基于化學(xué)計(jì)量方法實(shí)現(xiàn)水牛乳中摻水和尿素鑒偽研究

黃　麗，林　波，李　玲，曾慶坤，唐　艷，楊　攀，馮　玲，農(nóng)皓如

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，廣西南寧530001）

基于化學(xué)計(jì)量方法實(shí)現(xiàn)水牛乳中摻水和尿素鑒偽研究

黃麗，林波，李玲，曾慶坤*，唐艷，楊攀，馮玲，農(nóng)皓如

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，廣西南寧530001）

以水牛乳7個(gè)主要理化指標(biāo)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)為基礎(chǔ)，建立了水牛乳中摻水和摻尿素定性和定量模型。聚類分析法較好地區(qū)分未摻假乳和摻假乳。Fisher判別分析中典則判別函數(shù)能夠直觀地區(qū)分不同摻假含量的樣品，線性判別函數(shù)能夠?qū)ξ粗獡絺稳闃悠愤M(jìn)行定性判別，判別效果良好。多元逐步線性回歸法構(gòu)建的定量模型實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù)Rp分別為0.9956、0.9934、0.9937、0.9938、0.9986、0.9991，模型預(yù)測(cè)值接近于真實(shí)值，可實(shí)現(xiàn)水牛乳摻假的定量鑒別。

水牛乳，摻假，理化指標(biāo)，化學(xué)計(jì)量方法

水牛乳素有“奶中精品”之稱，其蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均高于荷斯坦奶牛［1］，市場(chǎng)價(jià)格較高，非常具有發(fā)展前景。一些不法商家在利益驅(qū)使下，往水牛奶中摻假，其中摻水和尿素尤為常見，摻水為了提高牛奶重量，摻尿素則提高比重和蛋白質(zhì)含量。檢測(cè)摻水最常用感官檢測(cè)法、比重法和冰點(diǎn)測(cè)定法［2-3］，檢測(cè)尿素則采用顯色法［4-5］，但這些方法費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，不適合生產(chǎn)中大批量的抽樣檢測(cè)。隨著檢測(cè)水平的提高，很多學(xué)者借助先進(jìn)儀器進(jìn)行乳及乳制品鑒偽研究，利用電子舌［6］、近紅外光譜技術(shù)［7-9］、低場(chǎng)核磁共振［10］、單頻導(dǎo)納測(cè)定［11］等先進(jìn)儀器進(jìn)行牛奶摻偽檢測(cè)，但儀器分析法存在成本高、檢測(cè)速度慢等問(wèn)題，不能實(shí)現(xiàn)水牛奶的快速檢測(cè)。牛奶是由多種成分組成的混合體，主要是水和脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖等干物質(zhì)，干物質(zhì)的含量影響牛奶稀稠，正常牛奶成分含量基本穩(wěn)定，會(huì)有一定的變動(dòng)范圍［12］，水牛乳中摻水和尿素后破壞穩(wěn)定體系，引起理化指標(biāo)變化，可通過(guò)測(cè)定其中主要指標(biāo)變化分析摻偽情況。

化學(xué)計(jì)量識(shí)別方法包括主成分分析、聚類分析和判別分析等，能有效處理大量數(shù)據(jù)，通過(guò)建立直觀的基本假設(shè)，同類或相似的“樣本”間距離較近，不同樣的“樣本”間的距離應(yīng)較遠(yuǎn)，可根據(jù)各樣本的距離或距離函數(shù)來(lái)判別和分類，并利用分類的結(jié)果預(yù)報(bào)未知［13］。本文結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)中聚類分析、判別分析、多元線性回歸等處理方法，分析主要指標(biāo)變化情況，建立水牛奶中摻水和尿素的定性和定量模型，為水牛乳摻假鑒別提供理論參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

水牛乳取自廣西壯族自治區(qū)水牛研究所種畜場(chǎng)；超純水；氫氧化鈉、酚酞、尿素（分析純） 國(guó)產(chǎn)。

超純水一體機(jī)美國(guó)Milli-Q；多功能乳品分析儀Milko Scan FT120丹麥Foss；單通道牛奶冰點(diǎn)測(cè)試儀Model 4250美國(guó)Advanced。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1水牛乳取樣在2014年3、4、5、6月份間隨機(jī)采取處于正常泌乳期的健康水牛鮮生乳樣，每天早上8點(diǎn)采樣。其中3月27、28日，4月11日，5月29、30日，6月4、5、6日共采集8批次用于摻水實(shí)驗(yàn)；6月16～30日共采集9批次用于摻水和尿素實(shí)驗(yàn)，共采集17批次。

1.2.2水牛乳摻假樣制備每批生鮮水牛乳采樣后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并立即用500目濾布過(guò)濾去除雜質(zhì)，取一定量的水牛乳，分別摻入比例（v/v）為0%、5%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%的超純水，得到不同摻水量的水牛乳樣品共80份（10份/批次×8批次），每個(gè)比例水牛乳摻水樣250 mL，在3 min內(nèi)充分混勻，用于各個(gè)指標(biāo)的測(cè)定，作為訓(xùn)練集建立模型。另取2批次水牛乳采用同樣的配制方法制備不同摻水比例，分別是取3月28日的水牛乳樣制備1%～4%、6%～9%的摻水樣；取6月5日的水牛乳樣制備11%～14%、16%～19%、21%～24%、26%～29%、40%的摻水樣，均作為驗(yàn)證樣，共計(jì)25份。

先配制50%（m/m）尿素水牛奶儲(chǔ)備液150 mL，超聲30 min充分溶解，取一定量的水牛乳，分別將儲(chǔ)備液稀釋為質(zhì)量比是0%、0.02%、0.1%、0.5%、1%、2%的水牛乳尿素?fù)郊贅悠?，共獲得摻尿素樣品54（6份/批次×9批次）份；同時(shí)分別制備摻水（v/v）和摻尿素（m/m）的混合摻假水牛乳樣品即10%水+0.1%尿素、10%水+1%尿素、20%水+0.5%尿素、20%水+1.5%尿素共36（4份/批次×9批次）份，均作為訓(xùn)練集。另外取6月24日水牛乳采用同樣的方法制備不同摻假比例的驗(yàn)證樣，分別是0.02%、0.5%、1%、1.5%各2份和2%的5份，共計(jì)13份。

1.2.3水牛乳滴定酸度按照GB 5413.34-2010的方法測(cè)定，平行3次。

1.2.4水牛乳冰點(diǎn)采用Advanced Model 4250單通道牛奶冰點(diǎn)測(cè)試儀測(cè)定，平行3次。

1.2.5水牛乳蛋白質(zhì)、脂肪、全乳固體、非脂乳固體、乳糖采用福斯Milko Scan FT120多功能乳品分析儀測(cè)定，平行3次。

1.2.6數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010處理原始數(shù)據(jù)，采用IBM SPSS 20.0軟件進(jìn)行聚類分析、Fish判別分析和多元逐步線性回歸分析，利用Origin 8.6軟件制作相關(guān)圖表。

2　結(jié)果與分析

2.1水牛乳中摻水和尿素定性鑒別模型的建立

2.1.1聚類分析建立水牛乳摻偽定性鑒別模型聚類分析是研究樣品或指標(biāo)分類問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)分析方法，根據(jù)研究對(duì)象特征對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行分類的一種多元分析技術(shù)，把性質(zhì)相近的個(gè)體歸為一類，使得同一類中的個(gè)體都具有高度的同質(zhì)性，不同類之間的個(gè)體具有高度的異質(zhì)性，達(dá)到分類的目的［14］。本文以7個(gè)指標(biāo)含量平均值為變量，采用組間聯(lián)接和Pearson相關(guān)性的方法對(duì)3類水牛乳摻假樣品進(jìn)行聚類分析，其中單一摻水樣（0%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%）為第一類，單一摻尿素樣（0%、0.02%、0.1%、0.5%、1%、2%）為第二類，混合摻水和尿素樣（10%水+0.1%尿素%、10%水+1%尿素、20%水+0.5%尿素%、20%水+1.5%尿素）為第三類。聚類分析的樹形見圖1，圖中將Pearson相關(guān)系數(shù)按比例調(diào)整到0～25的范圍，再用逐級(jí)連線的方式將相近的個(gè)案并為一類。摻水和尿素改變了正常水牛乳的膠體性液體體系，不同的摻假量影響程度不同，故聚類分析并非區(qū)分摻假物種類，而是將理化指標(biāo)變化相似的樣品歸類。從圖上可以清晰地看出各種摻偽樣的分辨情況，通過(guò)聚類分析將摻偽樣分成了兩大類，第一大類為水牛乳中摻入10%水+1%尿素、20%水+1.5%尿素、0.5%尿素、1%尿素、2%尿素，其余為第二大類。在小一級(jí)的分類中，如距離系數(shù)為0-1的分級(jí)，各分類的相關(guān)系數(shù)在0.893～0.997之間，差異很小，難以區(qū)分；而距離系數(shù)大于3的分類中，各分類的相關(guān)系數(shù)在-0.607～0.766之間，能夠很好地進(jìn)行分辨。純奶在距離系數(shù)為2時(shí)與0.02%尿素乳、0.1%尿素乳聚類一類，相關(guān)性很好，皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.883，不能很好地分辨，但純奶在距離系數(shù)大于15的更大聚類中皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別為-0.022和-0.607，差異較大，能夠和其他摻偽樣區(qū)分開來(lái)。綜合上述的結(jié)果，聚類分析能夠較好地區(qū)分未摻假乳和摻假乳，可以用于一定差異水牛乳摻假樣的區(qū)分，但對(duì)差異較小的摻假樣分辨能力存在一定的局限。

圖1　水牛乳摻偽樣聚類分析圖Fig.1　Cluster analysis of buffalo milk adulterants

2.1.2Fisher判別分析建立水牛乳摻偽定性鑒別模型Fisher判別分析是用已知分類樣本的觀測(cè)指標(biāo)構(gòu)造一些彼此正交（不相關(guān)）的綜合指標(biāo)即判別函數(shù)，這些綜合指標(biāo)可以將屬于不同類的個(gè)體盡可能的分開，然后計(jì)算出每個(gè)類的綜合指標(biāo)的均值，即每個(gè)類的中心點(diǎn)。當(dāng)計(jì)算出一個(gè)新樣品的各個(gè)綜合指標(biāo)的值之后，就分別計(jì)算出新樣品到每個(gè)類中心點(diǎn)的距離，把它歸于離中心點(diǎn)的距離最短的那一類［15］。以7個(gè)理化指標(biāo)含量為自變量，以不同摻偽量為類別區(qū)分依據(jù)，使用步進(jìn)式方法，按照Wilks’lambda原則，使用F的概率小于0.05進(jìn)入大于0.10刪除的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判別分析，逐個(gè)分析每個(gè)指標(biāo)對(duì)模型判別的貢獻(xiàn)能力并剔除貢獻(xiàn)不顯著的變量，剔除了滴定酸度，其他6個(gè)指標(biāo)進(jìn)入模型，獲得2個(gè)典則判別函數(shù)，分別如下：

Y1=53.598+122.502X1+4.940X2+2.922X3-3.054X4+ 1.328X5+4.794X6

Y2=-38.403-33.999X1+12.018X2+9.370X3-9.730X4+ 1.430X5+12.968X6

函數(shù)中X1～X6分別表示冰點(diǎn)、蛋白質(zhì)、脂肪、全乳固體、非脂乳固體和乳糖。均為進(jìn)入模型的6個(gè)指標(biāo)的線性組合，其特征值分別為978.78和19.58，分別能夠解釋模型方差變化的98.0%和2.0%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為99.9%，包含了摻偽樣品的主要信息，可以用于區(qū)分不同摻偽乳的差異。將各個(gè)摻偽乳的6個(gè)理化指標(biāo)代入函數(shù)獲得判別得分，并作散點(diǎn)圖，結(jié)果見圖2。

圖2　水牛乳摻偽樣判別函數(shù)得分散點(diǎn)圖Fig.2　Scatter plot of canonical discriminant functions on buffalo milk adulterants

由圖2可知，同一個(gè)摻偽比例不同批次的水牛乳判別得分散開成群，這是因?yàn)樗Ｈ榈睦砘渴艿斤曫B(yǎng)條件、氣候、品種、季節(jié)等外在因素的影響會(huì)在較小的范圍內(nèi)變動(dòng)，本研究是在3～6月期間對(duì)尼里-拉菲、麼拉、高代三品種雜交、一代雜交等多個(gè)品種的水牛進(jìn)行取樣，獲得具有代表性的理化指標(biāo)正常波動(dòng)范圍。從圖2中可知，在單一摻水乳中，判別分析法能夠較好地區(qū)分純奶與摻入量為7%以上的摻水奶，隨著摻水量的增大，數(shù)據(jù)區(qū)域從上到下依次分布。在單一摻尿素乳中，除了摻入0.02%尿素的水牛乳與純奶的位置部分重合，不便于直觀區(qū)分，其他摻偽量的水牛乳樣品間均能清晰明了地分辨，摻尿素量在0.1%以上的水牛乳均能與未摻假乳區(qū)分。建立的判別函數(shù)同樣能夠很好地將四組摻入尿素和水的水牛乳區(qū)分開，但是摻入10%水+0.1%尿素的水牛乳與摻水量7%～9%的位置較為接近，原因可能是摻0.1%尿素影響了摻水所引起的水牛乳體系變化，消除了一部分理化指標(biāo)的波動(dòng)，使之與單獨(dú)摻水為8%左右的水牛乳相同。與聚類分析法相比較，判別分析能夠更好更直觀地區(qū)分未摻偽樣和摻偽樣，摻偽含量差異越大，區(qū)分越明顯。

典則判別函數(shù)直觀描述了不同摻偽情況理化指標(biāo)之間的關(guān)系，但不便于對(duì)未知摻偽水牛乳的客觀判斷，為此，建立Fisher線性判別函數(shù)對(duì)未知樣品的摻偽情況進(jìn)行判別。將全部訓(xùn)練集的乳樣品理化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行Fisher判別分析初探，發(fā)現(xiàn)摻入0.02%尿素、0.1%尿素、0.5%尿素、10%水+0.1%尿素的摻假乳有較多的誤判情況，說(shuō)明此方法不能很好的判別低于這些摻假量的水牛乳，故去除這四種摻偽奶樣品后用剩下的水牛乳樣品重新建立判別模型，以進(jìn)入模型的6個(gè)理化指標(biāo)為基礎(chǔ)，建立4個(gè)Fisher線性判別函數(shù)，分別描述未摻假乳、單一摻水乳、單一摻尿素乳和摻水和尿素乳的特征。各個(gè)Fisher線性判別函數(shù)的系數(shù)見表1。

表1　水牛乳摻偽樣Fisher線性判別函數(shù)系數(shù)Table 1　Coefficients of Fisher’s 1inear discriminant functions of buffalo milk adulterants

將任意一個(gè)樣品的6個(gè)理化指標(biāo)測(cè)定數(shù)值分別代入4個(gè)Fisher線性判別函數(shù)，計(jì)算得到6個(gè)函數(shù)值，數(shù)值最大者代表該樣品屬于相應(yīng)類別，將摻假乳訓(xùn)練集數(shù)據(jù)回代到4個(gè)線性判別函數(shù)進(jìn)行判別結(jié)果檢驗(yàn)，見表2。最后判別分析結(jié)果未摻偽乳和摻水乳樣品分別出現(xiàn)2個(gè)和6個(gè)被誤判，摻尿素乳、摻水和尿素的混摻乳樣品全部被正確判別，4組摻偽樣的判別正確率分別達(dá)到93.75%、95.31%、100%、100%，說(shuō)明建立的判別模型是可靠的，能夠用于水牛乳的定性鑒偽。

表2　Fisher線性判別函數(shù)對(duì)原始數(shù)據(jù)的判別結(jié)果Table 2　Coefficients results of original data by Fisher’s 1inear discriminant functions

為了檢驗(yàn)構(gòu)建的判別分析模型的可靠性，將未參與建模的48個(gè)不同摻偽情況的樣本代入上述4個(gè)方程進(jìn)行預(yù)測(cè)驗(yàn)證，判別分析結(jié)果見表3。從表3可知，48個(gè)未參加建模的水牛乳樣，未摻假乳類、摻尿素乳類、摻水和尿素乳類全部判別準(zhǔn)確，摻水乳類有一個(gè)被誤判，判別效果良好，可認(rèn)為這些變量的選擇適用于水牛乳摻偽，驗(yàn)證了Fisher線性判別分析應(yīng)用于摻假水牛乳的鑒偽是成功的。

表3　Fisher線性判別函數(shù)對(duì)驗(yàn)證集數(shù)據(jù)的判別結(jié)果Table 3　Coefficients results of validation sets data by Fisher’s 1inear discriminant functions

2.2多元逐步線性回歸建立水牛乳單一摻水和摻尿素的定量預(yù)測(cè)模型

2.2.1水牛乳中摻水和尿素定量鑒別模型的建立采用多元逐步線性回歸建立水牛乳單一摻水和摻尿素的定量預(yù)測(cè)模型，將16個(gè)純水牛奶樣、48個(gè)摻雜不同體積比水含量（5%、10%、15%、20%、25%、30%）的摻水乳、40個(gè)摻雜不同質(zhì)量比尿素含量（0.02%、0.1%、0.5%、1%、2%）的摻尿素乳樣品作為訓(xùn)練集。以摻混量作為因變量，7個(gè)理化指標(biāo)的數(shù)據(jù)作為自變量，采用IBM SPSS 20.0對(duì)這些變量進(jìn)行多元逐步線性回歸擬合，得到的逐步線性回歸方程見表4。所建立定量模型中，R2均達(dá)到0.98以上，p小于0.0001，說(shuō)明所建模型的穩(wěn)定性和擬合效果較好。

2.2.2水牛乳摻水和尿素定量模型的可行性檢驗(yàn)隨機(jī)選擇3個(gè)純水牛乳樣、25個(gè)不同體積比的摻水乳和13個(gè)不同質(zhì)量比的摻尿素乳樣品作為驗(yàn)證集，對(duì)建立的定量模型方程進(jìn)行預(yù)測(cè)能力檢驗(yàn)，采用外部驗(yàn)證方法對(duì)所建模型的實(shí)際預(yù)測(cè)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表4　水牛乳摻假的多元逐步線性回歸分析Table 4　Summary of stepwise regression analysis of adulterated-buffalo milk

圖3　水牛乳摻水驗(yàn)證集樣本預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間關(guān)系Fig.3　Relation between true concentration and predicted concentration of water in buffalo milk of validation set

圖3和圖4分別是采用模型對(duì)獨(dú)立的不同水和尿素含量驗(yàn)證集樣品實(shí)測(cè)值（x）和模型預(yù)測(cè)值函數(shù)（y）間關(guān)系的線性擬合，6個(gè)方程的相關(guān)系數(shù)RP均大于0.99，R2均大于0.98，說(shuō)明利用多元逐步線性回歸法建立的水牛乳單一摻水和摻尿素定量預(yù)測(cè)模型可以滿足定量分析要求，具有一定的有效性。

圖4　水牛乳摻尿素驗(yàn)證集樣本預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間關(guān)系Fig.4　Relation between true concentration and predicted concentration of urea in buffalo milk of validation set

3　結(jié)論

3.1聚類分析法能夠較好地區(qū)分未摻假乳和摻假乳，可以用于一定差異水牛乳摻假樣的區(qū)分，但對(duì)差異較小的摻假樣分辨能力存在一定的局限。

3.2Fisher判別分析中典則判別函數(shù)得分散點(diǎn)圖能夠直觀地區(qū)分未摻偽樣和摻偽樣，且摻偽含量差異越大，分區(qū)越明顯；Fisher線性判別函數(shù)能夠?qū)ξ粗獡絺稳闃悠愤M(jìn)行判別，對(duì)未摻偽乳、摻水乳、0.5%以上摻尿素乳、摻水和尿素乳的判別正確率很高，判別效果良好。

3.3多元逐步線性回歸法構(gòu)建的水牛乳單一摻水和單一摻尿素定量模型可以用于摻雜含量的預(yù)測(cè)。其中單一摻水乳4個(gè)定量模型、單一摻尿素乳2個(gè)定量模型實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù)Rp分別為0.9956、0.9934、0.9937、0.9938、0.9986、0.9991，模型預(yù)測(cè)值于真實(shí)值很接近，可滿足檢測(cè)需求。

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Study on authentic identification of water and urea in buffalo milk based on chemo metrics methods

HUANG Li，LIN Bo，LI Ling，ZENG Qing-kun*，TANG Yan，YANG Pan，F(xiàn)ENG Ling，NONG Hao-ru
（Guangxi Buffalo Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530001，China）

The qualitative identification and quantitative prediction model of buffalo milk adulterated with water and urea were established by seven main quality indicators of the buffalo milk combined with chemo metrics methods．The cluster analysis was well able to distinguish pure and adulterated buffalo milk samples.Canonical discriminant function coefficients could intuitively distinguish mixed samples adulterated with different contents of adulteration，and coefficients of Fisher’s linear discriminant functions worked well for qualitative identification of unknown buffalo milk adulteration.Multiple linear step regression method built six quantitative models，which the correlation coefficients RPof real value and predicted value were 0.9956，0.9934，0.9937，0.9938，0.9986，0.9991，respectively，and could quantitative identification of authentic buffalo milk.

buffalo milk；adulteration；physical and chemical indicators；chemo metrics methods

TS252.7

A

1002-0306（2015）16-0053-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.002

2014－11－18

黃麗（1986-），女，碩士研究生，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：乳品科學(xué)，E-mail：huangli00206@163.com。

曾慶坤（1968-），男，碩士研究生，研究員，研究方向：食品科學(xué)與技術(shù)，E-mail：zqk456@163.com。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題（2013BAD18B12-03）；廣西科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科攻12118011-2A）；2014年廣西水牛研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（水牛基1404005）。