近紅外光譜技術(shù)快速無損檢測藍莓總黃酮、花青素的研究

劉小路，薛　璐，*，魯曉翔，張　鵬，陳紹慧，李江闊

（1.天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津300134；2.國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心，天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津300384）

近紅外光譜技術(shù)快速無損檢測藍莓總黃酮、花青素的研究

劉小路1，薛璐1，*，魯曉翔1，張鵬2，陳紹慧2，李江闊2

（1.天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津300134；2.國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心，天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津300384）

為建立起藍莓的快速無損檢測體系，本研究應用近紅外光譜技術(shù)對鮮藍莓中總黃酮、花青素的含量進行了分析。在光譜全波長（400～2500 nm）范圍內(nèi)采用偏最小二乘法（PLS）建立藍莓總黃酮、花青素含量的定標數(shù)學模型，其相關(guān)系數(shù)分別為0.836和0.750，校正標準誤差（SECV）分別為1.423 mg/（100g）和4.688 mg/（100g）。然后使用最優(yōu)模型對32個未知樣品進行預測，其預測相關(guān)系數(shù)Rp2分別為0.7968和0.7902，預測標準誤差分別為2.779 mg/（100g）和5.013 mg/（100g），殘差和分別為-0.003 mg/（100g）和-9.256（mg/100g）。實驗結(jié)果說明，近紅外漫反射技術(shù)可用于快速無損檢測藍莓中總黃酮、花青素含量。

近紅外光譜技術(shù)，藍莓，總黃酮，花青素，無損檢測

藍莓（Blueberry）學名為越桔（Vaccinium ssp），屬于杜鵑花科（Ericaseae）越桔屬（Vaccinium）落葉或常綠灌木植物，果肉細膩，甜中帶酸，風味獨特，適于鮮食。藍莓營養(yǎng)價值高，除含有糖、酸外，還富含多種維生素（VC、VE、VA、VB等）、SOD、熊果苷、花色苷、蛋白質(zhì)、豐富的食用纖維以及黃酮類等特殊成分。藍莓中黃酮類物質(zhì)作為生物活性成分，在抗氧化、抗腫瘤、增強免疫力、延緩衰老、改善視力等方面有一定的作用［1］。

黃酮類物質(zhì)及花青素等傳統(tǒng)的檢測方法有水浸提法、有機溶劑浸提法、回流提取法等，這些方法耗時長，污染環(huán)境，無法滿足生產(chǎn)過程中在線成分含量監(jiān)控的要求。因此簡單、快速、高效的檢測方法廣泛受到關(guān)注。近紅外光譜技術(shù)作為一種快速、無損的檢測技術(shù)，在水果品質(zhì)檢測中得到了廣泛的應用［2-6］。王姍姍等［7-8］曾利用近紅外光譜技術(shù)對超低溫貯藏（-170℃）的藍莓進行無損檢測，對藍莓SSC、總酚和花青素建立數(shù)學模型。劉燕德等［9］應用可見/近紅外漫反射光譜對南豐蜜桔維生素C含量進行了無損檢測研究。雖然近幾年近紅外應用廣泛，但是在鮮食藍莓總黃酮、花青素含量測定方面的研究較少。本課題研究了低溫貯藏（0℃）條件下，利用近紅外光譜技術(shù)建立鮮食藍莓總黃酮、花青素含量的無損檢測模型，通過對模型的校正、驗證，獲得準確性較高的模型，為以后鮮食藍莓的品質(zhì)鑒定提供理論依據(jù)及方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

藍莓品種伯克利，于2014年7月采自大連金州基地，采摘當天將果實運回國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心實驗室（溫度為25～30℃）進行處理。低溫（0℃）預冷24 h后進行分裝（0.05 mm的PE膜），封口，然后放在低溫庫（0℃）中貯藏，樣品從采摘當天開始測定，到低溫貯藏64 d藍莓變軟、腐爛率達到50%停止測定，其間每8 d進行測定，共測8次。

NIRSDS2500近紅外漫反射光譜儀丹麥FOSS公司；TU-1810紫外-可見分光光度計普析通用儀器有限公司；SHZ-82A水浴恒溫鍋金壇市金南儀器制造有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1藍莓樣品處理實驗前，將處理的藍莓取出，置于常溫環(huán)境下1.5 h，恢復至室溫，每次實驗取20組，每組4個果實。每組藍莓標記后四果同時進行光譜掃描，然后將掃描后的藍莓果實進行化學指標的測定。實驗共取160個，隨機分為定標集和驗證集，樣品數(shù)分別為128個和32個。

1.2.2光譜的采集本實驗使用儀器是丹麥FOSS公司提供的NIRS DS2500近紅外漫反射光譜儀，采用全息光柵分光系統(tǒng)，硅（400～1100 nm）和硫化鉛（1100～2500 nm）檢測器采集信號。光譜采集條件為：在波長范圍400～2500 nm內(nèi)，單波長快速掃描，掃描次數(shù)32。儀器配制Nova分析軟件采集光譜，WinISI4定標軟件處理光譜數(shù)據(jù)，測量時盡量避開表面缺陷部位（如傷疤、污點等），因藍莓果實較小，光譜掃描時采用每組四果同時掃描，盡量將透光孔遮住，在小漿杯（Slurry Cup）上藍莓果實均豎放，避開果蒂進行光譜掃描。

1.2.3測定方法

1.2.3.1樣品液的制備每組四個藍莓新鮮果肉各取一部分，共稱取5 g左右，研磨后放于250 mL的燒杯中，用60%的乙醇定容至100 mL，搖勻，放在80℃的水浴鍋浸提15 min，取出，放置至漂浮物沉下為止，備用。

1.2.3.2總黃酮含量的測定

a.標準曲線的制作：準確量取蘆丁標準液（0.08 mg/mL）0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL于試管中，用30%乙醇定容至5 mL，混勻，分別加入0.3 mL 5%NaNO2，混勻靜置5 min，加0.3 mL 10%Al（NO3）3，混勻靜置5 min，加入4 mL 1 mol/L NaOH，再加入0.4 mL 30%乙醇使總體積達到10 mL，混勻靜置10 min，在510 nm處比色，以蒸餾水為空白對照，制定標準曲線。

b.總黃酮含量的測定：取1 mL提取液，加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液，搖勻靜置5 min，加入0.3 mL 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻，放置5 min，加入4 mL 1 mol/L的NaOH溶液，用30%的乙醇定容到10 mL，混勻靜置10 min。以蒸餾水作為空白對照，在其最大吸收波長510 nm處測定吸光度A值［10-11］。計算公式為：

其中：X—由回歸方程求得；V1—提取液總體積；V2—測定用樣品液體；W—樣品鮮重。

1.2.3.3花青素含量的測定取制備的樣品液兩份，各2 mL，分別加入pH 4.5的0.4 mol/L的醋酸鈉緩沖液和pH 1.0的0.25 mol/L的氯化鉀緩沖液8 mL，搖勻，放置半小時，轉(zhuǎn)入光路長1 cm的比色皿后，用紫外-可見分光光度計分別以530 nm和700 nm為吸收波長測定其吸光度，用60%乙醇做空白對照［12］。計算公式為：

其中：A—最終吸光度；M—摩爾質(zhì)量：449.2；F—樣品液稀釋倍數(shù)；V—稀釋總體積：mL；e—摩爾吸光系數(shù)：26900；L—比色皿光路長：1 cm；m—樣品鮮重：g。

1.3光譜數(shù)據(jù)處理與分析

為了比較不同光譜預處理方法對所建模型的影響，利用WinISI4定標軟件，對原始光譜進行濾波和平滑處理，以去除噪聲，提取有效信息。本實驗中總黃酮、花青素均采用PLS法，分別研究不同導數(shù)處理與不同散射和標準化方法相結(jié)合的處理方法對模型的影響，通過比較找到最優(yōu)的模型。在全光譜范圍內(nèi)，討論了原始光譜（None）、一階導數(shù)（D1Log（1/R））、二階導數(shù)（D2Log（1/R））和標準正?；幚恚⊿NV）、去散射處理（Detrend）、標準正?；c去散射結(jié)合處理（SNV and Detrend）、標準多元離散校正（SMSC）和加權(quán)多元離散校正（WMSC）相結(jié)合的處理方法所建立的模型。然后再用未參與定標的未知樣品對最優(yōu)定標模型進行驗證，以評價模型的可行性。本實驗以交互驗證相關(guān)系數(shù)（Rcv2）和交互驗證誤差（SECV）作為評價指標。預測模型則通過預測相關(guān)系數(shù)（Rp2）、預測標準誤差（SEP）和殘差分析評價所建模型的精確性。

1.4預測模型殘差分析

預測效果和穩(wěn)定性較好的近紅外模型，要求殘差正、負值均勻分布在零點上下，且殘差之和接近于零。殘差公式如下［13］：

殘差e=y－y′

式中，y為通過數(shù)學模型預測所得的樣品預測值；y′為用標準方法所得的樣品真實值。根據(jù)殘差分布和殘差和確定定標模型的預測效果。

2　結(jié)果與討論

2.1低溫貯藏期間藍莓總黃酮、花青素含量標準值

藍莓在貯藏期間，隨貯藏時間的延長，藍莓中的化學成分在相關(guān)酶的作用下發(fā)生變化，導致果實中含氫官能團變化。研究表明，近紅外光譜區(qū)吸收的官能團主要是含氫官能團，其中包括C-H、O-H、N-H和S-H等，一般情況下近紅外光譜帶的二級倍頻位于1100～1600 nm范圍內(nèi)，三級和四級倍頻位于780～1100 nm波長范圍內(nèi)［14］。

表1是本實驗總黃酮、花青素含量校正集和驗證集的范圍、平均值和標準偏差。校正集用來建立數(shù)學模型，應具有代表性，其組成要包含待測樣品所包含的所有化學組分，其變化范圍應大于待測樣品的變化范圍。由表1可知，樣品驗證集的含量范圍都在校正集范圍內(nèi)，因此，本實驗樣品可以用于建立藍莓總黃酮、花青素含量的近紅外模型。

2.2藍莓近紅外原始光譜掃描

圖1為藍莓原始吸收光譜圖。從圖1中可以看出，光譜變化趨勢基本保持一致，但在波長為680、975、1186、1448、1916 nm的吸收峰處有顯著差異。通過WinISI4定標軟件分析可知，第一個吸收峰在680 nm處，主要是由于葉綠素對光的吸收造成的［15］；而975 nm和1186 nm處的吸收峰主要是因為水分含量的差異引起的，這說明水分含量的多少對藍莓的近紅外光譜影響很大；吸收峰1448 nm附近主要是C-H、-CH2鍵發(fā)生變化導致的。因此，不同時間貯藏的藍莓能提供豐富的光譜信息，通過化學計量學提取有效的光譜信息，因而應用近紅外光譜技術(shù)建立藍莓總黃酮、花青素的定量模型具有可行性。

表1　藍莓總黃酮、花青素含量實測結(jié)果Table 1　Measured results of total flavonoids and anthocyanins in blueberries

圖1　藍莓原始光譜圖Fig.1　The original spectrum of blueberries

2.3總黃酮、花青素最佳光譜預處理方法的確定

NIRS采集的原始光譜除了含有與樣品本身組成相關(guān)的信息外，還可能受到測試條件、外界溫度、儀器狀態(tài)等因素的影響，而且樣品中不同成分間的相互干擾以及成分含量的不同都有可能導致光譜重疊，因此，對采集到的原始光譜進行預處理是非常必要的，能過濾噪聲，提高信噪比，消除基線飄移的干擾［16］。用不同光譜預處理方法建模結(jié)果如表2所示。

表2　不同預處理的定標結(jié)果Table 2　Calibration results of different pretreatment

圖2　總黃酮一階導數(shù)吸收光譜圖Fig.2　First derivative absorbance spectrum of total flavonoids

由表2可知：D1Log（1/R）的模型優(yōu)于None和D2Log（1/R）的模型，其SECV較小，Rcv2較大。對于總黃酮含量來說，光譜導數(shù)處理對相關(guān)系數(shù)Rcv2影響較大?？傸S酮最佳處理條件為PLS+D1Log（1/R）+SNV and Detrend，其SECV為1.423，Rcv2為0.836；花青素最佳光譜處理條件為PLS+D1Log（1/R）+SMSC，其SECV為4.688，Rcv2為0.750。總黃酮、花青素處理后的光譜如圖2、圖3，從圖中可以看出，一階導數(shù)處理后的光譜圖不僅消除了儀器背景的干擾和基線漂移，還去除了樣品不同組分之間相互干擾造成的光譜重疊現(xiàn)象，使光譜中的有用信息更加清晰的顯示出來，具有更清晰的光譜輪廓變化和分辨率。因此，實驗研究均采用一階導數(shù)處理。

2.4定標模型的驗證

預測模型通過預測樣本誤差（SEP）和相關(guān)系數(shù)Rp2評價與對比所建模型的精確性。Rp2值越大，SEP越小，表明模型的預測能力越強。

圖3　花青素一階導數(shù)吸收光譜圖Fig.3　First derivative absorbance spectrum of anthocyanins

為了驗證模型的可靠性和穩(wěn)定性，用未知的32個樣品對模型進行驗證。結(jié)果如圖4～圖5所示。預測結(jié)果表明，總黃酮的Rp2為0.7968，SEP為2.779；花青素的Rp2為0.7902，SEP為5.013?？梢姳緦嶒炏嚓P(guān)性不高，其中總黃酮的模型優(yōu)于花青素模型，主要是因為藍莓果實較小，四果掃描取平均光譜，其果實間的差異可能會導致光譜偏差較大，而且藍莓中花青素的含量高于總黃酮，測定時果實之間的差異對含量的影響很大，同時紫外分光光度計的儀器誤差以及測定過程中的人為誤差都會影響含量的實測值，因此，為了得到準確性更高的定標模型還需要進一步的優(yōu)化與完善。

2．5總黃酮、花青素模型殘差分析

使用所建的定標模型預測32個未知樣品，考察模型的預測能力。圖6～圖7為驗證樣品殘差分布圖。

圖4　藍莓總黃酮實測值與預測值的相關(guān)性Fig.4　Correlation between predicted values of model optimized and actual values of blueberry total flavonoids

圖5　藍莓花青素實測值與預測值的相關(guān)性Fig.5　Correlation between predicted values of model optimized and actual values of blueberry anthocyanins

圖6　驗證集樣品總黃酮實測值與預測值的殘差分布圖Fig.6　Distribution of residual error of measured value and predicted value of validation samples total flavonoids

圖7　驗證集樣品花青素實測值與預測值的殘差分布圖Fig.7　Distribution of residual error of measured value and predicted value of validation samples anthocyanins

由圖6、圖7可知，從分布上看，總黃酮的殘差分布較均勻，花青素的殘差分布較分散；從其殘差和考慮，32個樣品的總黃酮、花青素的殘差和分別為-0.003 mg/100g和-9.256 mg/100g，總黃酮的殘差和更趨于零。綜上所述，通過比較預測模型相關(guān)系數(shù)Rp2、預測標準誤差（SEP）、殘差分布和殘差和這四項指標的分析結(jié)果，表明：藍莓總黃酮含量的定標模型預測效果優(yōu)于花青素的定標模型。

3　結(jié)論

藍莓貯藏期間，總黃酮和花青素的含量是反映藍莓營養(yǎng)價值的指標。本研究在全波長（400～2500 nm）范圍內(nèi)應用近紅外光譜技術(shù)建立藍莓總黃酮、花青素的無損檢測模型。實驗過程中采用同時測定藍莓總黃酮和花青素含量，有效縮短傳統(tǒng)分析方法的時間，降低藍莓的損耗。實驗結(jié)果表明，32個未知樣品總黃酮、花青素的預測相關(guān)系數(shù)Rp2分別為0.7968和0.7902，預測標準誤差（SEP）分別為2.779 mg/（100g）和5.013 mg/（100g），殘差和分別為-0.003 mg/（100g）和-9.256 mg/（100g）。通過比較預測模型相關(guān)系數(shù)Rp2、預測標準誤差（SEP）、殘差分布和殘差和四項指標，說明今后仍需要對近紅外快速無損檢測藍莓品質(zhì)進行進一步的優(yōu)化和完善。

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Fast non-destructive testing of total flavonoids and anthocyanins in blueberries by near-infrared spectroscope

LIU Xiao-lu1，XUE Lu1，*，LU Xiao-xiang1，ZHANG Peng2，CHEN Shao-hui2，LI Jiang-kuo2
（1.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China；2.Tianjin Key Laboratory of Postharvest Physiology and Storage of Agricultural Products，National Engineering and Technology Research Center for Preservation of Agricultural Products，Tianjin 300384，China）

In order to establish the fast non-destructive testing of blueberry，the total flavonoids and anthocyanins in fresh blueberry were analyzed by near infrared spectroscope（NIRS）.In the spectral region between 400～2500 nm，statistical mathematical models of total flavonoids and anthocyanins in blueberry were established within broad spectrum（400～2500 nm）using the partial least squares（PLS）.The correlation coefficient were 0.836 and 0.750 respectively，and the standard errors for calibration（SECV）were 1.423 mg/（100g）and 4.688 mg/（100g）respectively.Then 32 unknown samples were predicted by the optimal models.The correlation coefficient of prediction（Rp2）were0.7968 and 0.7902 respectively，and the standard errors of prediction（SEP）were 2.779 mg/（100g）and 5.013 mg/（100g）respectively，and residual sum were-0.003 mg/（100g）and-9.256 mg/（100g）respectively.The results showed that near infrared spectroscope could be used in fast non-destructive testing of total flavonoids and anthocyanins in blueberries.

near infrared spectroscopy；blueberry；total flavonoids；anthocyanins；non-destructive testing

TS255.1

A

1002-0306（2015）16-0058-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.003

2014－12－16

劉小路（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏，E-mail：Liuxiaolu0316@163.com。

薛璐（1976-），女，博士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏，E-mail：hellenxue@sina.com。

國家（十二五）科技支撐計劃（2012BAD38B01）；天津市創(chuàng)新團隊項目（TD12-5049）。