耐熱乳酸菌的篩選及其β-半乳糖苷酶性質(zhì)分析

李夢(mèng)菲，孫慶惠，張　彥，楊洪江，*（.工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；.天津雙聯(lián)科鑫生物科技有限公司，天津300403）

耐熱乳酸菌的篩選及其β-半乳糖苷酶性質(zhì)分析

李夢(mèng)菲1，孫慶惠1，張彥2，楊洪江1，*
（1.工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.天津雙聯(lián)科鑫生物科技有限公司，天津300403）

本研究從雞糞樣品中分離高產(chǎn)β-半乳糖苷酶的耐熱乳酸菌，經(jīng)16S rRNA序列鑒定，分離得到的6株菌株均為羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）。初步分析分離菌株所產(chǎn)β-半乳糖苷酶，其最適pH均為6.5。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株MF1567產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶在55℃溫育1 h，仍保持51.2%的酶活力。分析菌株MF1567的β-半乳糖苷酶氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該菌株中β-半乳糖苷酶LacZ存在22個(gè)氨基酸替代，其二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋的比例較高（26.5%）。結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變可能是該酶具有較好耐熱性的原因。

乳酸菌，β-半乳糖苷酶，耐熱，氨基酸序列

乳糖是乳及乳制品中特有的糖類，是人體正常代謝和生長(zhǎng)發(fā)育的能量來(lái)源之一。人體攝入乳糖后，存在于小腸粘膜絨毛膜表面的β-半乳糖苷酶（betagalactosidase，EC3.2.1.23）將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，從而被人體吸收利用。當(dāng)人體缺乏β-半乳糖苷酶或酶活力較低時(shí)，乳糖不能被消化吸收，滯留在腸道，從而導(dǎo)致人體出現(xiàn)腸脹氣、腸痙攣、腹瀉等癥狀，稱為乳糖不耐癥（Lactose Intolerance，LI）［1］。我國(guó)β-半乳糖苷酶缺乏的發(fā)生率為75%～95%，在0～6歲兒童中的發(fā)生率為47%，而且發(fā)生率隨兒童年齡的增加而上升［2-3］。利用β-半乳糖苷酶水解乳糖的能力生產(chǎn)低乳糖乳制品能有效消除人體對(duì)乳糖的不耐受癥狀，是目前β-半乳糖苷酶在食品工業(yè)中最主要的用途［4］。

1998年我國(guó)食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)正式確定β-半乳糖苷酶為食品添加劑新品種，β-半乳糖苷酶進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)階段。微生物由于具有生長(zhǎng)迅速、代謝效率高等特性，而成為商品β-半乳糖苷酶的主要來(lái)源。在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，利用熱穩(wěn)定的中性β-半乳糖苷酶生產(chǎn)低乳糖乳制品不僅能有效防止微生物污染，還能縮短生產(chǎn)周期。然而，商業(yè)化的產(chǎn)酶菌株必須是美國(guó)FDA認(rèn)定的GRAS（generally regarded as safe）安全菌株。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）作為公認(rèn)的食品級(jí)微生物，其產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶被認(rèn)為具有工業(yè)應(yīng)用潛力。目前，人們已篩選出多株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的乳酸菌菌株，如嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）等［5］。然而，大多數(shù)乳酸菌合成的β-半乳糖苷酶都不具有熱穩(wěn)定性。異源表達(dá)卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus）β-半乳糖苷酶基因，獲得的重組β-半乳糖苷酶在50℃溫育30 min后幾乎失去全部活力［6］。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）R22合成的β-半乳糖苷酶已被證明可用于乳品工業(yè)，但該酶僅在4℃最穩(wěn)定，也不具有熱穩(wěn)定性［7］。

雞腸道中有著豐富的微生物菌群，乳酸桿菌是雞腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群，成熟的雞腸道中大約70%的微生物是乳酸桿菌［8-9］。此外，禽類的正常體溫略高于其他動(dòng)物，因此本文選擇從雞糞樣品中篩選能夠產(chǎn)生耐熱β-半乳糖苷酶的乳酸菌，對(duì)高產(chǎn)酶的耐熱菌株進(jìn)行了鑒定，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)其β-半乳糖苷酶編碼基因進(jìn)行了同源性分析，以期為β-半乳糖苷酶的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮雞糞從北京周邊地區(qū)的3個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)采集新鮮雞糞樣品共11份；鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG，超純級(jí)）、β-巰基乙醇（生化級(jí)） 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal） Promega公司；乳糖分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；PCR緩沖液（超純級(jí)）、Taq DNA聚合酶（超級(jí)純）、三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs，超級(jí)純） 上海生工生物工程有限公司；Z-buffer（pH7.0） 磷酸氫二鈉16.68 g，磷酸二氫鈉5.64 g，氯化鉀0.745 g，硫酸鎂0.246 g，用雙蒸水溶解，定容到1000 mL，使用前加β-巰基乙醇2.7 mL；分離、純化培養(yǎng)基（g/L）蛋白胨10，牛肉膏8，酵母浸粉4，乳糖20，乙酸鈉5，檸檬酸三銨2，硫酸鎂0.2，磷酸二氫鉀2，Tween-80 1 mL，硫酸錳0.05，瓊脂15，pH5.0；乳糖-MRS（L-MRS）培養(yǎng)基（g/L） 蛋白胨10，牛肉膏8，酵母浸粉4，乳糖20，乙酸鈉5，檸檬酸三銨2，硫酸鎂0.2，磷酸二氫鉀2，Tween-80 1 mL，硫酸錳0.05，pH6.4。

752紫外光柵分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDA-8002型水浴鍋天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)室電爐有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱賽默世爾科技公司；PCR基因擴(kuò)增儀美國(guó)BIO-RAD公司；pH計(jì)Mettler-Toledo公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1產(chǎn)β-半乳糖苷酶耐熱乳酸菌的分離分別稱取不同雞糞樣品1 g至盛有9 mL滅菌生理鹽水的試管中，充分振蕩混勻后，放入50℃水浴鍋中溫育2 h。將熱處理的雞糞樣品液稀釋至10-3，取稀釋度為10-1、 10-2、10-3的菌懸液各100 μL涂布在含有20 mg/mL X-gal的分離培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落。挑取藍(lán)色菌落、編號(hào)并進(jìn)行純化。

將純化的單菌落接種至含有5 mL L-MRS液體培養(yǎng)基的試管中，35℃靜置培養(yǎng)10 h后轉(zhuǎn)接二級(jí)種子，二級(jí)種子經(jīng)35℃靜置培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)接至L-MRS發(fā)酵培養(yǎng)基（100 mL/250 mL），接種量均為1%。取1 mL各菌株的發(fā)酵液至試管中，加入3 mL Z-buffer，混勻后加入80 μL氯仿，充分振蕩后在50℃溫育2 h，在37℃分別測(cè)定溫育前后的β-半乳糖苷酶活力。

1.2.2β-半乳糖苷酶活力的測(cè)定β-半乳糖苷酶活力的測(cè)定方法主要參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行［10-11］。取1 mL發(fā)酵液至試管中，加入3 mL Z-buffer，混勻后加入80 μL氯仿充分振蕩，在37℃水浴條件下加入800 μL ONPG（4 mg/L）并開(kāi)始計(jì)時(shí)，觀察溶液變成黃色時(shí)，立即加入1 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，12000 r/min離心3 min，取上清液測(cè)定OD420。

β-半乳糖苷酶活力單位（U）定義為：在實(shí)驗(yàn)條件下以1 μmol/min的速率釋放鄰硝基酚（ONP）所需的酶量。

計(jì)算公式：β-半乳糖苷酶活力（U/g）=（OD420×f× V）/（4.5254×t×m），其中：f為粗酶液稀釋倍數(shù)；V為反應(yīng)體積（mL）；4.5254為420 nm處1 μmol/mL ONP的吸光度，即ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；t為反應(yīng)時(shí)間（min）；m為1 mL發(fā)酵液中的菌體干重（g）。

相對(duì)酶活力（%）定義為：以不同條件下測(cè)定的最大酶活力為100%，不同條件下測(cè)定的酶活力與最大酶活力的比率。

1.2.3分離菌株的分子鑒定收集35℃靜置培養(yǎng)12 h的菌體細(xì)胞，按參考文獻(xiàn)的方法提取細(xì)菌基因組DNA［12］，作為擴(kuò)增16S rRNA基因的DNA模板。用PCR方法擴(kuò)增高產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株16S rRNA基因，引物為27f（5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’）和1492r（5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’）［13］。PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定，并在NCBI網(wǎng)站上利用BLAST軟件對(duì)所得的DNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，在GenBank中選擇嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）和多株乳酸桿菌（Lactobacillus）作為參比菌株，用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析高產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株的進(jìn)化地位［14］。

1.2.4β-半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1.2.4.1β-半乳糖苷酶最適pH的測(cè)定配制pH為5.0、5.5、6.0的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，配制pH為6.5、7.0、7.5、8.0的0.1 mol/L PBS緩沖液。取1 mL發(fā)酵液至試管中，加入3 mL不同pH的緩沖液和80 μL氯仿充分振蕩，按1.2.2方法測(cè)定β-半乳糖苷酶活力。

1.2.4.2β-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性的測(cè)定取1 mL發(fā)酵液至試管中，加入3 mL Z-buffer和80 μL氯仿，充分振蕩后將試管分別至于45、50、55℃水浴鍋中溫育4 h，按1.2.2方法測(cè)定β-半乳糖苷酶活力。

1.2.5β-半乳糖苷酶基因序列分析分別以羅伊氏乳桿菌SD2112（Lactobacillus reuteri SD2112）的β-半乳糖苷酶編碼基因lacZ（GenBank accession no. AEI56354）、lacL（GenBank accession no.AEI57702）和lacM（GenBank accession No.AEI57703）的序列為模板設(shè)計(jì)引物。引物lacZ-F（5’TGGTAGCAAAGAA GTTATTGACGAG 3’）和lacZ-R（5’ACACTGGTTGA TTGAAAAAGGGTAG 3’）擴(kuò)增基因lacZ；引物lacL-F（5’CCTCTCCTCTTGCTATCTCA 3）和lacL-R（5’CCGTCACCACTAAGTCCTAA 3’）擴(kuò)增基因lacL；引物lacM-F（5’ACTTGACAAATACCCACA 3’）和lacMR（5’GAACATAGCAGCATAGAA 3’）擴(kuò)增基因lacM。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)（94℃變性1 min，退火1 min，72℃延伸1 min），循環(huán)結(jié)束后72℃終延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，使用ORF Finder（Open Reading Frame Finder）軟件預(yù)測(cè)β-半乳糖苷酶的氨基酸序列［15］，采用Compute pI/Mw在線分析軟件預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)［16-17］，采用PSIPRED預(yù)測(cè)β-半乳糖苷酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)［18］。在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中查找多個(gè)乳酸桿菌的β-半乳糖苷酶序列，并在EBI網(wǎng)站上運(yùn)用Clustal Omega軟件進(jìn)行比對(duì)分析［19-20］。

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)β-半乳糖苷酶耐熱乳酸菌的篩選

共分離得到11株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的耐熱乳酸菌。進(jìn)一步將分離菌株的β-半乳糖苷酶粗酶液在50℃水浴鍋中溫育2 h，測(cè)定β-半乳糖苷酶剩余活力，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　產(chǎn)β-半乳糖苷酶耐熱乳酸菌β-半乳糖苷酶活力的測(cè)定Table 1　Analysis of β-galactosidase activity

由表1可知，分離菌株MF1561、MF1566、MF1567和MF1572在37℃具有很高的酶活力，分別為1125.7、971.9、891.0和1138.9 U/g。50℃溫育后，菌株MF1561產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶活力僅剩9.3%，分離菌株MF1566、MF1567和MF1572的剩余酶活力比率分別為28.3%、61.7%和62.3%。此外，分離菌株MF1563、MF1574和MF1576的剩余酶活力比率較高，分別為61.8%、69.1%和48.1%。因此，最終選擇菌株MF1563、MF1566、MF1567、MF1572、MF1574和MF1576，共6株分離菌株進(jìn)行分析。

2.2分離菌株的16S rRNA鑒定

同源性比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖1，顯示6株分離菌株MF1563、MF1566、MF1567、MF1572、MF1574和MF1576與羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）的同源程度均為99%，因此確定6株菌株均為羅伊氏乳桿菌。羅伊氏乳桿菌是天然存在于脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)的乳酸菌，可改善腸道菌群的分布，并具有拮抗有害菌定植等益生功能［21］。我國(guó)衛(wèi)生部于2003年批準(zhǔn)了羅伊氏乳桿菌為可用于保健食品的益生菌菌株。

由圖1可以看出，根據(jù)16S rRNA基因序列，6株分離得到的羅伊氏乳桿菌分為兩類，羅伊氏乳桿菌MF1572為一類，其他羅伊氏乳桿菌為另一類。羅伊氏乳桿菌除與陰道乳桿菌（L.vaginalis）的親源關(guān)系最近外，與發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）的親源關(guān)系最近，而與嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）的親源關(guān)系較遠(yuǎn)，與雙歧桿菌（Bifidobacterium）的親源關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖1　基于16S rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1　Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

2.3β-半乳糖苷酶最適pH的測(cè)定

結(jié)果見(jiàn)圖2。6株羅伊氏乳桿菌在pH6.5時(shí)酶活力最高，即6株羅伊氏乳桿菌的最適pH均為6.5。

圖2　羅伊氏乳桿菌β-半乳糖苷酶最適pHFig.2　Optimum pH of the β-galactosidase from isolated L.reuteri strains

2.4β-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性的測(cè)定

進(jìn)一步考察MF1563、MF1566、MF1567、MF1572、MF1574、MF1576，6株羅伊氏乳桿菌β-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性。結(jié)果分別見(jiàn)圖3中的（a～c）。

圖3　羅伊氏乳桿菌β-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性Fig.3　Thermostable of β-galactosidase from L.reuteri strains

6株羅伊氏乳桿菌的β-半乳糖苷酶粗酶液在45℃溫育1 h后，菌株MF1563、MF1566和MF1572合成的β-半乳糖苷酶比較穩(wěn)定，分別剩余90.5%、88.0%和84.0%的酶活力；在45℃溫育2 h后，菌株MF1563的酶活力降低至63.7%，而菌株MF1566和MF1567仍具有85.4%和83.0%的酶活力；在45℃溫育4 h后，所有菌株的剩余酶活力均低于50%。

6株羅伊氏乳桿菌的粗酶液在50℃溫育1 h后，菌株MF1563和MF1572仍有超過(guò)65%的酶活力，菌株MF1566、MF1567和MF1576的剩余酶活力大于55%，繼續(xù)溫育，各菌株的酶活力逐漸降低。

6株羅伊氏乳桿菌的β-半乳糖苷酶粗酶液在55℃溫育15 min，菌株MF1572的酶活力迅速降低至43.8%，其余菌株仍具有超過(guò)60%的酶活力。55℃溫育30 min后，菌株MF1567剩余65.0%的酶活力，而其余5株羅伊氏乳桿菌的酶活力均迅速下降至50%以下，繼續(xù)溫育至1 h后，菌株MF1567剩余51.2%的酶活力，此后繼續(xù)保溫，菌株MF1567的剩余酶活力趨于穩(wěn)定，4 h后剩余酶活力為39.3%，而其余5株菌的酶活力隨著溫育時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，4 h后剩余約10%的酶活力。由此猜測(cè)，羅伊氏乳桿菌MF1567可能同時(shí)合成兩種β-半乳糖苷酶，其中一種不具有熱穩(wěn)定性，在55℃溫育1 h失去全部活力，而另一種β-半乳糖苷酶則具有相對(duì)熱穩(wěn)定性。

2.5β-半乳糖苷酶氨基酸序列同源性分析

將6株羅伊氏乳桿菌（MF1563、MF1566、MF1567、MF1572、MF1574和MF1576）的β-半乳糖苷酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京華大基因公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序的β-半乳糖苷酶基因序列上傳至GenBank，獲得的序列接收號(hào)見(jiàn)表2。

表2　分離菌株β-半乳糖苷酶基因序列接收號(hào)Table 2　β-galactosidase gene GenBank accession no.of 6 isolated strains

由于密碼子具有簡(jiǎn)并性，某個(gè)堿基的突變可能不會(huì)引起氨基酸序列的改變。在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索多株乳酸桿菌LacZ、LacL和LacM的氨基酸序列，分別與分離得到的6株羅伊氏乳桿菌進(jìn)行同源性比對(duì)。以羅伊氏乳桿菌SD2112的LacZ、LacL和LacM為100%，6株分離得到的羅伊氏乳桿菌的LacZ、LacL和LacM與羅伊氏乳桿菌SD2112的同源程度均大于97%，其中羅伊氏乳桿菌MF1567的LacL和LacM與羅伊氏乳桿菌SD2112的相似度達(dá)到100%。

2.6β-半乳糖苷酶LacZ的結(jié)構(gòu)分析

羅伊氏乳桿菌SD2112 LacZ的氨基酸活性位點(diǎn)Glu-150為質(zhì)子給予體，Glu-309為親核試劑；底物結(jié)合位點(diǎn)分別為Arg-111、Asn-149和Trp-317；金屬鋅離子結(jié)合位點(diǎn)分別為Cys-115、Cys-155、Cys-157和Cys-160［22］。在EBI網(wǎng)站上運(yùn)用Clustal Omega軟件將分離得到的6株羅伊氏乳桿菌LacZ序列與UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中的羅伊氏乳桿菌SD2112和MF2-2的LacZ氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，分離得到的6株羅伊氏乳桿菌與羅伊氏乳桿菌SD2112和MF2-2具有相同的保守氨基酸，結(jié)果見(jiàn)圖4。

然而，產(chǎn)耐熱β-半乳糖苷酶的羅伊氏乳桿菌MF1567的LacZ與參比菌株羅伊氏乳桿菌SD2112有22個(gè)氨基酸不同，通過(guò)PSIPRED蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件，在線預(yù)測(cè)羅伊氏乳桿菌MF1567 lacZ基因編碼的β-半乳糖苷酶二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示菌株MF1567的LacZ含有26.5%的α-螺旋和17.6%的β-折疊，而羅伊氏乳桿菌SD2112含有26.0%的α-螺旋和17.7%的β-折疊。羅伊氏乳桿菌MF1567比菌株SD2112多含有0.5%的α-螺旋結(jié)構(gòu)，這可能與其具有較好的熱穩(wěn)定性有關(guān)［23-24］。

圖4　LacZ氨基酸序列比對(duì)Fig.4　Amino acid sequences alignment of LacZ

2.7β-半乳糖苷酶LacLM的活性中心位點(diǎn)分析

羅伊氏乳桿菌lacL和lacM基因編碼的異源二聚體β-半乳糖苷酶屬于糖苷水解酶2族（GHF-2），lacL基因編碼β-半乳糖苷酶的大亞基，lacM基因編碼小亞基，而且單獨(dú)的LacL和LacM都沒(méi)有催化活性，只有當(dāng)lacL和lacM兩個(gè)基因同時(shí)表達(dá)時(shí)，才能獲得具有催化活性的β-半乳糖苷酶［25］。

利用POSITE在線分析羅伊氏乳桿菌GHF-2 LacLM的結(jié)構(gòu)域和功能標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LacL氨基酸序列存在兩個(gè)高度保守的序列，LacM無(wú)任何活性氨基酸位點(diǎn)。將同屬于糖苷水解酶2族的LacLM和大腸桿菌LacZ的保守序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表3。屬于同一糖苷水解酶家族的LacLM和大腸桿菌LacZ分別有41個(gè)保守氨基酸，其中有17個(gè)氨基酸有顯著性差異，占保守序列的41.5%。

表3　糖苷水解酶2族LacLM和LacZ保守序列對(duì)比Table 3　Comparison of conservative sequences of GHF-2 LacLM and LacZ

3　結(jié)論

本研究采用加熱預(yù)處理的方式，首先從新鮮雞糞樣品中分離出11株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的耐熱乳酸菌，通過(guò)酶活力測(cè)定和對(duì)粗酶液的熱處理，進(jìn)一步篩選出6株產(chǎn)酶活力高而且所產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶具有一定耐熱性的乳酸菌。經(jīng)16S rRNA鑒定，6株分離菌株均為羅伊氏乳桿菌。其中菌株MF1567編碼的β-半乳糖苷酶在55℃保溫1 h仍能保持51.2%的酶活力，將來(lái)可以通過(guò)育種進(jìn)一步提高β-半乳糖苷酶活力，最終用于工業(yè)化生產(chǎn)。

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Screening of heat tolerable lactic acid bacteria and characterization of their β-galactosidases

LI Meng-fei1，SUN Qing-hui1，ZHANG Yan2，YANG Hong-jiang1，*
（1.Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Shuang Lian Ke Xin Biotechnology Co.，Ltd.，Tianjin 300403，China）

In this study，heat tolerable LAB strains producing high level β-galactosidase were isolated from chicken feces samples.With 16S rRNA gene sequence analysis，6 isolated strains were all identified as Lactobacillus reuteri.All β-galactosidases from the isolated L.reuteri strains had the same optimum pH of 6.5. After incubating for 1 h at 55℃，51.2%of β-galactosidase of strain MF1567 activity was retained.The amino acid sequence analysis showed that 22 amino acid residues of β-galactosidase LacZ were substituted.The secondary protein structure was further predicted and LacZ had a relatively higher degree of α-helix（26.5%），which might contribute to the heat stability of β-galactosidase LacZ from L.reuteri MF1567.

lactic acid bacteria；β-galactosidase；heat tolerable；amino acid sequences

TS201.2

A

1002-0306（2015）18-0209-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.033

2015－01－16

李夢(mèng)菲（1989-），女，碩士研究生，研究方向：微生物遺傳與育種，E-mail：lemonphy23@sina.com。

楊洪江（1966-），男，博士，教授，研究方向：微生物學(xué)，E-mail：hongjiangyang@tust.edu.cn。

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（13ZCZDNC00600）。