乙?；男詫γ自鞍坠δ苄再|的影響

任仙娥，楊　鋒，*，黃永春，楊德華，黃　雪（.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006；2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州545006；3.廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西柳州545006）

乙?；男詫γ自鞍坠δ苄再|的影響

任仙娥1，2，3，楊鋒1，2，3，*，黃永春1，2，3，楊德華1，黃雪1
（1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006；2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州545006；3.廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西柳州545006）

采用乙?；瘜γ自鞍走M行改性，研究了米渣蛋白在乙?；男赃^程中巰基和二硫鍵含量、表面疏水性、溶解性以及乳化性的變化。結果表明，隨改性程度的增加，米渣蛋白中暴露巰基含量逐漸增加，總游離巰基含量逐漸下降，二硫鍵含量逐漸增加，表面疏水性先下降后升高。乙?；男院蟮拿自鞍自趐H5～10范圍內的溶解性、乳化活性和乳化穩(wěn)定性明顯增加，但是pH2～4范圍內的溶解性和乳化活性卻有所降低?？梢?，乙?；男阅芨纳泼自鞍椎牟糠止δ苄再|。

乙?；男裕自鞍?，功能性質

對蛋白質進行改性的方法主要有物理改性、化學改性和生物學改性等。筆者曾采用水力空化技術對米渣蛋白進行改性，發(fā)現(xiàn)水力空化在一定條件下能改善米渣蛋白的部分功能性質［3］。乙?；男允堑鞍踪|化學改性中常用的手段，研究表明乙?；男阅苡行У馗纳频鞍踪|的溶解性、乳化性、起泡性等功能性質。如大豆分離蛋白經乙?；男院笃淙芙庑浴⑷榛院推鹋菪悦黠@提高［4］，蠶蛹蛋白經乙?；男院笕芙庑员雀男郧疤岣吡?9.27%［5］，乙?；男院蟮拿娼畹鞍踪|溶解性、乳化能力和起泡能力均得到了提高［6］?；诖?，本文采用乙?；瘜γ自鞍走M行改性，研究乙?；男詫γ自鞍兹芙庑院腿榛缘挠绊懀约耙阴；男赃^程中米渣蛋白暴露巰基、游離巰基、二硫鍵含量的變化和表面疏水性的變化情況，為拓寬米渣蛋白的應用提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

濕米渣（經測定含水量為49.5%） 廣西柳州順意來生物科技有限公司；福林酚試劑、牛血清白蛋白、5，5-二巰基-2，2-二硝基苯甲酸（DTNB）、8-苯胺-1-萘磺酸（ANSA）上?？笊锛夹g有限公司；其他試劑均為分析純。

722分光光度計上海精密科學儀器有限公司；100LK高剪切混合乳化頭上海威宇機電制造有限公司；Avanti J-26 XPI高速冷凍離心機Beckman Coulter公司；F-320熒光分光光度計天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1米渣蛋白的制備采用堿提酸沉法提取米渣蛋白。稱取100 g濕米渣，加入2000 mL pH10.0的NaOH溶液，于40℃下攪拌提取4 h，5000 r/min離心分離10 min，取上清液用1 mol/L鹽酸溶液調pH至4.5，靜置，5000 r/min離心分離10 min取沉淀，用200 mL蒸餾水水洗沉淀2次，再用1 mol/L NaOH調pH至7.0，冷凍干燥，所得產品即為米渣蛋白［3］。經微量凱氏定氮法測定蛋白質含量為70.4%，可能還含有淀粉、糊精等多糖類成分。

1.2.2乙?；男悦自鞍讌⒄瘴墨I［7］的方法，稍作修改，具體操作方法如下：稱取3 g米渣蛋白分散于100 mL蒸餾水中，配制成濃度為3%（w/v）蛋白分散液，再用2 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH至8.0，逐漸加入適量乙酸酐，并維持分散液的pH在7.5～8.5，待分散液的pH穩(wěn)定在8.0后，繼續(xù)反應1 h，使米渣蛋白與乙酸酐的酰化反應完全，整個過程控制反應溫度在40℃。反應結束后，用1 mol/L鹽酸溶液調節(jié)pH至4～4.5，于5000 r/min離心10 min，棄上清液，取沉淀，沉淀經100 mL蒸餾水水洗2次后冷凍干燥，即得乙酰化米渣蛋白。分別添加0.06、0.15、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9 g乙酸酐，使乙酸酐與米渣蛋白配比分別在0.02、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 g/g，進行乙酰化反應來制備不同改性程度的米渣蛋白。

牢固樹立生態(tài)文明理念，切實保護土地資源，合理利用土地資源，建設友好型草牧業(yè)經濟發(fā)展生態(tài)環(huán)境。優(yōu)化生態(tài)環(huán)境，科學配置資源，建設和完善草牧業(yè)生產防護體系，構筑生態(tài)安全屏障，為草地安全生產保駕護航。挖掘草地生產資源，科學規(guī)劃草地建設，因地制宜，綜合措施，變資源優(yōu)勢為經濟發(fā)展優(yōu)勢。協(xié)調草地生產與生態(tài)建設關系，建設經濟發(fā)展與環(huán)境保護機制，實現(xiàn)草產業(yè)經濟可持續(xù)發(fā)展。

1.2.3米渣蛋白乙酰化改性程度的測定采用茚三酮比色法，參照文獻［8］測定米渣蛋白的乙?；男猿潭?。具體測定方法為：將米渣蛋白樣品用蒸餾水配制成濃度為1%（w/v）的蛋白溶液，取1 mL于10 mL比色管中，加入0.1%的茚三酮溶液，再加入1 mL pH8.0磷酸鹽緩沖液，混合后在100℃的沸水浴中加熱15 min，冷卻，加水至10 mL。以蒸餾水代替蛋白溶液作為空白，測定其在580 nm處的吸光度。以此方法分別測出乙?；男郧昂竺自鞍讟悠返奈舛?，再按下式計算米渣蛋白乙?；男猿潭?。

乙酰化改性程度（%）=（未改性的米渣蛋白吸光度-改性后的米渣蛋白吸光度）/未改性的米渣蛋白吸光度×100

1.2.4米渣蛋白溶解性的測定稱取100 mg米渣蛋白樣品，溶于10 mL蒸餾水中，再用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液調節(jié)pH分別至2～10，然后置于振蕩器中振搖30 min，使其充分溶解，再于10000 r/min離心10 min，取上清液以牛血清白蛋白為標準采用福林-酚比色法測定蛋白質含量［9］，以上清液中蛋白質含量（mg/mL）來表示米渣蛋白的溶解性。

1.2.5米渣蛋白乳化性的測定配制0.1%（w/v）的米渣蛋白溶液，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液調節(jié)pH分別至2～10，再參照文獻［10］采用經典的比濁法，分別測定不同改性程度的米渣蛋白在pH2～10范圍內的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

1.2.6米渣蛋白巰基和二硫鍵含量的測定參照文獻［11］，分別測定不同改性程度的米渣蛋白的總游離巰基、暴露巰基和二硫鍵的含量。

1.2.7米渣蛋白表面疏水性的測定采用ANS熒光探針法測定不同改性程度的米渣蛋白的表面疏水性，參照文獻［12］，略作修改，具體操作方法如下：將不同改性程度的米渣蛋白樣品用0.01 mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液分別配制成濃度為0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL的蛋白溶液，取蛋白溶液4 mL，加入10 μL、8 mmol/L的ANSA，混合均勻后靜置3 min。在熒光分光光度計下，設定激發(fā)波長384 nm、發(fā)射波長450 nm，狹縫寬5 nm，測定熒光強度。用熒光強度對蛋白溶液濃度作圖并進行線性回歸，以線性回歸斜率作為表面疏水性指數。

1.3數據處理

采用SPSS 19.0對數據進行統(tǒng)計分析，實驗結果以平均值±標準差表示。

2　結果與分析

2.1不同改性程度米渣蛋白的制備

蛋白質的?；磻饕堑鞍追肿又械挠H核基團攻擊酸酐羰基碳原子所誘發(fā)的一類親核取代反應，賴氨酸的ε-氨基、脂肪族氨基酸的羥基以及巰基均可以參加乙酰化反應，其中賴氨酸的ε-氨基其親核能力強、空間位阻小，參與乙?；磻幕钚暂^強［13］。在一定條件下，蛋白質的酰化改性程度與酸酐的種類和用量有關，因此可以通過調節(jié)乙酸酐與米渣蛋白的配比來制備不同改性程度的米渣蛋白，結果如圖1所示。由圖1可知，當乙酸酐與米渣蛋白的配比小于0.1 g/g時，米渣蛋白的乙?；男猿潭入S著二者配比的增加而不斷增加；當配比達到0.1 g/g時，改性程度達到63.5%；當配比繼續(xù)增加達到0.2 g/g時，改性程度也繼續(xù)增加達到84.4%；當配比超過0.2 g/g后，改性程度增加不明顯。因此選擇配比在0.02、0.05、0.1、0.2 g/g，分別制備乙?；男猿潭葹?6.4%、48.1%、63.5%和84.4%的米渣蛋白，研究乙酰化改性對米渣蛋白功能性質的影響。

圖1　不同改性程度米渣蛋白的制備Fig.1　Preparation of different acetylation extent of rice residue protein

2.2乙?；男詫γ自鞍讕€基和二硫鍵含量的影響

通過測定米渣蛋白在乙?；男赃^程中總游離巰基（包括暴露在分子表面和包裹在分子內部的巰基）、暴露巰基（暴露在分子表面的巰基）和二硫鍵的含量變化，不僅可反映出米渣蛋白中巰基參與?；磻那闆r，還可根據暴露巰基的變化情況反映乙?；男詫γ自鞍追肿咏Y構的影響。如圖2所示，米渣蛋白在改性前暴露巰基含量為2.98 μmol/g，隨著改性程度的增加，暴露巰基含量逐漸升高，當改性程度達到84.4%時，暴露巰基含量為5.54 μmol/g，說明乙?；男允姑自鞍追肿由煺归_來，包埋在分子內部的巰基暴露出來。改性前總游離巰基含量為6.84 μmol/g，隨著改性程度的增加，總游離巰基含量逐漸下降，當改性程度達到84.4%時，總游離巰基含量為5.92 μmol/g，說明有部分巰基參與乙酰化反應或被氧化形成二硫鍵。改性前二硫鍵含量為11.5 μmol/g，隨著改性程度的增加，二硫鍵含量逐漸增加，當改性程度達到84.4%時，二硫鍵含量為23.8 μmol/g，說明有部分巰基被氧化形成分子間或分子內的二硫鍵，使二硫鍵含量升高。

圖2　乙酰化改性對米渣蛋白巰基和二硫鍵含量的影響Fig.2　Effect of acetylation on sulfhydryl and disulfide bond contents of rice residue protein

2.3乙?；男詫γ自鞍妆砻媸杷缘挠绊?/p>

如圖3所示，米渣蛋白的表面疏水性隨改性程度的增加呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢，Gruener等［14］在研究油菜籽12S球蛋白乙?；男赃^程中理化性質的變化時發(fā)現(xiàn)相同趨勢；Kim等［15］在乙?；蠖沟鞍字幸灿^察到類似結果。在改性程度小于48.1%時，米渣蛋白的表面疏水性隨改性程度的增加一直下降，其原因可能是在這個階段，賴氨酸上帶正電荷的ε-氨基被中性的乙酰基取代，米渣蛋白表面電荷急劇改變，極性基團出現(xiàn)頻數增加而非極性（疏水性）基團頻數下降，以及由于極性基團增多的排斥效應使表面的疏水性基團重新定向或翻轉指向于內部的疏水性區(qū)域［16］，表現(xiàn)為表面疏水性下降。當改性程度大于48.1%后，米渣蛋白的表面疏水性隨改性程度的增加開始上升，在這個階段，賴氨酸的ε-氨基乙?；罅咳〈自鞍追肿幼冃陨煺归_來（圖2中暴露巰基的增加也證實這點），蛋白內部的疏水性基團大量暴露出來，表現(xiàn)為米渣蛋白表面疏水性增加。

圖3　乙?；男詫γ自鞍妆砻媸杷缘挠绊慒ig.3　Effect of acetylation on surface hydrophobicity of rice residue protein

2.4乙酰化改性對米渣蛋白溶解性的影響

米渣蛋白經乙?；男院笤趐H2～10范圍內的溶解性如圖4所示。未改性的米渣蛋白在pH4～5溶解性最低，其原因可能是此區(qū)域處于米渣蛋白的等電點附近，蛋白質在等電點區(qū)域時其表面凈電荷為零，分子間的靜電排斥效應減小，分子之間易形成聚集物，表現(xiàn)為溶解性低，偏離等電點的區(qū)域，靜電排斥效應增加，溶解性增加。改性后的米渣蛋白pH3～4溶解性最低。尹壽偉等［16］研究?；瘜κ|豆蛋白功能性質的影響時發(fā)現(xiàn)?；幚碚T導蕓豆蛋白等電點區(qū)域向酸性偏移從4.5～5.0降低到3.0～4.0，與本文研究結果相似，其原因可能是帶正電荷的賴氨酸ε-氨基被電中性的乙酰根取代，導致蛋白質表面負電荷增加，等電點向酸性方向偏移。在pH5～10范圍內，米渣蛋白的溶解性隨著乙酰化改性程度的增加出現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當改性程度小于63.5%時，溶解性隨改性程度的增大而增加，其原因可能是電中性的乙酰根取代了帶正電荷的氨基，使米渣蛋白表面的凈負電荷增加，靜電排斥效應增加，抑制了米渣蛋白分子間的聚集，表現(xiàn)為溶解性增加；當改性程度達到63.5%時，溶解性達到最大；當改性程度繼續(xù)增加時，溶解性反而降低，結合圖3可知，當乙?；潭雀邥r，米渣蛋白分子伸展開來，內部疏水性基團暴露，表面疏水性大幅增加，使溶解性降低。

圖4　乙?；男詫γ自鞍兹芙庑缘挠绊慒ig.4　Effect of acetylation on solubility of rice residue protein

2.5乙酰化改性對米渣蛋白乳化性的影響

蛋白質的乳化性可通過乳化活性和乳化穩(wěn)定性兩個指標來表征。研究表明，蛋白質的乳化性與其溶解性和表面疏水性密切相關，并且當蛋白質的溶解性較低時，乳化性受溶解性的影響很大，當蛋白質的溶解性較高時，乳化性則受表面疏水性的影響較大［13］。乙?；男詫γ自鞍兹榛钚缘挠绊懭鐖D5所示。在pH2～4時，改性后的米渣蛋白乳化活性均低于未改性的蛋白，歸因于在此pH范圍內改性后的蛋白溶解性低于未改性的蛋白；在pH5～10時，改性后的米渣蛋白乳化活性均高于未改性的蛋白，并且隨著改性程度的增加，乳化活性也增加，其原因可能是一方面改性程度低于63.5%的蛋白溶解性比未改性的蛋白高，另一方面結合圖2和圖3來看，改性程度高于48.1%的米渣蛋白分子結構伸展開來，表面疏水性增加，促使乳化活性增加。

圖5　乙酰化改性對米渣蛋白乳化活性的影響Fig.5　Effect of acetylation on emulsifying activity index of rice residue protein

乙?；男詫γ自鞍兹榛€(wěn)定性的影響如圖6所示，改性后米渣蛋白的乳化穩(wěn)定性在所試pH范圍內得到明顯改善。Lawal［17］研究?；ㄉ鞍椎娜榛再|和Mirmoghtadaie［18］研究?；帑湹鞍椎娜榛再|時都得到相似結果。歸因于乙酸酐的加入使蛋白的凈負電荷增加，脂肪球周圍帶電層形成，帶電層形成后導致其在界面上與水化層相互排斥，降低了界面能量，阻礙了液滴的聚集，導致乳化穩(wěn)定性增加。

圖6　乙?；男詫γ自鞍兹榛€(wěn)定性的影響Fig.6　Effect of acetylation on emulsion stability index of rice residue protein

3　結論

米渣蛋白的乙?；男猿潭入S著乙酸酐與米渣蛋白配比的增加而不斷增加，當酸酐蛋白比為0.2 g/g時，乙?；男猿潭瓤蛇_到84.4%，之后繼續(xù)增加酸酐蛋白比，改性程度增加不明顯。在乙酰化改性過程中，隨改性程度的增加，暴露巰基含量逐漸增加，游離巰基含量逐漸下降，二硫鍵含量逐漸增加，表面疏水性先下降后升高。改性后的米渣蛋白等電點向酸性方向偏移（從pH4～5偏移到pH3～4）；溶解性在pH2～4下降、pH5～10明顯增加；乳化活性在pH2～4時均低于未改性的蛋白，在pH5～10時均高于未改性的蛋白，并且隨著改性程度的增加，乳化活性也增加；乳化穩(wěn)定性在所測試的pH范圍內得到明顯改善。由此可見，乙?；男栽谝欢l件下能改善米渣蛋白的部分功能性質，但是關于乙?；男詫γ自鞍椎奈锘匦匀绶肿恿糠植?、凈電荷和結構有什么樣的影響以及結構和功能之間的關系如何，還需進一步研究。

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Effect of acetylated modification on the functional properties of rice residue proteins

REN Xian-e1，2，3，YANG Feng1，2，3，*，HUANG Yong-chun1，2，3，YANG De-hua1，HUANG Xue1
（1.Department of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China；2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources，Liuzhou 545006，China；3.Key Laboratory for Processing of Sugar Resources of Guangxi Higher Education Institutes，Liuzhou 545006，China）

Acetylation was applied to modify rice residue proteins.Sulfhydryl（SH）and disulfide bond（SS）contents，surface hydrophobicity（H0），protein solubility（PS）and emulsifying activities were evaluated.With increasing of the extent of acetylation，exposed SH content was increased，total free SH content was decreased，SS content was increased，H0was decreased first，and then increased.PS emulsifying activity index（EAI）and emulsion stability index（ESI）of rice residue proteins were improved at pH5～10 by acetylation，but PS and EAI was decreased at pH2～4.The data suggested that some functional properties of rice residue proteins could be improved by acetylation.

acetylation；rice residue protein；functional property

TS201.2

A

1002-0306（2015）20-0116-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.015

2015－01－20

任仙娥（1979-），女，碩士，高級實驗師，研究方向：食品大分子結構與功能，E-mail：renxiane@126.com。

楊鋒（1978-），男，博士，副教授，研究方向：食品加工技術與過程強化，E-mail：yangfeng78@126.com。