間長度后，所得酶解物的清除活性會(huì)呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢。這與本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果基本相符。復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解液在酶解6 h時(shí)，抗氧化活性最強(qiáng)。

圖3　不同酶解時(shí)間對羥自由基半抑制濃度IC50的影響Fig.3　Effect of time on scavenging·OH Radical IC50

綜合分析可知，酶解時(shí)間對裂壺藻酶解液的水解度和蛋白回收率略有影響，主要表現(xiàn)在前6 h之內(nèi)，6 h后增長幅度變慢或與之前基本持平；酶解時(shí)間對羥自由基清除率無顯著性影響。綜合考慮生產(chǎn)成本與能源耗費(fèi)等諸多因素，可選擇6 h作為較優(yōu)酶解時(shí)間，此時(shí)復(fù)合蛋白酶的酶解液均具有較好水解度（10.42%）、蛋白回收率（56.3%）與較高抗氧化活性（·OH半抑制濃度IC50=2.83 mg/mL）。

2.3不同料水比水解效果比較分析

由圖4、圖5可知，隨著加水量逐漸增多，樣品酶解液的水解度和蛋白回收率均明顯提高，酶種類不同其增長幅度有所差異。就水解度一個(gè)指標(biāo)而言，不論酶解時(shí)間和料水比怎樣變化，復(fù)合蛋白酶酶解液的酶解效果均優(yōu)于另外兩種單酶，分析原因應(yīng)該與其酶切位點(diǎn)較多有關(guān)。而不論哪一種蛋白酶，當(dāng)料水比提高到1∶12之后，其酶解液的水解度和蛋白回收率增長速度均明顯減緩甚至保持不變，這可能與加水量增加也在一定程度上稀釋了蛋白酶的濃度和樣品濃度有關(guān)。

圖4　不同料水比對水解度的影響Fig.4　Effect of the ratio of water on hydrolysis degree

圖5　不同料水比對蛋白回收率的影響Fig.5　Effect of the ratio of water on protein recovery

圖6　不同料水比對羥自由基半抑制濃度IC50的影響Fig.6　Effect of the ratio of water on scavenging·OH radical IC50

從圖6可以看出，三種酶解液的羥自由基清除能力隨樣品加水量的增多均有所變化，尤以復(fù)合蛋白酶酶解液的活性變化表現(xiàn)明顯。當(dāng)料水比為1∶10和1∶12時(shí)，三種酶的酶解液具有較強(qiáng)的抗氧化活性。在加水量較少時(shí)，由于整個(gè)反應(yīng)體系中水量偏低，不利于蛋白質(zhì)分子的溶解和充分伸展，使得用于酶解的反應(yīng)位點(diǎn)較少，影響了抗氧化活性肽的生成量或種類［20］。而當(dāng)加入的水過量時(shí)，酶的有效質(zhì)量濃度也降低，結(jié)果導(dǎo)致反應(yīng)速度變慢，蛋白降解產(chǎn)物中抗氧化肽生成量減少，影響酶解液的抗氧化活性。這與王艷梅等［21］以黃緣盒龜肉為原料酶解獲取抗氧化肽的實(shí)驗(yàn)中，料液比對羥自由基清除率的影響效果相符。

綜合來看，當(dāng)料水比為1∶12時(shí)，酶解液的水解度和蛋白回收率均較高，且再增多加水量也不再有明顯提高，此時(shí)酶解液具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以確定1∶12料水比作為最優(yōu)工藝。

2.4復(fù)合酶解的水解效果比較分析

2.4.1單酶與復(fù)合酶解裂壺藻酶解液的水解度和蛋白回收率比較從圖7和圖8可以看出，復(fù)合酶解的水解效果對比單酶酶解有了一定提高。當(dāng)兩兩進(jìn)行復(fù)配酶解時(shí)，復(fù)合蛋白酶和Alcalase蛋白酶以1∶1比例混合作用的酶解效果均強(qiáng)于另外兩種復(fù)配方式，水解度和蛋白回收率均最高，分別達(dá)到11.15%和70.82%，而以三種酶共同復(fù)配的酶解效果略低于復(fù)合蛋白酶+Alcalase的復(fù)配方式，也分別達(dá)到9.95%和64.62%。但是不論任何一種復(fù)配方式，其酶解效果均優(yōu)于利用單酶直接酶解的方式。因?yàn)椴煌牡鞍酌妇哂胁煌牡孜飳Ｒ恍?，多酶?fù)合共同酶解可以彌補(bǔ)單一酶解的不足。

圖7　單酶與復(fù)合酶解水解度比較Fig.7　The comparison of hydrolysis degree between single and composite enzymatic hydrolysis

圖8　單酶與復(fù)合酶解蛋白回收率比較Fig.8　The comparison of protein recovery between single and composite enzymatic hydrolysis

2.4.2三酶復(fù)合酶解裂壺藻酶解液的抗氧化活性由圖9、圖10分析可知，通過酶的復(fù)合作用，裂壺藻酶解液的抗氧化活性比單酶酶解高。圖9中，羥自由基的半抑制濃度IC50最低可達(dá)到1.656 mg/mL，比復(fù)配之前酶解液的自由基清除能力增強(qiáng)很多。但與還原型谷胱甘肽GSH（羥自由基半抑制濃度IC50為0.6 mg/mL）進(jìn)行比較，抗氧化能力較低。對幾種復(fù)配方式進(jìn)行比較，可知復(fù)合蛋白酶與Alcalase 2.4 L蛋白酶共同酶解的酶解液羥自由基清除能力最強(qiáng)。

圖9　單酶與復(fù)合酶解羥自由基半抑制濃度IC50的比較Fig.9　The comparison of scavenging·OH Radical IC50between single and composite enzymatic hydrolysis

圖10　單酶與復(fù)合酶解還原力比較（濃度3 mg/mL）Fig.10　The comparison of reductive activity between single and composite enzymatic hydrolysis

為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可靠性，本文又測量了各復(fù)配酶解液的還原力大小。根據(jù)各酶解液的總氮含量，將其均稀釋到3 mg/mL蛋白濃度測量反應(yīng)吸光值，結(jié)果如圖10所示。從圖10中可以看出，幾種復(fù)配方式中，雖然讀數(shù)差距不大，但依然是復(fù)合蛋白酶+Alcalase 2.4 L蛋白酶的復(fù)合酶解方式所獲產(chǎn)物具有最高還原力，吸光值為1.417與0.5 mg/mL濃度的谷胱甘肽還原力相似。且各復(fù)合酶解產(chǎn)物均比單酶酶解產(chǎn)物還原力有明顯提高，進(jìn)一步驗(yàn)證了酶解液抗氧化活性的強(qiáng)弱情況。

綜上所述，所采用的復(fù)配方式中最優(yōu)方案是復(fù)合蛋白酶+Alcalase 2.4 L蛋白酶（1∶1，w/w）的復(fù)配方式，此時(shí)酶解產(chǎn)物具有較高的水解度、蛋白回收率和抗氧化活性。

3　結(jié)論

通過比較五種不同來源的蛋白酶對裂壺藻渣的酶解效果，探討酶制劑種類、酶解時(shí)間和料水比三種因素對樣品水解效果及酶解液抗氧化活性的影響，篩選出水解效果較好的酶種類，優(yōu)化出最佳酶解時(shí)間為6 h，最佳樣品料水比為1∶12。在此條件下，繼續(xù)探討三種較優(yōu)酶的兩兩復(fù)配（1∶1）及三酶復(fù)配（1∶1∶1）所導(dǎo)致酶解效果和酶解液抗氧化活性的變化。

結(jié)果表明，復(fù)合酶解效果均顯著優(yōu)于單酶的酶解效果。其中以復(fù)合蛋白酶+Alcalase 2.4 L蛋白酶的復(fù)配方式對樣品進(jìn)行復(fù)合酶解，可獲得最高水解度11.15%，最高蛋白回收率70.82%和最強(qiáng)抗氧化活性，其中羥自由基半抑制濃度IC50=1.656 mg/mL，還原力為1.417（酶解產(chǎn)物濃度為3 mg/mL）。由此可見，以工業(yè)化提取油脂后的裂壺藻渣為原料，利用酶解法提取抗氧化肽的工藝具有一定可行性，并且產(chǎn)物具有較高的抗氧化活性，為工業(yè)提取藻油后的藻渣廢料再利用提供了新的思路和利用方法。

［1］陳家鑫.裂壺藻及其制品在水產(chǎn)苗種培育中的應(yīng)用［J］.科學(xué)養(yǎng)魚，2002（6）：53.

［2］常桂芳，王興國.通過商品化DHA藻油的脂肪酸組成推測其微藻屬名［J］.中國油脂，2011，36（6）：45-49.

［3］Kusaikin M I，Ermakova S P，Shevchenko N M，et al.Structural characteristics and antitumor activity of a new chrysolaminaran from the diatom alga Synedraacus［J］.Chemistry of Natural Compounds，2010，46（1）：1-4.

［4］周妍，王凌，孫利芹，等.5種海洋微藻多糖體外免疫調(diào)節(jié)活性的篩選［J］.海洋通報(bào)，2010，29（2）：194-198.

［5］韋英益，胡庭俊，蘇子杰，等.馬尾藻多糖對豬脾細(xì)胞免疫活性及其抗病毒活性的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35（2）：120-124.

［6］Yim J H，Son E，Pyo S，et al.Novel sulfated polysaccharide derived from red-tide microalga Gyrodiniumimpudicum strain KG03withimmunostimulatingactivityinvivo［J］.Marine Biotechnology，2005，7（4）：331-338.

［7］Guzman S，Gato A，Lamela M，et al.Anti-inflammatory and immunomodulatory activities of polysaccharide from Chlorella stigmatophora and Phaeodactylumtricornutum［J］.Phytotherapy Research，2003，17（6）：665-670.

［8］Arad S M，Levy-Ontman O.Red microalgal cell-wall polysaccharides：biotechnological aspects［J］.Current Opinion in Biotechnology，2010，21（3）：358-364.

［9］汪少蕓，江勇，孟春，等.海洋微藻裂壺藻發(fā)酵液胞外多糖的制備及活性研究［J］.福州大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，39（5）：786-791.

［10］曹歡，王培培，吳建東，等.裂壺藻（Schizochytrium limacinum）多糖的提取分離及其結(jié)構(gòu)特性［J］.中國海洋藥物，2012，30（6）：1-5.

［11］Sheih I，Wu T K，F(xiàn)ang T J.Antioxidant properties of a new antioxidative peptide from algae protein waste hydrolysate indifferent oxidation systems［J］.Bioresource Technology，2009，100（13）：3419-3425.

［12］歐赟，喬燕燕，王維有，等.螺旋藻抗氧化肽的制備及其體外活性研究［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2014，33（1）：22-26.

［13］陳麗紅，孫利芹，王長海.微藻抗菌物質(zhì)及篩選模型［J］.中國生物工程雜志，2011，31（9）：109-116.

［14］張博超，張學(xué)武.螺旋藻抗腫瘤肽的分離及殼聚糖納米粒子復(fù)合物的制備［D］.廣州：華南理工大學(xué)，2012.

［15］朱儉.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1987：100-159.

［16］張意靜.食品分析技術(shù)［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2001：186-194.

［17］Jin M，Cai Y X，Li J R，et al.1，10-Phenanthroline-Fe2+Oxidative Assay of Hydroxyl Radical Produced by H2O2/Fe2+［J］. Progress in Biochemistry and Biophysics，1996.

［18］Ahmadi F，Kadivar M，Shahedi M.Antioxidant activity of Kelussia odoratissima Mozaff in model and food systems［J］.Food Chemistry，2007，105（1）：57-64.

［19］陳美珍，余杰.大豆分離蛋白酶解物清除羥自由基作用的研究［J］.食品科學(xué)，2002，23（1）：43-47.

［20］宋茹，馮婷立，謝超.海產(chǎn)小雜魚抗氧化肽制備工藝［J］.食品科學(xué)，2011，32（12）：29-33.

［21］王艷梅，萬全，賴年悅，等.黃緣盒龜肉的酶解工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性研究［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2013，37（4）：622-630.

表6　未知米糠粕的預(yù)測結(jié)果Table 6　Predicted results of unknown rice bran meal

參考文獻(xiàn)

［1］韓素云，劉磊，張名位，等.米糠整體加工利用研究進(jìn)展［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（12）：89-94.

［2］Chiou T Y，Ogino A，Kobayashi T，et al.Characteristics and antioxidative ability of defatted rice bran extracts obtained using several extractants under subcritical conditions［J］.J Oleo Sci，2013，62：1-8.

［3］Mendel F.Rice Brans，Rice Bran Oils，and Rice Hulls：Composition，F(xiàn)ood and Industrial Uses，and Bioactivities in Humans，Animals，and Cells［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61：10626-10641.

［4］曹秀娟，熊犍，印鐵，等.稻谷加工副產(chǎn)物的營養(yǎng)及功能成分分析［J］.糧油食品科技，2014，22（1）：58-62.

［5］Ferreira D S，Pallone J A L，Poppi R J.Direct analysis of the main chemical constituents in Chenopodium quinoa grain using Fourier transform near-infrared spectroscopy［J］.Food Control，2015，48：91-95.

［6］Shao Y N，Cen Y L，He Y，et al.Infrared spectroscopy and chemometrics for the starch and protein prediction of irradiated rice［J］.Food Chemistry，2011，126：1856-1861.

［7］魏良明，嚴(yán)衍祿，戴景瑞.近紅外反射光譜測定玉米完整籽粒蛋白質(zhì)和淀粉含量的研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（5）：630-633.

［8］Khandaker Z H，Khaleduzzaman A B M.Nutritional evaluation of Jambo forage using near infrared reflectance spectroscopy and comparison with wet chemistry analysis［J］.Bang J Anim Sci，2011，40（1-2）：46-50.

［9］劉建學(xué).實(shí)用近紅外光譜分析技術(shù)［M］.北京：科學(xué)出版社，2007：131-134.

［10］張德虎，田海清，武士鑰，等.河套蜜瓜糖度和堅(jiān)實(shí)度可見近紅外光譜檢測研究［J］.中國農(nóng)機(jī)化學(xué)報(bào)，2014，35（3）：197-201.

［11］李娟.稻谷新陳度近紅外快速無損檢測的研究［D］.長沙：中南林業(yè)科技大學(xué)，2012.

［12］許祿，邵學(xué)廣.化學(xué)計(jì)量學(xué)方法［M］.北京：科學(xué)出版社，2004：279-316.

［13］曹冬梅，張東杰，鹿保鑫，等.BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在稻米儲(chǔ)藏質(zhì)量評估中的應(yīng)用［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2014，29（4）：108-112.

［14］王欣，葉華俊，黎慶濤.近紅外光譜結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析蔗汁的錘度和旋光度［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2010，30（7）：1759-1762.

Study on the preparation of antioxidant peptides from Schizochytrium limacinum by composite enzymatic hydrolysis

WU Qiong1，2，HU Xiao2，YANG Xian-qing2，*，LI Lai-hao2，WU Yan-yan2，HAO Shu-xian2，LIN Wan-ling2，HUANG Hui2，DENG Jian-chao2
（1.College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Key Laboratory of Aquatic Product Processing，Ministry of Agriculture，National R&D Center for Aquatic Product Processing，South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300，China）

In this paper，Schizochytrium limacinum after oil extraction was hydrolyzed while the degree of hydrolysis，protein recovery and product antioxidant activity were as index to determine the best complex enzymatic processes.The results showed that the optimum conditions were as follows：pH7.5，temperature 50℃，ratio of material to water 1∶12，time 4 h，Protamex and Alcalase 2.4 L complex method，total amount of enzyme dosage 0.5%（E/S，w/w，1∶1），which was significantly better than the effect of single enzymatic hydrolysis.In this condition，the hydrolysates had the degree of hydrolysis of 11.15%，protein recovery 70.82%.In addition，IC50of hydroxyl radicals was 1.656 mg/mL and reducing power was 1.417.

Schizochytrium limacinum；composite enzymatic hydrolysis；antioxidant peptides；process

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0167-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.026

2014-09-26

武瓊（1992-），女，碩士研究生，研究方向：食品加工與功能食品，E-mail：wu123qiong@126.com。

楊賢慶（1963-），男，大學(xué)本科，研究員，研究方向：水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全，E-mail：yxqgd@163.com。

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-49）；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD28B06）；國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2010GB23260577，2010GB2E000335）；廣東省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2011A020102005）；廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)（微藻功能性蛋白肽的研究與產(chǎn)品開發(fā)）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（21205138，31301454）。