巨尾桉葉、皮、芯中單寧提取及其抗氧化性研究

周　洲，龍鳳香，鄧黎娟，韋婷馨，鄭燕菲，劉雄民

（廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧530004）

巨尾桉葉、皮、芯中單寧提取及其抗氧化性研究

周洲，龍鳳香，鄧黎娟，韋婷馨，鄭燕菲，劉雄民*

（廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧530004）

采用加熱回流與超聲波輔助提取法分別提取了巨尾桉的樹葉、樹皮、樹芯3部位中的單寧，考察了3部位提取物的抗氧化特性。加熱回流法提取巨尾桉樹葉、樹皮、樹芯單寧的得率分別為4.19%、1.86%和0.25%。超聲波輔助提取法提取巨尾桉樹葉、樹皮、樹芯單寧的得率分別為3.20%、2.25%和0.19%。巨尾桉3部位的單寧提取物對DPPH·、·OH自由基和H2O2均有較好的清除作用，其中，巨尾桉葉、皮、芯單寧提取物對DPPH·自由基清除率分別相當(dāng)于VC的91.08%、93.20%、79.40%；對·OH自由基清除率分別相當(dāng)于VC的181%、125%、132%；對H2O2的清除率分別相當(dāng)于VC的83.60%、65.46%、78.46%。

巨尾桉，單寧，提取，抗氧化

桉樹，桃金娘科，又名尤加利樹，樹種繁多可達900多種，是我國南方地區(qū)大量種植的速生樹種之一，而廣西桉樹面積、木材產(chǎn)量均居全國首位。其中，巨尾桉是巨桉和尾葉桉的雜交樹種，由于其生長周期短，被廣泛種植。但是對于巨尾桉的運用卻較為單一，大多取用其木材，這就造成了資源的極大浪費。

近年來，桉樹及其副產(chǎn)物的綜合利用受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注，其中桉樹揮發(fā)性芳香油、黃酮類化合物、?；g苯三酚衍生物、非揮發(fā)性萜類及其苷類、鞣質(zhì)等活性物質(zhì)等研究已經(jīng)取得一定進展。其中，田玉紅［1-2］研究了大葉桉、巨尾桉、鄧恩桉、赤桉等14種桉樹的揮發(fā)油成分和揮發(fā)油提取工藝，并對生物活性進行了深入研究。陳海等［3］對桉葉抗氧化物的提取與抗氧化性的研究，證明桉葉提取物中酚類物質(zhì)的含量與抗氧化成正比。黃增等［4-5］提取了巨尾桉葉揮發(fā)油、皂苷和單寧，并研究了其活性，其中巨尾桉葉單寧的提取得率為4.01%，對8種常見菌株有很好的抑制作用以及對DPPH·、·OH自由基和H2O2有很好的清除能力。鄭燕菲等［6］從巨尾桉葉中提取得總黃酮，并考察了提取物對DPPH自由基的清除能力以及對食品中常見的腐敗菌和產(chǎn)毒素菌的抑制作用。國內(nèi)外的許多研究都表明［6-12］，桉樹具有極高的經(jīng)濟價值和市場價值，其未來的發(fā)展前景很廣，同時隨著植物單寧研究的深入，單寧在醫(yī)藥、食品、制革工業(yè)、日用化工、礦石浮選等方面表現(xiàn)出越來越重要的作用。但有關(guān)巨尾桉樹中單寧、特別是樹皮和芯材的提取和抗氧化性還沒有受到足夠重視，其經(jīng)濟價值沒有得到充分的發(fā)揮。

本文為了充分利用巨尾桉樹葉、樹皮、樹芯資源，開展從樹葉、樹皮、樹芯3個不同部位提取具有生物活性的單寧，比較不同提取方法、不同部位單寧含量的差異，考察其抗氧化活性，以期為綜合利用速生桉資源提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

巨尾桉樹葉、樹皮、樹芯均采摘于廣西大學(xué)西校園；單寧酸廣東光華化學(xué)廠有限公司，分析純；石油醚廣東光華化學(xué)廠有限公司，分析純；福林酚試劑上海寶曼生物科技有限公司，分析純；飽和碳酸鈉天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，分析純；二苯基苦基肼自由基日本和光純藥工業(yè)株式會社，分析純；抗壞血酸上海試四赫維化工有限公司，分析純；硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、氫氧化鈉廣東光華化學(xué)廠有限公司，分析純；磷酸二氫鉀國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純。

FZ102型微型植物粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；AR224CN型電子天平OHAUS國際貿(mào)易有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海躍進醫(yī)療器械廠；KQ-600DB型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；Agilent 8453E紫外-可見分光光度計安捷倫科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品預(yù)處理將巨尾桉的樹皮、樹葉和樹芯洗凈晾干，放于烘箱（40～45℃）中烘干，粉碎，過40目篩，用石油醚（料液比1∶4）在90℃油浴下回流4 h以脫色除脂，除去溶劑，置烘箱45℃干燥40min，于密封袋中儲存?zhèn)溆茫?］。

1.2.2標準曲線繪制精確稱取0.0114 g單寧酸，溶解并定容至100 mL，得濃度為0.114 g/L的單寧酸標準液；依照Folin-Denis比色法［3］，分別移取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL的單寧酸標準液于棕色容量瓶中，各加入1.3 mL福林酚試劑，靜置6 min后加入5.0 mL飽和Na2CO3溶液，靜置6 min，定容至25 mL，搖勻，靜置30 min，于756 nm波長測定吸光值。以單寧酸濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制標準曲線，以最小二乘法計算，擬合線性方程。

1.2.3單寧提取實驗考察以水為提取溶劑，加熱回流和超聲輔助提取兩種方法提取巨尾桉三部位的單寧，比較得率。

1.2.3.1加熱回流法提取單寧參考文獻［13］方法并進行修改，分別稱取樹皮、樹葉、樹芯干粉各5.0 g于250 mL圓底燒瓶中，以1∶30的料液比加入蒸餾水，80～90℃油浴回流2 h，取提取液于4200 r/min下離心15 min，抽濾，50℃旋蒸濃縮，40℃干燥得提取物。

1.2.3.2超聲輔助法提取單寧參考文獻［5］方法并進行改進，分別稱取樹皮、樹葉、樹芯干粉各5.0 g于200 mL具塞錐形瓶中，以1∶15的料液比加入蒸餾水，以540 W，40～50℃超聲提取2次，每次30 min，合并提取液，4200 r/min下離心15 min，抽濾，50℃旋蒸濃縮，40℃干燥得提取物。

1.2.4單寧提取物的抗氧化性能測定

1.2.4.1對二苯基苦基肼自由基（DPPH·）清除作用分別取2 mL不同濃度的巨尾桉葉、皮、芯單寧提取物和VC樣液于刻度試管，依次加入2 mL濃度為3.10× 10-4mol·L-1的DPPH乙醇溶液，混合均勻，避光靜置20 min，在紫外吸收波長524 nm處測定混合液的吸光值，記作Ai；依照上述步驟以相應(yīng)體積的蒸餾水替換樣液時測得的吸光值記作A0；用VC溶液做參比。

DPPH·自由基清除率的計算公式如下：

清除率（%）=（1-Ai/A0）×100

1.2.4.2對羥基自由基（·OH）清除作用分別移取2 mL不同濃度的巨尾桉葉、皮、芯單寧提取物和VC樣液，依次加入9 mmol·L-1的FeSO4溶液2 mL、9 mmol·L-1的H2O2溶液2 mL，均勻混合靜置10 min，再加入9 mmol·L-1的水楊酸溶液2 mL，靜置10 min，在紫外吸收波長512 nm處測定混合液的吸光值，記作Ai；根據(jù)上述步驟以相應(yīng)體積的蒸餾水替換水楊酸時測得的吸光值記作Aj；空白對照組以蒸餾水替換樣液測得吸光值A(chǔ)0，以VC溶液做參比。

·OH自由基清除率的計算公式如下：

清除率（%）=［1-（Ai-Aj）/A0］×100

1.2.4.3對過氧化氫（H2O2）清除作用用pH=7.4的磷酸緩沖液配制10 mmol·L-1的H2O2溶液，分別移取2 mL不同濃度的巨尾桉葉、皮、芯單寧提取物和VC樣液于具塞刻度試管中，再加入2 mL H2O2溶液，混勻靜置10 min，在紫外吸收波長230 nm處測定混合液的吸光值，記作Ai；以上述步驟中不加H2O2溶液時測得的吸光值記作Aj；以上述步驟中不加樣品溶液時測得的吸光值記作A0，以抗壞血酸溶液做參比。

H2O2清除率計算公式如下：

清除率（%）=［1-（Ai-Aj）/A0］×100

2　結(jié)果與討論

2.1單寧酸和巨尾桉單寧光譜特性及其標準工作曲線

圖1　巨尾桉單寧提取物與單寧酸光譜圖Fig.1　Visible absorption spectrum of tannins and sample solutions

為了定量分析巨尾桉單寧含量，首先建立合適的分析方法，為此，考察巨尾桉單寧提取物與單寧酸的光譜特性。巨尾桉3部位單寧提取物、單寧酸的紫外-可見光譜圖如圖1所示。

由圖1看出，巨尾桉單寧提取物與單寧酸具有相似的光譜特征，因此，可以采用單寧酸作為標準品建立定量分析方法。

以單寧酸濃度為橫坐標，對應(yīng)吸光值為縱坐標，繪制標準曲線如圖2所示。所得線性方程為y=111.65x+ 0.1757，式中，y為吸光值，x為單寧酸濃度（mg/mL）；線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9941，單寧濃度在0.002～0.02 mg/mL范圍內(nèi)于756 nm處吸光值關(guān)系良好。

圖2　單寧酸標準曲線Fig.2　Standard curve of tannins

2.2單寧含量的測定

不同方法提取得到的樹葉、樹皮、樹芯單寧提取物得率的結(jié)果如表1所示。

表1　不同方法對巨尾桉各部位中單寧提取的得率（%）Table 1　The yields（%）of the different parts in Eucalyptus Grandis x E.Urophylla by different methods

由表1可知，加熱回流法提取巨尾桉葉單寧的得率為4.19%，稍高于文獻［5］值4.01%。兩種提取方法中，三個部位單寧提取率高低順序均為：樹葉＞樹皮＞樹芯。對于樹葉和樹芯而言，加熱回流提取得率比超聲輔助提取得率高；而對于樹皮是超聲輔助提取得率高于加熱回流法。這可能是樹葉、樹芯和樹皮中所含單寧的種類不同所致［14-16］。

（1）規(guī)范統(tǒng)一。應(yīng)用移動終端實現(xiàn)無紙化操作、規(guī)范合同結(jié)算業(yè)務(wù)單據(jù)，從技術(shù)角度保證業(yè)務(wù)單據(jù)的真實性、準確性。

2.3單寧提取物抗氧化性能研究

2.3.1對DPPH·自由基清除作用巨尾桉樹葉、樹皮、樹芯中單寧提取物和VC對DPPH·自由基清除效果見圖3。由圖3可以看出，樹葉、樹皮、樹芯單寧提取物和VC對DPPH·自由基均有一定的清除能力，對自由基的清除能力在一定范圍隨著反應(yīng)體系溶液濃度的增大而逐漸增強，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，當(dāng)達到一定的濃度時清除率增加趨于平衡。

在樣液濃度約為0.05 mg/mL時，各樣液的清除率趨于平衡，樹葉單寧提取物對DPPH·自由基的最大清除率為86.07%；樹皮單寧提取物對DPPH·自由基的最大清除率為88.07%；樹芯單寧提取物對DPPH·自由基的最大清除率為75.03%。與VC對DPPH·自由基的最大清除率94.50%相比，巨尾桉葉、皮、芯單寧提取物對DPPH·自由基清除率分別相當(dāng)于VC清除率的91.08%、93.20%、79.40%。

比較各試樣的IC50值可知，其清除作用大小依次為：VC＞樹葉單寧提取物＞樹皮單寧提取物＞樹芯提取物，也就是說桉樹三部位單寧提取物對DPPH·自由基的清除能力均弱于VC，這是因為提取物的清除能力與單寧含量大小有關(guān)。

2.3.2對·OH自由基的清除作用巨尾桉樹葉、樹皮、樹芯中單寧提取物和VC對·OH自由基清除作用如圖4所示。

圖3　不同樣液對DPPH·自由基的清除作用Fig.3　DPPH·free radical scavenging activity of different samples

圖4　不同樣液對·OH自由基的清除作用Fig.4·OH free radical scavenging activity of different samples

由圖4可知，樹葉、樹皮、樹芯單寧提取物和VC對·OH自由基均有一定的清除作用，在一定的濃度范圍內(nèi)，各試液對·OH自由基的清除能力隨著各試樣濃度的增大而增強，且當(dāng)濃度增大到一定值時，樣液對·OH自由基的清除作用有逐漸平穩(wěn)的趨勢；在樣液濃度約為0.2 mg/mL時，各樣液對·OH自由基的清除作用趨于平緩，巨尾桉葉、皮、芯單寧提取物對·OH自由基的最大清除率分別為62.43%、85.35%、59.00%；與VC對·OH自由基的最大清除率47.21%相比，巨尾桉樹皮、芯、葉對·OH自由基清除率分別相當(dāng)于VC清除率的181%、125%、132%。

2.3.3對H2O2的清除作用巨尾桉樹葉、樹皮、樹芯中單寧提取物和VC對H2O2清除作用如圖5所示。

圖5　不同樣液對H2O2的清除作用Fig.5　H2O2scavenging activity of different samples

由圖5可知，樹葉、樹皮、樹芯單寧提取物和VC對H2O2均具有一定的清除作用，在實驗濃度范圍內(nèi)，桉樹各部位單寧對H2O2的清除率均隨著濃度的增大而升高，且在濃度增到一定值后清除率趨于穩(wěn)定。當(dāng)樣液濃度大于0.07 mg/mL時，各樣液的清除率增加緩慢，樹葉單寧提取物對H2O2的最大清除率為51.84%；樹皮單寧提取物對H2O2的最大清除率為62.13%；樹芯單寧提取物對H2O2的最大清除率為66.20%；與VC對H2O2的最大清除率79.19%相比，巨尾桉樹葉、皮、芯單寧提取物對H2O2清除率分別相當(dāng)于VC清除率的83.60%、65.46%、78.46%。以試樣的IC50值作為清除能力的比較，其順序為VC＞樹芯單寧提取物＞樹葉單寧提取物＞樹皮單寧提取物?？芍尬茶?部位單寧提取物對H2O2的清除能力均弱于VC，但在小于0.024 mg/mL濃度時，巨尾桉3部位單寧提取物對H2O2的清除能力是高于VC的清除能力的。

3　結(jié)論

3.1用加熱回流與超聲波輔助提取法提取了巨尾桉的樹葉、樹皮、樹芯3部位中的單寧，加熱回流法提取巨尾桉樹葉、樹皮、樹芯單寧的得率分別為：4.19%、1.86%和0.25%。超聲波輔助提取法提取巨尾桉樹葉、樹皮、樹芯單寧的得率分別為：3.20%、2.25%和0.19%。

3.2巨尾桉葉、皮、芯的單寧提取物對DPPH·、OH·自由基和H2O2均有較好的清除作用。巨尾桉葉、皮、芯單寧提取物對DPPH·自由基的最大清除率分別相當(dāng)于VC的91.08%、93.20%、79.40%；對·OH自由基最大清除率分別相當(dāng)于VC的181%、125%、132%；對H2O2的最大清除率分別相當(dāng)于VC的83.60%、65.46%、78.46%。

3.3巨尾桉3部位提取樣液清除·OH自由基的效果優(yōu)于VC。

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Extraction，antioxidant activity of tannins from different parts of Eucalyptus Grandis x E.Urophylla

ZHOU Zhou，LONG Feng-xiang，DENG Li-juan，WEI Ting-xin，ZHENG Yan-fei，LIU Xiong-min*
（College of Chemistry and Chemical Engineering of Guangxi University，Nanning 530004，China）

Conventional refluxing extraction and ultrasound assisted extraction were adopted to extract tannins from leaf，bark and core of Eucalyptus Grandis x E.Urophylla.Moreover the antioxidant activity of tannins extracts also was studied.The yields of tannins from leaf，bark and core by conventional refluxing extraction were 4.19%，1.86%and 0.25%respectively，but that were 3.20%，2.25%and 0.19%respectively by ultrasound assisted extraction.The tannins extracts of Eucalyptus Grandis x E.Urophylla different parts had a strong scavenging activity to DPPH·，·OH free radical and H2O2.The scavenging activity of tannins extracts from leaf，bark and core on DPPH·were the equivalent to VCof 91.08%，93.20%and 79.40%，respectively.And the scavenging activity of 3 tannins extracts on·OH reached 181%，125%and 132%of VC，on H2O2equal to 83.60%，65.46%and 78.46%VC.

Eucalyptus Grandis x E.Urophylla；tannins；extract；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0129-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.018

2014－12－01

周洲（1993-），男，本科，研究方向：天然產(chǎn)物化工，E-mail：zhouyazj@163.com。

劉雄民（1960-），男，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物化工，E-mail：xmliu1@gxu.edu.cn。

廣西大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃”資助項目；國家自然科學(xué)基金（11462001）。