一種復(fù)合萃取物對黃嘌呤氧化酶抑制作用研究

趙玲，陳旅翼，李赫宇

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023；2.中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢430074；3.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457）

一種復(fù)合萃取物對黃嘌呤氧化酶抑制作用研究

趙玲1，陳旅翼2，李赫宇3

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023；2.中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢430074；3.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457）

一種復(fù)合萃取物主要由葡萄皮、葡萄籽、紅酒萃取物及人參、枸杞萃取物組成，針對該復(fù)合物抑制黃嘌呤氧化酶的體外活性開展了研究，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物為黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）競爭性抑制劑，其Ki值為53.0 μg，IC50為56.86 μg/mL。

復(fù)合萃取物；黃嘌呤氧化酶；抑制作用

高尿酸血癥和痛風(fēng)的生化基礎(chǔ)是體液中尿酸濃度過高，降低過高的尿酸是其主要治療策略［1］。黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）是尿酸生成的關(guān)鍵酶，其催化次黃嘌呤和黃嘌呤生成尿酸，同時產(chǎn)生大量的超氧陰離子和過氧化氫等活性氧，因此，XO為良好的高尿酸血癥和痛風(fēng)治療靶點(diǎn)。XO抑制劑通過抑制體內(nèi)XO的活性而減少尿酸生成，如別嘌醇，已于20世紀(jì)60年代用于臨床，對高尿酸血癥和痛風(fēng)產(chǎn)生良好的防治效果［2-3］。近年又發(fā)現(xiàn)，XO抑制劑對缺血再灌注損傷、內(nèi)皮損傷、心功能衰竭具有明顯的保護(hù)作用，有可能成為心血管系統(tǒng)疾病的治療藥物［4］。雖然針對該靶點(diǎn)的抑制劑有其現(xiàn)實(shí)和潛在的價值，但該類藥物品種極其少，且均有不同程度的毒副作用，限制了其應(yīng)用，因此尋找對XO有抑制作用的天然復(fù)合萃取物對人類健康有著非常重要的意義。

本文中復(fù)合萃取物主要由葡萄皮、葡萄籽、紅酒萃取物及人參、枸杞萃取物組成，本文針對該復(fù)合物抑制XO的體外活性開展了研究。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

復(fù)合萃取物樣品：由天津市益倍建生物技術(shù)有限公司提供；黃嘌呤：Sigma，USA；尿酸：Sigma，USA；黃嘌呤氧化酶：Sigma5U，USA；別嘌醇片（批號：20140908）：江蘇方強(qiáng)制藥廠有限責(zé)任公司；磷酸氫二鉀、乙二胺四乙酸、氫氧化鈉、二甲基亞砜等均為分析級。

1.2儀器

BS124S型電子天平：Sartorius Corporation，Germany；Mini-shaker培養(yǎng)板振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；WH-2型漩渦混合儀：上海滬西分析儀器廠；DZF-6020型真空干燥箱：上海一恒科技術(shù)有限公司；DG5033A型酶標(biāo)儀：華東電子；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板：CorstarRCorporation，USA；20、200、1000 μL移液器：Thermo Electron Corporation，USA。

1.3方法

1.3.1溶液的配制

稱取復(fù)合萃取物樣品適量，150 μL DMSO溶解，再用緩沖鹽溶液稀釋至濃度為228、114、57、28.5 μg/mL，終濃度為0.034、0.068、0.136、0.272 μg/mL的別嘌醇作為陽性對照。

磷酸緩沖液的配制（pH=7.5，50 mmol/L，按《中華人民共和國藥典》2010年版附錄配制）：即精密稱取在（115±5）℃干燥2 h～3 h的無水磷酸氫二鈉3.55 g與磷酸二氫鉀3.40 g，加水使溶解并稀釋至1 000 mL，用0.1 mol/L的NaOH調(diào)pH至7.5。

黃嘌呤溶液的配制：稱取2.28 mg溶解于100 mL緩沖液中。EDTA配制：稱取0.372g溶解于100mL緩沖液中。XO配制：5U溶解于25mL緩沖液中，得0.2U/mL。

1.3.2體外抑制XO活性測定

酶活力測定：在適宜條件下，黃嘌呤被黃嘌呤氧化酶催化生成尿酸，產(chǎn)物尿酸290 nm處有特征吸收峰，因此以290 nm處OD值來說明藥物對酶活力的影響。在酶標(biāo)板中，加入緩沖溶液、底物溶液、酶溶液，反應(yīng)20 min后，測定290 nm處OD值。

樣品測定：按1.3.2的測定方法，在酶促反應(yīng)體系中加入適量樣品溶液，反應(yīng)20 min后，測定OD值。每個樣品平行操作3次，取其平均值計(jì)算IC50值。

阮小棉在最后一只紙飛機(jī)上寫，阮小棉，堅(jiān)持到底。這一只飛得異常的遠(yuǎn)，穿過整條街，落到樓群的那一面去。孩子們追了一會，失望地散開去。阮小棉很開心，轉(zhuǎn)身跑下樓去上網(wǎng)，重重地敲下幾個字：羅漠，我不會放棄。郵件發(fā)送成功，她坐在電腦前傻乎乎地笑。

空白對照：同上述操作，加與樣品同體積的DMSO，不加樣品和XO。

XO對照測定：方法與樣品測定相同，不加樣品。

陽性對照品：為核對試驗(yàn)方法與結(jié)果的可信性，取已配制好的不同濃度的別嘌醇溶液，重復(fù)上述試驗(yàn)，計(jì)算IC50值。

測定順序如下：

用移液槍按如下順序吸取試劑于96孔板內(nèi)：①0.285 mL緩沖液（50 mmol/L磷酸氫二鉀緩沖液pH= 7.5），②0.25 mL樣品溶液，③0.1 mL EDTA（1 mmol/L緩沖溶液配制），④0.330 mL黃嘌呤溶液，⑤0.035 mL XO溶液，⑥37℃反應(yīng)20 min后，290 nm測定吸收值。

1.3.3尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

表1　尿酸系列溶液配制Table 1Uric acid series solution preparation

續(xù)表1尿酸系列溶液配制Continue table 1Uric acid series solution preparation

表2　尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2Uric acid standard curve

每一濃度取0.2 mL于96孔板中，混勻后，290 nm處測吸光度，以測得的吸光度為縱坐標(biāo)，尿酸濃度為橫坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.037 6x+0.003 2（R2= 0.999）。

圖1　尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Uric acid standard curve

2結(jié)果與分析

2.1體外XO活性測定

以抑制率為因變量，以樣品濃度為自變量，采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包計(jì)算回歸方程，根據(jù)回歸方程計(jì)算抑制率為50%的樣品濃度IC50。試驗(yàn)結(jié)果見表3。

2.2酶抑制動力學(xué)分析（Lineweaver-Burk plots）

酶抑制動力學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)苓M(jìn)一步確定化合物抑制酶的特性，其測定方法為，同一樣品濃度對不同底物（黃嘌呤）濃度（0、0.304、0.456、0.608、1.064、1.216、1.976、3.040 μg/mL），同一底物濃度（黃嘌呤）對不同樣品濃度（228、114、57、28.5 μg/mL），在反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，測得一系列OD值。用Diox繪圖法計(jì)算Ki值，判斷抑制劑類型。在不同濃度的底物下，以反應(yīng)速率的倒數(shù)為因變量，樣品濃度為自變量，得到一條直線。采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包計(jì)算回歸方程。求出四直線的交點(diǎn)，可得到抑制動力學(xué)參數(shù)Ki。再由直線的斜率對相應(yīng)的底物濃度的倒數(shù)二次作圖，即可判斷抑制劑類型。試驗(yàn)結(jié)果表明該復(fù)合萃取物為XO競爭性抑制劑，其Ki值為53.0 μg，見表3。

表3　復(fù)合萃取物抑制XO的IC50與Ki（n=3）Table 3The IC50and Ki of the XO inhibition of the extractive complex

3結(jié)論

通過本論文研究發(fā)現(xiàn)該復(fù)合萃取物具有較好的抑制XO活性，其IC50為56.86 μg/mL。雖然該復(fù)合萃取物沒有別嘌醇效果明顯，但在人們生活質(zhì)量日益提高及對健康迫切需求的時代，天然健康的食品及復(fù)合萃取物已越來越受到人們的喜愛，服用天然植物萃取物作為調(diào)節(jié)身體健康的補(bǔ)充劑已成為時尚。因此，將該復(fù)合萃取物開發(fā)為天然防治痛風(fēng)的保健食品具有極大的前景，其在體內(nèi)對XO的抑制作用，將在后續(xù)的試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］朱深銀，周遠(yuǎn)大，劉慶山，等.黃嘌呤氧化酶抑制劑高通量篩選模型的建立及應(yīng)用［J］.中國藥學(xué)雜志，2007，42（3）:187-190

［2］祁鑫，王昌祿，李風(fēng)娟，等.常見蔬菜提取物對黃嘌呤氧化酶抑制作用的篩選研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2011，27（5）:511-514

［3］吳新榮，臧路平，劉志剛.抗高尿酸血癥藥物作用靶點(diǎn)研究進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26（11）:1414-1417

［4］BAKER J F，KRISHNAN E，CHEN L，et al.Serum uric acid and cardiovascular disease:recent developments，and where do they leave us［J］.Am J Med，2005，118（8）:816-826

Study on Inhibition of Xanthine Oxidase of An Extractive Complex

ZHAO Ling1，CHEN Lü-yi2，LI He-yu3
（1.College of Pharmaceutical engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China；2.College of Pharmacy，South-central University For Nationalities，Wuhan，430074，Hubei，China；3.Tianjin Ubasic health Nutrition Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China）

An extractive complex contains the extraction of grape skin，grape seed，red wine，ginseng and wolfberry.The complex inhibition in vitro activity of xanthine oxidase conducted research and found that the complex is a xanthine oxidase（xanthine oxidase，XO）competitive inhibitor with Ki values of 53.0 μg and IC5056.86 μg/mL.

extractive complex；xanthine oxidase；inhibit effect

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.049

2015-07-17

趙玲（1982—），女（漢），副教授，博士研究生，研究方向：天然活性成分研究。