微波法輔助提取葡萄葉白藜蘆醇及其純化研究

孫磊磊，康　?。ㄐ陆髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046）

微波法輔助提取葡萄葉白藜蘆醇及其純化研究

孫磊磊，康健*
（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046）

以新疆南部巴州地區(qū)赤霞珠葡萄葉為原料，采用微波輔助法提取葡萄葉中的白藜蘆醇，并NKA-Ⅱ樹脂進(jìn)行純化。實(shí)驗(yàn)表明：微波輔助法提取葡萄葉白藜蘆醇的最佳工藝條件為：乙醇濃度40%，微波功率640 W，時(shí)間76 s，料液比1∶92，在此條件下提取白藜蘆醇為13.52 mg/g；經(jīng)過靜態(tài)實(shí)驗(yàn)篩選，采用NKA-Ⅱ樹脂對(duì)白藜蘆醇粗品進(jìn)行純化，其純化的最佳工藝參數(shù)為：6 BV、濃度3 mg/mL、pH4的白藜蘆醇樣液以2 BV/h通過樹脂，用4倍柱體積90%的乙醇以3 BV/h的流速洗脫效果最佳，純度由35.7352 mg/g提高到了181.5888 mg/g。結(jié)論：雖然微波輔助法的提取率不是最高的，但時(shí)間短，有利于工業(yè)生產(chǎn)，純化雖然有一定效果，但仍需進(jìn)一步研究。

葡萄葉，白藜蘆醇，微波，純化

白藜蘆醇是一種生物性很強(qiáng)的天然多酚類物質(zhì)，又稱為芪三酚，具有抗菌［1-3］、抗炎［4］、抗氧化［5-7］、抗癌［8-9］、預(yù)防心血管疾?。?0-12］等活性，在藥品及食品制備上有著重要的應(yīng)用［13］。新疆是中國(guó)第一大葡萄產(chǎn)區(qū)，2011年新疆葡萄總種植面積已達(dá)到13.33萬hm2。葡萄種植期間需要多次除去植株外周葉片，加上葡萄采摘后田間管理需要打葉壓藤越冬等操作，葡萄生產(chǎn)中每公頃地可產(chǎn)生數(shù)十噸葡萄葉片［14］。目前國(guó)內(nèi)對(duì)葡萄葉開發(fā)利用尚不多，主要集中在總黃酮的研究上。邊梅娜等［15］采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取赤霞珠葡萄葉總黃酮的工藝條件，當(dāng)乙醇提取濃度為56%，液料比為40∶1（mL/g），提取時(shí)間2.1 h，提取溫度80℃時(shí)赤霞珠葡萄葉中總黃酮的提取率為5.61%。張縱圓等［16］采用正交實(shí)驗(yàn)法研究葡萄葉總黃酮的最佳提取工藝條件，確立了葡萄葉總黃酮最佳提取條件為45%的乙醇為溶劑、液料比為1∶40、提取溫度為60℃、提取時(shí)間2 h，葡萄葉總黃酮含量為5.329 mg/g。若將葡萄葉作為另一種白藜蘆醇的提取新來源，充分利用葡萄葉資源，同時(shí)優(yōu)選出低成本的提取方法進(jìn)而開發(fā)成相應(yīng)的保健食品、藥品等，便可以變廢為寶，為新疆葡萄資源的合理利用開辟新途徑［12］。

微波是一種波長(zhǎng)為0.001～1 m、頻率為0.3～300 GHz的電磁波。微波輔助提取中藥有效成分具有選擇性好、提取純度高和高效快速的特點(diǎn)［17-18］。本實(shí)驗(yàn)擬利用微波輔助提取新疆南部巴州地區(qū)赤霞珠葡萄葉中的白藜蘆醇，利用紫外分光光度法測(cè)定其含量，并與傳統(tǒng)溶劑浸提法、超聲波輔助提取法進(jìn)行比較，應(yīng)用單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化獲得的最佳微波輔助提取工藝，并從9種樹脂中篩選出適宜葡萄葉白藜蘆醇純化的樹脂，以期得到純度高雜質(zhì)少的白藜蘆醇。該研究將為白藜蘆醇的快速有效提取提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

赤霞珠葡萄葉新疆南部巴州地區(qū)；無水乙醇、甲醇等均為分析純；白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；AB-8、ADS-8、D3520、D101、ADS-17、X-5、NKA-9、NKA-Ⅱ、HPD-500天津南開和成科技有限公司。

電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋鞏義市英峪予華儀器廠；SHB-Ⅲ循環(huán)式多用真空泵鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；微波爐格蘭仕微波爐電器有限公司；Spectrumlab 53紫外可見分光光度計(jì)上海棱光技術(shù)有限公司；真空冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作本實(shí)驗(yàn)室自制，具體方法見文獻(xiàn)［19］。精密稱取干燥恒重的白藜蘆醇對(duì)照品5.9 mg，于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得到0.118 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

分別精密吸取對(duì)照品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL置于10 mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度分別為3.54、7.08、10.62、14.16、17.70 μg/mL的對(duì)照品溶液。以甲醇做參比，分別測(cè)定306 nm吸光度，以吸光度對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸。

1.2.2白藜蘆醇的提取稱取烘干至恒質(zhì)量、質(zhì)量為1.0 g粉碎至40目的葡萄葉粉于錐形燒瓶中，以40%乙醇為提取溶劑，選擇不同的微波功率、微波時(shí)間和料液比進(jìn)行處理，真空抽濾，吸取上清液測(cè)定浸取液吸光度值，并計(jì)算白藜蘆醇的含量。

1.2.2.1微波功率對(duì)微波提取白藜蘆醇的影響準(zhǔn)確稱取5份葡萄葉粉，分別按微波功率160、320、480、640、800 W，料液比1∶90，微波處理45 s。

1.2.2.2微波時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取的影響準(zhǔn)確稱取6份葡萄葉粉，按微波功率640 W，料液比1∶90，分別處理15、30、45、60、75、90 s。

1.2.2.3料液比對(duì)白藜蘆醇提取的影響準(zhǔn)確稱取5份葡萄葉粉，按微波功率640 W，料液比分別為1∶30、1∶60、1∶90、1∶120、1∶150，微波處理75 s。

1.2.2.4響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以微波功率、微波時(shí)間、料液比3個(gè)因子為自變量，分別用A、B、C表示，以白藜蘆醇的含量為響應(yīng)值設(shè)計(jì)了三因素三水平（如表1所示）共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)包括12個(gè)析因點(diǎn)和5個(gè)零點(diǎn)，以隨機(jī)次序進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

表1　三因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)方案Table 1　Results of central composite tests with three factors

1.2.3白藜蘆醇的純化

1.2.3.1樹脂的預(yù)處理預(yù)處理：取一定量的大孔樹脂，用95%的乙醇浸泡24 h，用95%乙醇洗滌至流出液體無渾濁，接著用蒸餾水洗滌至無醇味，再依次用0.5%HCl浸泡4 h，用蒸餾水洗滌至pH呈中性，再用2%NaOH浸泡4 h，最后用蒸餾水洗滌至pH呈中性備用［20］。

濕法裝柱：裝柱前先在柱中加入一定量的蒸餾水，接著將混有蒸餾水的大孔樹脂倒入層析柱中。裝柱后樹脂間不得有氣泡且分布均勻。

1.2.3.2靜態(tài)吸附和靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)稱量9份50 g經(jīng)預(yù)處理的AB-8、ADS-8、D3520、D101、ADS-17、X-5、NKA-9、NKA-Ⅱ和HPD-500樹脂于150 mL的具塞錐形瓶中，再加入40 mL的白藜蘆醇的濃縮液（濃度為1 mg/mL），用塞子塞好，振蕩速度為160次/min，放入常溫的恒溫振蕩器中振蕩，每隔一定時(shí)間測(cè)定錐形瓶溶液的白藜蘆醇濃度，測(cè)定時(shí)間設(shè)為：0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 h，并按下式計(jì)算吸附率（%）和吸附量（mg/g）。繪制靜態(tài)等溫吸附動(dòng)力曲線。

式中：Q—為吸附量，mg/g干樹脂；A—為吸附率，%；C1—為吸附前白藜蘆醇溶液濃度，mg/mL；C2—為吸附后溶液中白藜蘆醇濃度，mg/mL；V—為溶液體積，mL；W—為樹脂重量，g。

1.2.3.3靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)分別稱取5 g吸附有白藜蘆醇的的樹脂，依次加入50 mL體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液和無水乙醇（100%）進(jìn)行洗脫，放入25℃恒溫振蕩器中振蕩24 h，振蕩速度為160次/min，過濾收集濾液，按下式計(jì)算解吸率（%）。

式中：D—為解吸率，%；V—為解吸液體積，mL；C3—為解吸后溶液中白藜蘆醇濃度，mg/mL；W—為樹脂重量，g；Q—為吸附量，mg/g干樹脂。

1.2.3.4樹脂的動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)根據(jù)大孔樹脂吸附率、吸附量和解吸率綜合評(píng)價(jià)，從AB-8、ADS-8、D3520、D101、ADS-17、X-5、NKA-9、NKA-Ⅱ和HPD-500樹脂中篩選最適大孔樹脂，預(yù)處理后濕法裝柱，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附、解吸實(shí)驗(yàn)。

a.上樣流速對(duì)吸附白藜蘆醇的影響將5份已進(jìn)行前處理的60 mL最佳樹脂分別濕法裝柱（2 cm× 60 cm），將濃度為3 mg/L、pH4的上樣液60 mL（1 BV）以1、2、3、4、5 BV/h不同流速經(jīng)過樹脂，進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)并計(jì)算吸附率。

b.上樣液濃度對(duì)吸附白藜蘆醇的影響將5份已進(jìn)行前處理的60 mL最佳樹脂分別濕法裝柱（2 cm×60 cm），將濃度分別為為1、2、3、4、5 mg/L、pH4的上樣液60 mL（1 BV）以2 BV/h的流速經(jīng)過樹脂，進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)并計(jì)算吸附率。

c.動(dòng)態(tài)吸附泄漏曲線將已進(jìn)行前處理的60 mL NKA-Ⅱ樹脂濕法裝柱（2 cm×60 cm），將濃度為3 mg/L、pH4的上樣液分別以0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8倍柱體積、以2 BV/h流速經(jīng)過樹脂，進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)并計(jì)算吸附率。

d.上樣液pH對(duì)吸附白藜蘆醇的影響將5份已進(jìn)行前處理的60 mL最佳樹脂分別濕法裝柱（2 cm× 60 cm），將濃度為3 mg/L、pH分別為3、4、5、6、7的6 BV上樣液以2 BV/h流速經(jīng)過樹脂，進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)并計(jì)算吸附率。

1.2.3.5樹脂的動(dòng)態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)

a.洗脫流速對(duì)解吸白藜蘆醇的影響將5份已進(jìn)行前處理的60 mL最佳樹脂分別濕法裝柱（2 cm× 60 cm），將濃度為3 mg/L、pH分別為4的6 BV上樣液以2 BV/h流速經(jīng)過樹脂，樹脂飽和后，用蒸餾水洗至洗脫液無色，再用3 BV的90%乙醇溶液分別以1、2、3、4、5 BV/h不同流速進(jìn)行洗脫，并計(jì)算解吸率。

b.洗脫劑用量對(duì)解吸白藜蘆醇的影響將已進(jìn)行前處理的60 mL最佳樹脂分別濕法裝柱（2 cm× 60 cm），將濃度為3 mg/L、pH4的6 BV上樣液以2 BV/h流速經(jīng)過樹脂，樹脂飽和后，用蒸餾水洗至洗脫液無色，再用3 BV的90%乙醇溶液以3 BV/h的流速進(jìn)行洗脫，然后將流出液分段收集，每30 mL（0.5 BV）收集一份并測(cè)定其白藜蘆醇濃度。

2　結(jié)果與分析

2.1測(cè)定波長(zhǎng)的確定

圖1　白藜蘆醇標(biāo)樣紫外掃描圖Fig.1　Ultraviolet scanning figure of resveratrol standard sample

在Spectrumlab 53紫外可見分光光度計(jì)上進(jìn)行285～320 nm范圍內(nèi)掃描，由圖1可知，其最大吸收波長(zhǎng)為306 nm，因此確定測(cè)定白藜蘆醇的波長(zhǎng)為306 nm。

2.2白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2　白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Resveratrol standard curve

由圖2可知，得回歸方程y=0.1164x+0.0129（R2= 0.9984，y為吸光度，c為白藜蘆醇濃度，單位為μg/mL）。結(jié)果表明，白藜蘆醇檢測(cè)濃度在3.5～17.5 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.3白藜蘆醇的提取

2.3.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1.1微波功率對(duì)微波提取白藜蘆醇的影響微波功率對(duì)提取葡萄葉白藜蘆醇的影響如圖3所示，隨著微波功率的增大，白藜蘆醇的提取率增加，這是由于微波功率增大時(shí)，溫度隨之升高，白藜蘆醇的提取量也隨之增大，當(dāng)功率達(dá)到640 W后，液體開始有沸騰現(xiàn)象，此時(shí)白藜蘆醇的提取量最大，當(dāng)功率繼續(xù)增大時(shí)白藜蘆醇的提取量反而下降，這可能是因?yàn)槿芤簻囟冗^高導(dǎo)致原料中白藜蘆醇結(jié)構(gòu)受到破壞，從而導(dǎo)致白藜蘆醇提取量降低，所以微波功率選擇640 W為宜。

圖3　微波功率對(duì)微波提取白藜蘆醇的影響Fig.3　Effect of microwave power on microwave extraction of resveratrol

2.3.1.2微波時(shí)間對(duì)微波提取白藜蘆醇的影響微波時(shí)間對(duì)提取葡萄葉白藜蘆醇的影響如圖4所示，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)白藜蘆醇提取量逐漸增加，當(dāng)時(shí)間增加到75 s后隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)白藜蘆醇的提取量反而下降。這可能是由于隨著微波輻射時(shí)間的延長(zhǎng)，溶液溫度升高，溶液開始沸騰，但考慮到長(zhǎng)時(shí)間爆沸會(huì)導(dǎo)致溶劑揮發(fā)較多，并且溫度過高會(huì)導(dǎo)致白藜蘆醇活性降低，所以輻射時(shí)間選擇75 s為宜。

圖4　微波時(shí)間對(duì)微波提取白藜蘆醇的影響Fig.4　Effect of microwave time on microwave extraction of resveratrol

2.3.1.3料液比對(duì)微波提取白藜蘆醇的影響料液比對(duì)提取葡萄葉白藜蘆醇的影響如圖5所示，當(dāng)料液比為1∶90時(shí)提取白藜蘆醇的量最高，當(dāng)料液比小于1∶90時(shí)，由于溶劑較少，無法使白藜蘆醇完全浸出，但當(dāng)提取液使用量較多時(shí)，白藜蘆醇含量反而降低，可能由于料液的提高雖然會(huì)在較大的提高傳質(zhì)推動(dòng)，但其他物質(zhì)的溶出也迅速增加，反而阻礙了白藜蘆醇的溶解，因此選擇料液比為1∶90，即溶劑體積為90 mL。

圖5　料液比對(duì)微波提取白藜蘆醇的影響Fig.5　Effect of solvent ratio on microwave extraction of resveratrol

2.3.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert程序?qū)Ρ?中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，分析得到微波功率、微波時(shí)間和料液比與白藜蘆醇含量之間的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=13.48+0.015A＋0.27B＋0.32C－0.012AB＋0.14AC－0.003719BC－1.48A2－1.76B2－1.68C2。

表2　三因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Results of central composite tests with three factors and three levels

由表3知模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著，表明該方程

表3　回歸分析結(jié)果Table 3　Results of regression analysis

對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合情況好，實(shí)驗(yàn)誤差小。回歸方程較好地描述了各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，因此，可以用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。由該回歸方程做出中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)所得的3組響應(yīng)曲面圖如圖6～圖8所示，確定出最佳提取工藝條件，可知白藜蘆醇含量的理論最大值為13.50 mg/g，其所對(duì)應(yīng)的提取條件為：微波功率640.76 W、微波時(shí)間75.77 s、料液比1∶91.93。

圖6　微波功率和時(shí)間對(duì)微波提取白藜蘆醇的影響Fig.6　Effect of microwave power and time on microwave extraction of resveratrol

圖7　微波功率和料液比對(duì)微波提取白藜蘆醇的影響Fig.7　Effect of microwave power and solid-liquid on microwave extraction of resveratrol

圖8　微波時(shí)間和料液比對(duì)微波提取白藜蘆醇的影響Fig.8　Effect of microwave time and solid-liquid on microwave extraction of resveratrol

表4　不同方法提取葡萄葉白藜蘆醇的比較Table 4　The comparison of different methods to extract grape leaves resveratrol leaves resveratrol

表5　不同樹脂的參數(shù)以及對(duì)白藜蘆醇的靜態(tài)吸附、解吸性能Table 5　Parameter of different resins and their adsorption and desorption properties on resveratrol

2.3.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)根據(jù)軟件得到的結(jié)果，考慮實(shí)驗(yàn)的可操作性，將最佳反應(yīng)條件調(diào)整為料液比1∶92，微波時(shí)間76 s，微波功率640 W，在此條件下提取白藜蘆醇為13.52 mg/g，驗(yàn)證了方程的可靠性。

2.3.4不同方法提取葡萄葉白藜蘆醇的比較由表4可知，比較有機(jī)溶劑浸提法、超聲輔助法提取法和微波輔助提取法，雖然微波輔助提取法的提取率最低，但就提取時(shí)間而言，微波輔助提取法所需時(shí)間（1.2667 min即76 s）遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于有機(jī)溶劑浸提法時(shí)間（240 min）和超聲輔助提取法所需時(shí)間（59 min），節(jié)約時(shí)間，適于工廠生產(chǎn)。

2.4白藜蘆醇的純化

2.4.1樹脂篩選的結(jié)果選擇樹脂主要考慮樹脂的粒徑、比表面積、平均孔徑、極性等。從表5可以看出，本實(shí)驗(yàn)選擇了極性不同的樹脂，包括非極性、弱極性、中極性與極性樹脂。一般來講，極性稍強(qiáng)的樹脂對(duì)極性強(qiáng)的分子有較強(qiáng)的吸附作用；非極性樹脂對(duì)非極性分子的吸附作用較強(qiáng)；孔徑較大的樹脂易于吸附分子體積較大的物質(zhì)；樹脂的比表面積越大，其吸附容量也越大［18］。白藜蘆醇的分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，顯弱極性，但由于羥基數(shù)目并不多，只有3個(gè)酚羥基，因此有利于弱極性和極性樹脂的吸附。從表5可以看出，NKA-Ⅱ的吸附率最高，平衡吸附量最大，綜合考慮其吸附效果與解吸效果，選擇NKA-Ⅱ作為最佳樹脂，來分離純化葡萄葉中的白藜蘆醇。

圖9NKA-Ⅱ樹脂的靜態(tài)吸附曲線Fig.9　Static adsorption curve NKA-Ⅱresin

2.4.2靜態(tài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.2.1NKA-Ⅱ樹脂對(duì)葡萄葉白藜蘆醇的靜態(tài)吸附曲線從圖9可以看出，在吸附開始階段，NKA-Ⅱ樹脂對(duì)白藜蘆醇的吸附速度很快，曲線斜率較大，0.5 h后吸附速度逐漸減緩，曲線斜率明顯減小，1 h后趨于平緩，3 h后接近吸附飽和。從時(shí)間與吸附率方面綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇3 h作為靜態(tài)吸附時(shí)間。

圖10　不同濃度乙醇對(duì)NKA-Ⅱ樹脂的解吸率的影響Fig.10　Effect of different concentration of ethanol on NKA-II resin desorption rate

2.4.2.2乙醇濃度對(duì)NKA-Ⅱ樹脂的靜態(tài)解吸率的影響從圖10可以看出，隨著乙醇濃度的增加，對(duì)白藜蘆醇的洗脫效果也越來越好，乙醇濃度為90%時(shí)解吸率達(dá)到了96%，但之后乙醇濃度再增加，解吸率開始降低，因此選擇90%乙醇作為洗脫劑。

2.4.3動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.3.1上樣流速對(duì)NKA-Ⅱ樹脂吸附白藜蘆醇的影響將已進(jìn)行前處理的60 mL NKA-Ⅱ樹脂濕法裝柱（2 cm×60 cm），將濃度為3 mg/L、pH4的上樣液60 mL（1 BV）以不同流速經(jīng)過樹脂，得到上樣流速與吸附率的關(guān)系如圖11所示。隨著上樣流速的逐漸增大，樹脂的吸附率相應(yīng)減少，這是因?yàn)榱魉龠^快會(huì)導(dǎo)致樹脂未能達(dá)到吸附飽和而降低了樹脂的吸附作用，考慮到工作效率，本實(shí)驗(yàn)確定最佳的上樣流速為2 BV/h。

圖11　上樣流速對(duì)吸附率的影響Fig.11　Effect of sample flow rate on adsorption rate

2.4.3.2上樣液濃度對(duì)NKA-Ⅱ樹脂吸附白藜蘆醇的影響將已進(jìn)行前處理的60 mL NKA-Ⅱ樹脂濕法裝柱（2 cm×60 cm），將不同濃度、pH為4的上樣液60 mL（1 BV）以2 BV/h流速經(jīng)過樹脂，得到上樣液濃度與吸附率的關(guān)系如圖12所示，隨著上樣液濃度的逐漸增大，樹脂的吸附率也相應(yīng)增加，當(dāng)濃度為3 mg/mL時(shí)吸附率達(dá)到最大，之后隨著上樣液濃度的進(jìn)一步增大，吸附率下降，這有可能是由于上樣液的濃度過大時(shí)會(huì)導(dǎo)致樹脂的微孔堵塞從而降低了樹脂的利用率。因此，本實(shí)驗(yàn)確定最佳的上樣液濃度為3 mg/mL。

圖12　上樣液濃度對(duì)吸附率的影響Fig.12　Effect of sample concentration on adsorption rate

2.4.3.3NKA-Ⅱ樹脂的動(dòng)態(tài)吸附泄漏曲線將已進(jìn)行前處理的60 mL NKA-Ⅱ樹脂濕法裝柱（2 cm× 60 cm），將濃度為3 mg/L、pH4的上樣液分別以不同柱體積、2 BV/h流速經(jīng)過樹脂，結(jié)果如圖13所示，隨上樣量的增加，流出液中白藜蘆醇的濃度也不斷增加，當(dāng)上樣量達(dá)到6倍柱體積時(shí)，流出液的顏色明顯加深，這說明葡萄葉白藜蘆醇出現(xiàn)明顯泄漏，當(dāng)達(dá)到7倍柱體積時(shí)樹脂已基本達(dá)到飽和狀態(tài)，為了避免浪費(fèi)，本實(shí)驗(yàn)選擇上樣量為6 BV。

2.4.3.4上樣液pH對(duì)NKA-Ⅱ樹脂吸附白藜蘆醇的影響將已進(jìn)行前處理的60 mL NKA-Ⅱ樹脂濕法裝柱（2 cm×60 cm），將濃度為3 mg/L、pH分別為3、4、5、6、7的上樣液6 BV以2 BV/h流速經(jīng)過樹脂，得到上樣液pH與吸附率的關(guān)系如圖14所示，在pH4時(shí)NKA-Ⅱ樹脂對(duì)葡萄葉白藜蘆醇的吸附率可達(dá)到87.84%，因此，本實(shí)驗(yàn)確定最佳的上樣液pH為4。

圖13　葡萄葉白藜蘆醇的動(dòng)態(tài)吸附泄漏曲線Fig.13　The dynamic adsorption leakage curve of grape leaf resveratrol

圖14　上樣液pH對(duì)吸附率的影響Fig.14　Effect of sample solution pH on adsorption rate

2.4.3.5洗脫流速對(duì)NKA-Ⅱ樹脂解吸白藜蘆醇的影響將6 BV濃度3 mg/mL、pH4的白藜蘆醇樣液以2 BV/h通過NKA-Ⅱ樹脂（60 mL），先用蒸餾水洗至洗脫液無色，再用3 BV的90%乙醇溶液以不同流速進(jìn)行洗脫，洗脫流速與解吸率的關(guān)系如圖15所示，隨流速的增加解析率下降，這是由于乙醇流速過快時(shí)，樹脂與乙醇的接觸時(shí)間較短，不利于解吸，同時(shí)考慮到流速過慢時(shí)，時(shí)間延長(zhǎng)，增加生產(chǎn)成本，因此，綜合考慮本實(shí)驗(yàn)確定最佳的洗脫流速為3 BV/h。

圖15　洗脫流速對(duì)解吸率的影響Fig.15　Effect of elution velocity on desorption rate

2.4.3.6洗脫劑用量對(duì)NKA-Ⅱ樹脂解吸白藜蘆醇的影響將6 BV濃度3 mg/mL、pH4的白藜蘆醇樣液以2 BV/h通過NKA-Ⅱ樹脂（60 mL），先用蒸餾水洗至洗脫液無色，再用90%的乙醇以3 BV/h的速率進(jìn)行洗脫，然后將流出液分段收集，每30 mL（0.5 BV）收集一份并測(cè)定其白藜蘆醇濃度，結(jié)果如圖16所示，4 BV的90%乙醇基本可以將白藜蘆醇洗脫下來。

圖16　解吸曲線Fig.16　The desorption curve

2.4.4白藜蘆醇純度測(cè)定結(jié)果將上樣液真空濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，紫外分光光度法測(cè)定其含量為35.7352 mg/g；6 BV濃度3 mg/mL、pH4的白藜蘆醇樣液以2 BV/h通過樹脂，用4倍柱體積90%的乙醇以3 BV/h的流速洗脫，再將洗脫液真空濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，紫外分光光度法測(cè)定其含量可達(dá)到181.5888 mg/g，純度提高了5.08倍。

3　結(jié)論

采用微波輔助法提取葡萄葉中的白藜蘆醇，其最佳工藝條件為：料液比1∶92，微波時(shí)間76 s，微波功率640 W，在此條件下提取白藜蘆醇為13.52 mg/g；并通過比較大孔樹脂的物理參數(shù)、靜態(tài)吸附率和解吸率，篩選出NKA-Ⅱ樹脂作為純化葡萄葉白藜蘆醇的樹脂。純化的最佳條件為：上樣流速為2 BV/h、上樣濃度3 mg/mL、上樣量為6 BV、上樣液的pH為4、用4倍柱體積90%的乙醇以3 BV/h的流速洗脫白藜蘆醇，其雖然純度由35.7352 mg/g提高到了181.5888 mg/g，但其他雜質(zhì)成分較多，純化效果不太理想，需進(jìn)一步研究從葡萄葉分離純化白藜蘆醇的工藝條件。

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Study on microwave assisted extraction and purification of resveratrol from grape leaves

SUN Lei-lei，KANG Jian*
（College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China）

Cabernet Sauvignon grape leaves collected from Bazhou area in southern Xinjiang were used as the subjects to extract resveratrol through microwave assistant method，and NKA-Ⅱ resin for purification. Experiments showed that the optimum technological conditions for extraction of resveratrol from grape leaves assisted by microwave method were ethanol concentration 40%，microwave power 640 W，extraction time 76 s，ratio of solid to liquid 1∶92.Under these conditions，the extraction of resveratrol was 13.52 mg/g.Through the static test screening，resveratrol the crude product was purified using NKA-II resin.The optimum technological conditions were as follows：the sample solution volume was 6 BV，the concentration of resveratrol 3 mg/mL，the pH of absorbing stock solution was 4，the dynamically absorbing rate of flow was 2 BV/h，with four times the column volume of，90%ethanol solution as desorption agent under flow rate 3 BV/h.And the purity increased from 35.7352 mg/g to 181.5888 mg/g.Conclusion：Although the extraction rate of microwave assisted method was not the highest，but the time was short，and was suitable for industrial production，purification although had certain effect，but still need further research.

grape leaves；resveratrol；microwave；purification

TS201.1

B

1002-0306（2015）20-0271-08

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.048

2015-03-09

孫磊磊（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品加工技術(shù)，E-mail：sunleilei1988@126.com。

康?。?959-），男，副教授，博士，研究方向：食品加工技術(shù)，E-mail：kangjian505@sina.com。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD27B02-04-02）。