內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳中優(yōu)質(zhì)乳桿菌的篩選與鑒定

李周勇，陳云，史玉東，母智深

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司研發(fā)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特011500）

內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳中優(yōu)質(zhì)乳桿菌的篩選與鑒定

李周勇，陳云，史玉東，母智深*

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司研發(fā)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特011500）

從內(nèi)蒙古鄂爾多斯市烏審旗多戶牧民家庭自制的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中，共分離得到36株乳桿菌。經(jīng)發(fā)酵特性試驗(yàn)篩選，共得到2株同時(shí)具有優(yōu)良產(chǎn)酸和產(chǎn)黏特性的乳桿菌，它們分別是WSQ-18和WSQ-34。經(jīng)16s rDNA鑒定與API50輔助鑒定，確定WSQ-18為德氏乳酸桿菌乳酸亞種2、WSQ-34為植物乳桿菌1。將兩株乳桿菌與嗜熱鏈球菌進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵試驗(yàn)，并與市售酸奶對(duì)照，最終確定WSQ-18為試驗(yàn)菌株，具有作為酸奶發(fā)酵劑的可能性。

乳酸桿菌；發(fā)酵特性；種屬鑒定；復(fù)配

乳酸菌廣泛存在于自然環(huán)境中［1］，可以從生鮮乳及傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步純化、培養(yǎng)和傳代，以及和其它具有不同生理特征和發(fā)酵代謝特征的菌種混合，從而得到具有不同特征的新型發(fā)酵乳制品，然后可進(jìn)一步應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。我國(guó)牧區(qū)大部分傳統(tǒng)乳制品的制作方法都有其獨(dú)特的戶籍性和地域性［2］，因此所產(chǎn)出的發(fā)酵乳制品便也同時(shí)具備了濃重的地域性特色和獨(dú)特風(fēng)味。

內(nèi)蒙古鄂爾多斯市烏審旗地區(qū)的原住居民千百年來(lái)始終沿襲當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)而古老的制作方法發(fā)酵乳制品［3］。制作工藝簡(jiǎn)單、口感純正、組織細(xì)膩、產(chǎn)品風(fēng)味獨(dú)具特色，而且在保證其狀態(tài)和口感的條件下，還能在自然溫度下保存較長(zhǎng)時(shí)間。這表明這些傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中極有可能含有凝乳狀態(tài)穩(wěn)定、傳代性能好以及產(chǎn)品風(fēng)味獨(dú)特的優(yōu)良乳酸菌株［4］。在此基礎(chǔ)上，試驗(yàn)采集了內(nèi)蒙古鄂爾多斯市烏審旗本地牧民家庭的3份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，希望從中篩選出具有優(yōu)良產(chǎn)酸、產(chǎn)黏性能的乳桿菌，應(yīng)用于酸奶的工業(yè)化生產(chǎn)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1）試驗(yàn)菌株：36株乳桿菌（采自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市烏審旗多個(gè)牧民家庭自制的傳統(tǒng)發(fā)酵乳，超低溫冰箱-80℃保存）；現(xiàn)有菌株，嗜熱鏈球菌MN12（蒙牛乳業(yè)微生物工作室保存）。

2）培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、API50CHL培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；脫脂乳培養(yǎng)基［12%（g/mL）的脫脂乳、115℃滅菌15 min］。

3）試劑：市售原味酸奶（維多利超市）；脫脂乳粉、甘油、酞批示劑、結(jié)晶紫染液、番紅染液、氫氧化鈉等（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.2設(shè)備

G560E漩渦混合器：美國(guó)SCIENTIFIC Instruments公司；CP21GⅡ高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；Premium U410超低溫冰箱：美國(guó)NBS公司；HV-110高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司；SVE-6A1超凈臺(tái)：新加坡ES CO公司；LVDV-Ⅱ+P旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì)：美國(guó)Brookfield公司；Sartorius pH酸度計(jì)：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3方法

1.3.1乳桿菌的純化

超低溫冰箱-80℃保存的菌株采用脫脂乳培養(yǎng)基傳代活化，之后采用MRS瓊脂培養(yǎng)基劃線接種，于37℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h。挑取單菌落于MRS斜面培養(yǎng)基上純培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢［5］，直到確認(rèn)為純菌種。采用MRS半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，菌種于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2優(yōu)良產(chǎn)酸、產(chǎn)粘菌株的篩選

1）酸度的測(cè)定

樣品后熟24h后，采用國(guó)標(biāo)酸堿滴定法測(cè)定酸度［6］。

2）黏度的測(cè)定

采用LVDV-Ⅱ+P旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì)進(jìn)行一點(diǎn)式測(cè)定［7］，根據(jù)樣品的黏度范圍最終選擇63號(hào)轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速50 r/min，在測(cè)定溫度4℃條件下，測(cè)試10 s記數(shù)，重復(fù)測(cè)量3次取算術(shù)平均值。黏度單位為mPa·s。

3）發(fā)酵特性試驗(yàn)

凝乳時(shí)間：將活化好的菌株以3%的接菌量接種到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的脫脂乳中，于43℃條件下恒溫發(fā)酵，每隔0.5 h測(cè)定一次樣品的pH。待樣品pH降低到4.6或以下，記錄菌株發(fā)酵脫脂乳至凝乳的時(shí)間。

產(chǎn)酸速度：分別測(cè)定發(fā)酵初始和發(fā)酵15 h后樣品的pH和酸度，計(jì)算平均每小時(shí)樣品pH和滴定酸度的變化量即為菌株的產(chǎn)酸速度［8］。

后酸化度：脫脂乳接菌后在培養(yǎng)過(guò)程中，分別在第15小時(shí)和60小時(shí)取出，測(cè)定樣品的pH和滴定酸度。在第15小時(shí)至60小時(shí)的培養(yǎng)過(guò)程中，每小時(shí)pH和酸度的平均變化量，即表示為后酸化度［9］。

黏度測(cè)定：根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，保留初始凝乳時(shí)間≤6 h的菌株，并選取其中產(chǎn)酸速度快、后酸化程度弱的菌株。待樣品凝乳后取出，破乳并于4℃冰箱內(nèi)后熟24 h，取出測(cè)定黏度。

1.3.3菌株種屬鑒定

1）菌株16 s rDNA鑒定［10］

PCR擴(kuò)增：PCR體系50μL，反應(yīng)條件：95℃/5 min， 95℃/40 s，50℃/40 s，72℃/1 min，進(jìn)行31個(gè)循環(huán)；72℃/ 5 min，收集PCR產(chǎn)物，由天津生物芯片有限公司測(cè)序。

2）菌株API50輔助鑒定［11］

采用16s rDNA進(jìn)行種屬鑒定，其結(jié)果有時(shí)可能會(huì)與兩個(gè)或多個(gè)種屬同源性達(dá)到95%以上的相同數(shù)值，因而無(wú)法將菌株鑒定至種。API50CHL適用于乳酸桿菌（Lactpbacillus）和相關(guān)菌的鑒定，它是由49種可發(fā)酵碳水化合物的API 50 CH試驗(yàn)條組成的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基。結(jié)合16s rDNA鑒定結(jié)果，采用API50CHL鑒定的方法，可將乳桿菌進(jìn)一步鑒定至種水平。

1.3.4混合發(fā)酵試驗(yàn)［12］

將發(fā)酵特性試驗(yàn)篩選出的優(yōu)良產(chǎn)酸、產(chǎn)黏乳桿菌與實(shí)驗(yàn)室保留的嗜熱鏈球菌按1∶1的接菌比例，2%的總接菌量進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵酸奶，以市售原味酸奶為對(duì)照。在后熟24 h后測(cè)定樣品各項(xiàng)指標(biāo)的變化，分析評(píng)價(jià)篩選所得菌株作為酸奶發(fā)酵劑的可行性。

1）酸奶的制作流程［13］

牛奶（雜菌＜500 000 CFU/mL，酸度＜18°T）→配入7%的白砂糖，攪拌乳化1 h→均質(zhì)（壓力為20 MPa）→加熱殺菌（95℃、5 min）→冷卻至43℃→加入發(fā)酵劑（接種量3%）→42℃下恒溫發(fā)酵→攪拌冷卻→4℃后熟24 h

2）乳清析出率［14］

將100 g酸奶從4℃貯藏條件下取出，立即倒入大漏斗（帶有120目不銹鋼絲網(wǎng)），從下方收集析出的乳清，2 h后稱量乳清重量。

3）黏稠度

采用LVDV-Ⅱ+P型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)進(jìn)行一點(diǎn)測(cè)定，通過(guò)試驗(yàn)最終選擇28號(hào)轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速為50 r/min，在常溫下，測(cè)試30 s記數(shù)，重復(fù)測(cè)量3組取平均值。黏度單位為mPa·s。

4）感官評(píng)定

由10名蒙牛乳業(yè)乳品研發(fā)團(tuán)隊(duì)的專業(yè)人員組成品評(píng)小組，對(duì)樣品的總體色澤、滋氣味、組織狀態(tài)等進(jìn)行評(píng)分。總分＞90分的，定為優(yōu)質(zhì)酸奶；總分在80分～90分之間的，定為良質(zhì)酸奶；總分＜80分的，定為次質(zhì)酸奶。感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

2結(jié)果與分析

2.1乳桿菌的分離純化結(jié)果

從內(nèi)蒙古鄂爾多斯市烏審旗多戶牧民家庭自制的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中，通過(guò)前期采用革蘭氏染色與過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)相結(jié)合的方法［16］，初步篩選出62株乳酸菌，經(jīng)進(jìn)一步鏡檢純化試驗(yàn)，確認(rèn)共得到乳桿菌36株，并依次命名為“WSQ-”系列。

表1　感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)［15］Table 1Standard of organoleptic investigatio

2.2優(yōu)良產(chǎn)酸、產(chǎn)黏菌株的篩選結(jié)果

2.2.1菌株產(chǎn)酸試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1菌株凝乳時(shí)間測(cè)定結(jié)果

菌株凝乳時(shí)間測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　菌株凝乳時(shí)間Table 2The time of strain curding

由表2可以看出，活化好的菌株在43℃條件下恒溫發(fā)酵，6 h內(nèi)能發(fā)酵脫脂乳至凝乳的菌株共有9株，它們分別是：WSQ-05、WSQ-09、WSQ-13、WSQ-18、WSQ-19、WSQ-24、WSQ-28、WSQ-30、WSQ-34，其中WSQ-09的凝乳時(shí)間最短，為3.5 h。因此，保留這9個(gè)菌株繼續(xù)進(jìn)行其它產(chǎn)酸試驗(yàn)。

2.2.1.2菌株產(chǎn)酸速度及后酸化程度測(cè)定結(jié)果

菌株產(chǎn)酸速度及后酸化程度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可以看出，WSQ-09、WSQ-18、WSQ-30、WSQ-34四株菌的產(chǎn)酸速度相對(duì)較快，與其它菌株差異顯著。其中，WSQ-09菌株的后酸化程度嚴(yán)重，表明在15 h～60 h的培養(yǎng)過(guò)程中，產(chǎn)品的pH和酸度的變化過(guò)快。因此，選擇后酸化弱的3株菌WSQ-18、WSQ-30、WSQ-34繼續(xù)進(jìn)行產(chǎn)黏試驗(yàn)。

表3　菌株產(chǎn)酸速度及后酸化程度測(cè)定結(jié)果Table 3Measurement results of speed of strains produce acid and degree of after acidification

2.2.2菌株產(chǎn)黏試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)4℃冰箱內(nèi)后熟24 h，樣品黏度如表4所示。

表4　菌株產(chǎn)黏試驗(yàn)結(jié)果Table 4Test results of strains produce viscosity

由表4可以看出，經(jīng)4℃條件下后熟24 h后，WSQ-18和WSQ-34發(fā)酵樣品的黏度值較大，分別為1 214.5 mPa·s和1 243.4 mPa·s，與WSQ-30樣品的黏度值差異顯著。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，初步篩選出兩株具有優(yōu)良產(chǎn)酸和產(chǎn)黏特性的乳桿菌，它們分別是WSQ-18和WSQ-34。試驗(yàn)最終選擇WSQ-18及WSQ-34作為試驗(yàn)菌株，進(jìn)行下一步種屬鑒定及混合發(fā)酵試驗(yàn)。

2.3菌株種屬鑒定試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1菌株16s rDNA鑒定結(jié)果

經(jīng)16s rDNA鑒定，結(jié)果表明，菌株WSQ-18與德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）的16s rDNA基因序列有著高達(dá)99.9%的同源性，可初步確定WSQ-18為德氏乳桿菌。WSQ-34與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）的16s rDNA基因序列有著相同的100%的同源性，暫時(shí)無(wú)法確定其種屬。

2.3.2菌株API50輔助鑒定結(jié)果

菌株WSQ-18和WSQ-34經(jīng)API 50 CH試驗(yàn)條的49種可發(fā)酵碳水化合物反應(yīng)所得的生化圖譜如下圖1所示。

圖1　菌株WSQ-18及WSQ-34的API50鑒定圖譜Fig.1API50 identification map of WSQ-18 and WSQ-34

根據(jù)WSQ-18、WSQ-34的API50生化圖譜圖，與API50生化圖譜標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照表比對(duì)［17］，最終確定WSQ-18為德氏乳酸桿菌乳酸亞種2（Lactobacillus delbrueckii ssp lactis 2），WSQ-34為植物乳桿菌1（Lactobacillus plantarum 1）。

2.3.3菌株混合發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

菌株混合發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　混合發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 5Test results of mixed fermentation

由表5可以看出，經(jīng)后熟24 h后，兩個(gè)試驗(yàn)組樣品的乳清析出率略高于對(duì)照組，但無(wú)顯著差異。WSQ-18+MN12組樣品的黏度與對(duì)市售酸奶無(wú)明顯差異，WSQ-34+MN12組樣品的黏度低于市售酸奶且差異顯著。經(jīng)專業(yè)人員感官品評(píng)，WSQ-18+MN12組與對(duì)照組品質(zhì)接近，均為優(yōu)質(zhì)酸奶，WSQ-34+MN12組與對(duì)照組相比，品質(zhì)有所下降，為良質(zhì)酸奶。因此，根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，考慮到今后可能用于生產(chǎn)實(shí)際，試驗(yàn)最終選擇WSQ-18（德氏乳酸桿菌乳酸亞種2）為試驗(yàn)確定菌株。

3結(jié)論

試驗(yàn)從內(nèi)蒙古鄂爾多斯市烏審旗地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中共分離得到36株乳桿菌。經(jīng)發(fā)酵特性試驗(yàn)篩選，共得到2株具有優(yōu)良產(chǎn)酸和產(chǎn)黏特性的乳桿菌，它們分別是WSQ-18和WSQ-34。經(jīng)16s rDNA與API50鑒定，確定WSQ-18為德氏乳酸桿菌乳酸亞種2（Lactobacillus delbrueckii ssp lactis 2）、WSQ-34為植物乳桿菌1（Lactobacillus plantarum 1）。經(jīng)菌株混合發(fā)酵試驗(yàn)，最終選擇WSQ-18（德氏乳酸桿菌乳酸亞種2）作為目標(biāo)菌株。

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Screening and Identification for Lactobacillus from Traditional Fermented Dairy in Inner Mongolia

LI Zhou-yong，CHEN Yun，SHI Yu-dong，MU Zhi-shen*
（InnerMongoliaMengNiuDairyIndustry（Group）Co.，Ltd.，R&DCenter，Hohhot011500，InnerMongolia，China）

Test isolated 36 Lactobacillus strains in total from traditional fermented dairy which made by several herding families in Wushen league of Inner Mongolia.By screening of fermentation characteristic test，2 Lactobacillus with excellent acid and viscosity-producing characteristics were got，they were WSQ-18 and WSQ-34.By 16 s rDNA appraisal and API50 auxiliary appraisal，determine the WSQ-18 for Lactobacillus delbrueckii ssp lactis 2，WSQ-34 for Lactobacillus plantarum 1.The mixed fermentation experiment was carried out with two strains of Lactobacillus and streptococcus thermophilus，and compared with commercially available yogurt，determine the WSQ-18 for target strains eventually，as the possibility of yoghurt starter cultures.

Lactobacillus；fermentation characteristics；species identification；compound

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.037

2014-04-15

李周勇（1987—），男（漢），助理工程師，碩士研究生，研究方向：乳制品研究與開(kāi)發(fā)。

母智深，副教授，主要從事乳品營(yíng)養(yǎng)與工程方面的研究。