拼接式毛細(xì)管電泳柱后蛋白質(zhì)熒光衍生微膜反應(yīng)器的構(gòu)建與性能研究

張凌怡等

摘 要 通過(guò)將兩根柱端刻蝕的毛細(xì)管插入一小段聚砜中空纖維膜中，兩根毛細(xì)管在膜內(nèi)距離為零，構(gòu)建了拼接式毛細(xì)管電泳柱后蛋白質(zhì)熒光衍生微膜反應(yīng)器，研究了其衍生化性能。拼接式微膜反應(yīng)器中，衍生試劑通過(guò)兩根拼接毛細(xì)管之間的空隙進(jìn)入反應(yīng)池和目標(biāo)物反應(yīng)。研究表明，與膜長(zhǎng)0.3～1.0 mm非拼接式微膜反應(yīng)器相比，拼接式柱后衍生微膜反應(yīng)器可保證衍生化試劑和分析物充分反應(yīng)，有效改善柱效和檢測(cè)靈敏度?？疾炝朔蛛x電壓（5～10 kV）及衍生試劑濃度等因素對(duì)衍生化反應(yīng)的影響，并對(duì)熒光強(qiáng)度和蛋白質(zhì)樣品濃度之間的關(guān)系進(jìn)行了探究。當(dāng)運(yùn)行電壓為10 kV， 衍生試劑為含有1.5 mmol/L 2，3-萘二甲醛和 60.0 mmol/L β-巰基乙醇的100 mmol/L 硼酸鹽緩沖液（pH 9.5）時(shí)，在0.007～0.04 mg/mL濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度之間具有良好的線性關(guān)系，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA的檢出限可達(dá)5.6 nmol/L。與毛細(xì)管區(qū)帶電泳/紫外檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，此反應(yīng)器幾乎沒(méi)有增加系統(tǒng)的死體積，柱效也無(wú)明顯降低，具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

關(guān)鍵詞 拼接式微膜反應(yīng)器； 毛細(xì)管電泳； 柱后熒光衍生； 蛋白質(zhì)

1 引 言

毛細(xì)管電泳（CE）因其具有分離效率高、分析速度快、樣品用量少、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，在生物樣品的分離分析方面發(fā)揮著重要作用[1～4]。但CE的檢測(cè)光程一般較短， 采用紫外檢測(cè)靈敏度較低， 在一定程度上限制了其應(yīng)用。激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器 （LIFD） 以激光器為光源，更易于聚焦至微分析系統(tǒng)的流通光路中，是CE中靈敏度最高的一種檢測(cè)器[5，6]。高靈敏度的LIFD與高分辨率的CE分離技術(shù)相結(jié)合， 不僅可以提高檢測(cè)靈敏度，還可改善選擇性，在生物樣品方面具有廣闊的應(yīng)用前景[7]。

目前， 已知的蛋白質(zhì)大部分沒(méi)有自然熒光[8]，使用熒光檢測(cè)時(shí)通常需對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光衍生。文獻(xiàn)報(bào)道的蛋白質(zhì)熒光衍生化法主要有柱前衍生、柱上衍生、柱后衍生3種類(lèi)型[9，10]。柱前衍生是最常用的衍生化方式，其衍生化過(guò)程和分離過(guò)程分別獨(dú)立完成，樣品經(jīng)衍生化后被送入分離系統(tǒng)進(jìn)行分離分析，對(duì)衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性要求較高[11，12]。柱上衍生為衍生過(guò)程和分離過(guò)程同時(shí)進(jìn)行的衍生化方法，緩沖液必須同時(shí)滿足衍生化和分離的需求[13，14]。無(wú)論柱前衍生還是柱上衍生，其衍生化過(guò)程都會(huì)帶入較多的雜質(zhì)而影響檢測(cè)結(jié)果。柱后衍生法中， 樣品經(jīng)CE分離后再與衍生化試劑發(fā)生反應(yīng)，可避免雜質(zhì)及多重衍生峰對(duì)分離結(jié)果的影響，因此特別適合像蛋白質(zhì)這種復(fù)雜且具有多反應(yīng)位點(diǎn)的大分子的熒光衍生。

柱后衍生反應(yīng)器的制作是柱后衍生的難點(diǎn)之一，目前文獻(xiàn)報(bào)道的柱后衍生反應(yīng)器主要有間隙式、同軸式和鞘流式等 ＼[9]。間隙式柱后衍生反應(yīng)器因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，已被大量應(yīng)用于CE-LIFD系統(tǒng)中，然而即使擴(kuò)散系數(shù)較小的大分子樣品也會(huì)在間隙處產(chǎn)生損失，準(zhǔn)直性問(wèn)題造成的擴(kuò)散損失也不容忽視。中空纖維膜具有良好的尺寸排阻特性，可以減少蛋白質(zhì)在接口處的擴(kuò)散損失，并且可以避免普通間隙式反應(yīng)器接口處因準(zhǔn)直性差造成的樣品擴(kuò)散損失。

在本研究組的前期工作中[15，16]，利用膜的半滲透性，使用截留分子量小于蛋白質(zhì)分子量的中空纖維膜構(gòu)建了一種新型柱后衍生微膜反應(yīng)器，并應(yīng)用于蛋白質(zhì)的CE-LIFD檢測(cè)，取得了較好的效果。然而，將配有柱后衍生微膜反應(yīng)器的毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）系統(tǒng)與一般的CZE比較發(fā)現(xiàn)，前者死時(shí)間增加15%，柱效也有所下降，說(shuō)明反應(yīng)器帶來(lái)較大死體積 ＼[15]。為了完善該反應(yīng)器，本研究構(gòu)建了死體積較小的拼接式柱后熒光衍生微膜反應(yīng)器，并對(duì)其性能進(jìn)行了研究。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

熔融石英毛細(xì)管 （75 μm i.d.375 μm o.d.，邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司）；中空纖維膜 （MWCO 10000 Da， 200 μm i.d.220 μm o.d.，中科院大連化學(xué)物理研究所）；高壓直流電源（天津東文高壓電源有限公司）。2，3-萘二甲醛 （NDA，北京百靈威科技有限公司）； β-巰基乙醇 （β-ME，上海阿拉丁試劑有限公司）；牛血清白蛋白第5組分 （BSA）和胎球蛋白（Fetuin）（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；其它試劑均為分析或更高純度試劑；實(shí)驗(yàn)用水經(jīng) Sartorius Arium 611 （德國(guó)Sartorius公司） 純水儀純化。

2.2 溶液的配制

分別配制1 mg/mL的 BSA和Fetuin標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃保存，再用水逐級(jí)稀釋至所需濃度。

硼酸鹽緩溶液是由硼砂配制而成，并用1 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 9.50；磷酸鹽緩沖液是由NaHPO4配制而成，并用1 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 11.00；NDA和β-ME溶于甲醇中，作為母液備用；衍生反應(yīng)溶液：100 mmol/L硼酸鹽緩沖液中 （pH 9.5） 加入適量 1.5 mmol/L NDA和 60 mmol/L β-ME的甲醇溶液；最終的分離緩沖溶液是由磷酸鹽緩沖液加入0.4% （m/V） PEG 8000和10% （V/V） 乙腈 （ACN） 組成。上述溶液在使用前用0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾。

2.3 柱后衍生微膜反應(yīng)器的構(gòu)建[15]

將兩根柱端刻蝕的毛細(xì)管插入一小段聚砜中空纖維膜中，使兩根毛細(xì)管在膜內(nèi)相距0～1 mm，然后用環(huán)氧膠固定；再將固定有纖維膜的這一段毛細(xì)管固定在用以盛裝衍生試劑的反應(yīng)池中；最后在檢測(cè)毛細(xì)管上接近反應(yīng)池的一端除去一小段聚酰亞胺涂層作為檢測(cè)窗口。圖1為微膜反應(yīng)器的衍生原理示意圖。

2.4 實(shí)驗(yàn)條件

自行搭建的共軸型結(jié)構(gòu)激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為473和525 nm； 分離毛細(xì)管的入口端放入分離緩沖液容器中，電極接正極；檢測(cè)毛細(xì)管的出口端置于廢液容器中，電極接地。為減少外界雜散光的影響，整個(gè)系統(tǒng)置于暗箱中。

每天使用前，膜反應(yīng)器用0.1 mol/L HCl、超純水、0.1 mol/L NaOH、超純水依次沖洗5 min。每5次進(jìn)樣后用0.1 mol/L NaOH、超純水、分離緩沖液按照出峰的保留情況依次沖洗2～5 min。除特定指出外，電泳分離分析均在200 V/cm電壓下進(jìn)行，200 V/cm電進(jìn)樣10 s。

3 結(jié)果與討論

3.1 膜長(zhǎng)與熒光強(qiáng)度的關(guān)系

前期工作[15，16]中發(fā)現(xiàn)，1 mm膜長(zhǎng)反應(yīng)器死體積較大，本研究構(gòu)建了膜長(zhǎng)約為1.0 mm微膜反應(yīng)器，并考察了膜長(zhǎng)與熒光強(qiáng)度的關(guān)系，構(gòu)建了拼接式微膜反應(yīng)器（衍生試劑通過(guò)兩根拼接毛細(xì)管之間的空隙進(jìn)入反應(yīng)池和目標(biāo)物反應(yīng)），并詳細(xì)研究了其性能特征。圖2是毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。

以0.1 mg/mL BSA為樣品，研究～1.0 mm膜長(zhǎng)與熒光強(qiáng)度的關(guān)系，結(jié)果如圖3所示。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，熒光強(qiáng)度隨著膜長(zhǎng)度的增加而降低，并且峰型稍有展寬，柱效降低。表明兩根毛細(xì)管之間的間隙已足夠使得衍生試劑和待測(cè)目標(biāo)物充分反應(yīng)。因此，采用拼接的方式，結(jié)合膜的阻隔作用，可以更好地實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的柱后衍生及熒光檢測(cè)，避免過(guò)長(zhǎng)的膜導(dǎo)致的較大死體積。

3.2 運(yùn)行電壓的影響

在拼接式微膜反應(yīng)器系統(tǒng)中，運(yùn)行電壓通過(guò)影響電滲流速度而影響樣品的衍生化反應(yīng)時(shí)間，進(jìn)而影響檢測(cè)。運(yùn)行電壓過(guò)大，電滲流速度太大，導(dǎo)致膜內(nèi)外溶液交換時(shí)間短，衍生試劑進(jìn)入膜內(nèi)量少，衍生反應(yīng)不完全。同時(shí)， 運(yùn)行電壓過(guò)大，焦耳熱效應(yīng)對(duì)膜的損害也很大。圖4為運(yùn)行電壓5～10 kV 時(shí)，0.1 mg/mL BSA衍生化產(chǎn)物熒光信號(hào)及保留時(shí)間的變化趨勢(shì)。隨著運(yùn)行電壓的減小，熒光強(qiáng)度呈略微增大趨勢(shì)，但保留時(shí)間大大延長(zhǎng)，導(dǎo)致分析周期過(guò)長(zhǎng)。綜合考慮兩種因素，采用10 kV為運(yùn)行電壓。采用高于10 kV的運(yùn)行電壓可以加快分析時(shí)間，但是在所構(gòu)建的系統(tǒng)中，焦耳熱現(xiàn)象已經(jīng)十分明顯。

3.3 衍生試劑濃度的影響

NDA與β-ME反應(yīng)的產(chǎn)物與氨基反應(yīng)速度快，熒光量子產(chǎn)率高，已經(jīng)被大量用于CE柱后衍生化系統(tǒng)。在前期工作[15，16]中已經(jīng)對(duì)NDA、β-ME及蛋白質(zhì)的最佳配比加以優(yōu)化。但在拼接式柱后衍生CE-LIFD系統(tǒng)中，衍生化區(qū)段長(zhǎng)度大大減小，相同條件下進(jìn)入膜內(nèi)的衍生化試劑量也相應(yīng)地減少，因此，考察衍生試劑濃度對(duì)衍生化程度的影響十分必要。以0.1 mg/mL BSA為樣品，分別考察不同衍生化試劑濃度對(duì)衍生化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖 5 可見(jiàn)，隨著衍生化試劑濃度的增加，BSA的熒光強(qiáng)度幾乎沒(méi)有變化，說(shuō)明當(dāng)衍生試劑的組成是100 mmol/L 硼酸鹽緩沖液（pH 9.5）中含

3.4 熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度間關(guān)系

如圖6所示，當(dāng)BSA濃度在0.007～0.04 mg/mL時(shí)，蛋白質(zhì)濃度與熒光強(qiáng)度有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=106.27x-0.5206 （R=0.9996）。以實(shí)驗(yàn)中基線峰值為噪聲（0.012 mV）， 測(cè)得BSA 的檢出限為0.34 μg/mL （S/N=3），即5.6 nmol/L。此結(jié)果與文獻(xiàn)＼[17＼]報(bào)道的鞘流式柱后衍生反應(yīng)器（8.6 nmol/L）處于同一數(shù)量級(jí)。圖7為0.007 mg/mL BSA的電泳譜圖。

3.5 系統(tǒng)死體積與柱效間關(guān)系

使用與拼接式柱后衍生微膜反應(yīng)器具有相同內(nèi)徑、相同檢測(cè)長(zhǎng)度和相同總長(zhǎng)度的空管柱作對(duì)照，使兩者在相同條件下對(duì)相同濃度的BSA樣品進(jìn)行CZE分析，考察膜反應(yīng)器對(duì)系統(tǒng)死體積及柱效的影響。實(shí)驗(yàn)中膜反應(yīng)器的反應(yīng)池內(nèi)充滿分離緩沖液。

相比于常規(guī)空管柱CZE分析，拼接式柱后衍生微膜反應(yīng)器系統(tǒng)中的死時(shí)間和空管柱的死時(shí)間幾乎相同， BSA峰寬說(shuō)明柱效沒(méi)有明顯降低，相對(duì)于1 mm膜長(zhǎng)反應(yīng)器的CZE分析結(jié)果，分析系統(tǒng)的死體積大大降低，系統(tǒng)柱效得到顯著提高。

3.6 分離能力和穩(wěn)定性考察

用該微膜系統(tǒng)分離標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)BSA和Fetuin的混合物，結(jié)果如圖8所示。兩者分離度R=3.07，柱效分別為 1387和1285塔板數(shù)/m。

進(jìn)一步對(duì)該系統(tǒng)的重復(fù)性及穩(wěn)定性進(jìn)行考察。連續(xù)進(jìn)樣3次， BSA和Fetuin保留時(shí)間的RSD分別為0.6%和0.3%；峰高的RSD分別為4.6%和3.2%。在連續(xù)進(jìn)行35次后，微膜反應(yīng)器依舊穩(wěn)定，分離能力和柱效沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明其穩(wěn)定性良好。

4 結(jié) 論

構(gòu)建了拼接式毛細(xì)管電泳柱后蛋白質(zhì)熒光衍生分離檢測(cè)系統(tǒng)，考察了分離電壓及衍生化試劑濃度等因素對(duì)衍生反應(yīng)的影響，BSA濃度在0.007～0.04 mg/mL濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度和樣品濃度呈良好的線性關(guān)， BSA的檢出限可達(dá)5.6 nmol/L。此反應(yīng)器死體積較小，具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。本研究為進(jìn)一步將拼接式柱后衍生微膜反應(yīng)器應(yīng)用于復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的分離分析提供參考。

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