多重因素對雨生紅球藻蝦青素積累的影響

馬欣欣，石蕾，楊巧利，耿金峰，馮倩，滕杰，趙鄢鵬，王雁，劉敏勝

（新奧科技發(fā)展有限公司煤基低碳能源國家重點實驗室，河北廊坊065001）

多重因素對雨生紅球藻蝦青素積累的影響

馬欣欣，石蕾，楊巧利，耿金峰，馮倩，滕杰，趙鄢鵬，王雁，劉敏勝*

（新奧科技發(fā)展有限公司煤基低碳能源國家重點實驗室，河北廊坊065001）

蝦青素獨特的分子結構使其成為自然界最強的抗氧化劑，工業(yè)上成功利用雨生紅球藻生產(chǎn)天然蝦青素的生產(chǎn)模式均采取先藻細胞增殖、再蝦青素積累的兩步法，近年來用于積累蝦青素的脅迫誘導方法仍然集中在高光照強度、高溫、缺氮等傳統(tǒng)典型脅迫條件，但開始傾向于這些方法的復合作用，同時也進行了異養(yǎng)培養(yǎng)、添加外源試劑、補充其他營養(yǎng)元素等多種嘗試。

雨生紅球藻；蝦青素；積累；脅迫

蝦青素（Astaxanthin）被認為是自然界最強的抗氧化劑，其化學名稱為3，3'-二羥基-β，β'-胡蘿卜素-4，4'-二酮，屬于酮式類胡蘿卜素，獨特的分子結構不僅賦予它非常高的抗氧化活性，還具有抗輻射、抗衰老、抗腫瘤及防治心血管疾病等功能。蝦青素的應用十分廣泛，包括水產(chǎn)養(yǎng)殖的餌料添加劑、人的食品添加劑，同時在藥品、化妝品和高級營養(yǎng)保健品等領域也有非常廣闊的市場。

蝦青素在分子中兩端環(huán)結構的C-3和C-3'有兩個手性中心，每個手性中心可以有R或S形式的兩種構象，這樣可以形成3種立體異構體：2個羥基位于平面下方構成S構象（3S，3'S-蝦青素）；2個羥基位于平面上方構成R構象（3R，3'R-蝦青素）；1個羥基位于平面上方，1個位于平面下方的構成S，R構象（3S，3'R-蝦青素和3R，3'S-蝦青素），也稱為左旋、右旋、消旋構型［1］。除此以外，蝦青素還可根據(jù)幾何異構、酯化與否和酯化程度等分為多種分子類型［2］，所有這些結構形式在自然界都存在，見表1。

表1　不同來源蝦青素的結構Table 1The structure of astaxanthin from different sources

無論出于安全性考慮，還是由于順式結構在動物體內無法轉化，化學合成蝦青素都越來越受到嚴格的限制；而甲殼綱生物、鮭魚類和酵母來源的蝦青素，則含量太低、養(yǎng)殖成本過高；只有雨生紅球藻中的蝦青素積累速率和生物總量最高，其100%的左旋（3S，3'S）結構，具有最強的生物學活性，另外雨生紅球藻所含蝦青素的脂類配比與動物體內的蝦青素配比極為相似，最容易被吸收。因此，利用雨生紅球藻高產(chǎn)蝦青素是目前的研究熱點。

目前工業(yè)上成功利用雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的生產(chǎn)模式，一般均采取兩步法培養(yǎng)［3］，首先是細胞增長階段，需要在適宜條件下養(yǎng)殖雨生紅球藻獲得高濃度的綠色細胞，此階段藻細胞一般培養(yǎng)在室內潔凈的密閉光生物反應器中；其次是脅迫誘導階段，需要轉為多種脅迫條件，促使綠色細胞變?yōu)榧t色的不動孢子，實現(xiàn)蝦青素的積累，此階段往往將藻細胞轉移至室外的開放反應器或跑道池中培養(yǎng)。用于脅迫條件積累蝦青素的方法包括使用高光強、高鹽度、氮饑餓和添加外源植物激素等，本文將著重對近年來研究增強雨生紅球藻積累蝦青素方法的最新進展進行綜述。

1環(huán)境因素

1.1光照強度

光保護學說是雨生紅球藻蝦青素積累機制的最有影響的理論假設，由于蝦青素的主要存在形式蝦青素酯無論在疏水環(huán)境還是親水環(huán)境下，都具有很強的抗氧化活性，所以Kobayashi M等推測蝦青素能夠清除光合過程中產(chǎn)生的大量活性氧，從而保護光合器官和光合色素免受氧自由基的破壞［4］。另一光保護理論認為，隨著蝦青素的積累，雨生紅球藻細胞中聚集的色素顆粒逐漸增多，并且相互融合使體積增大，色素沉積的部位也從最初的核周圍向四周擴展，直到占據(jù)細胞的大部分區(qū)域。蝦青素的這種擴散作用能夠增強對杯狀載色體的遮光、防止光抑制發(fā)生，使紅球藻細胞具有更強的耐高光強能力［5］。因此，高光照脅迫處理成為刺激雨生紅球藻積累蝦青素的主要研究方法。EsraImamoglu等在光照強度為546mmol/（m2·s）獲得了30.07mg/g的蝦青素濃度［6］；陳書秀等實驗發(fā)現(xiàn)當光照強度為300 μmol/（m2·s）時單個細胞中的蝦青素含量最高，但光照強度為50μmol/（m2·s）時單位體積內的蝦青素含量最高［7］；Chang Duk Kang等使用400 μmol/（m2·s）的光照強度，蝦青素產(chǎn)量可達到190 mg/L，產(chǎn)率為14 mg/（L·d）［8］；才金玲等研究認為240 μmol/（m2·s）的光強下，單個細胞內的蝦青素產(chǎn)量最大［9］；顧洪玲等利用兩種顏色的人工光源LED照射，在總光強為7000lx，藍光與白光的強度比例為3∶1時，雨生紅球藻中蝦青素的積累量能達到39.79 mg/L［10］。

1.2溫度

早期研究認為，雨生紅球藻的適宜生長溫度為25℃～28℃，提高溫度將有利于藻細胞中蝦青素的積累［11］，研究人員推測，高溫會促進活性氧的產(chǎn)生，而活性氧有利于蝦青素的積累［12］；另一種可能的原因是較高的培養(yǎng)溫度抑制了雨生紅球藻的正常分裂生長，從而提高了蝦青素的相對含量提高。苗鳳萍等研究溫度對雨生紅球藻產(chǎn)蝦青素的影響時發(fā)現(xiàn)，25℃時蝦青素產(chǎn)量最高，能達到13.53 mg/L，而22℃時蝦青素含量最高，為1.52%［13］。梁英等實驗表明20℃時單位體積的雨生紅球藻中蝦青素含量最高，而5℃和30℃時單個細胞中的蝦青素含量最高［14］。Minxi Wan等在白天與晚上分別設置不同的養(yǎng)殖溫度，指出白天28℃、晚間低于28℃的培養(yǎng)條件有利于促進雨生紅球藻的生物質積累和蝦青素含量提高［15］。

1.3其他環(huán)境因素

盡管高光照、高溫是蝦青素積累的重要脅迫條件，但研究人員往往采取多種條件復合影響的辦法。蔣霞敏等從溫度、光照與鹽度3個因素進行正交試驗，發(fā)現(xiàn)蝦青素累積量最高時的溫度為25℃～30℃，光照為8 000 lx，鹽度為4%～8%，而后進一步進行鹽度、光照的兩因素脅迫正交試驗，在光照為8 000 lx、鹽度為8%時獲得最高的蝦青素含量［16］。張睿欽等研究的則是溫度、光照和pH，得到溫度為29.92℃、光照為7 203.95lx、pH為10的優(yōu)化條件，轉化10.6 d后，蝦青素含量可達到（33.796±1.556）mg/L［17］。

2營養(yǎng)鹽因素

2.1氮

利用對培養(yǎng)基的缺氮處理、脅迫誘導蝦青素積累是最常用的方法之一，但是氮缺乏誘導蝦青素累積的具體機理尚不明確，F(xiàn)eng DN等研究發(fā)現(xiàn)，在缺氮的情況下乙酰輔酶A羧化酶的活性及表達均高于氮充足條件下的水平，因此推測缺氮會使碳的流向從糖、蛋白質的合成轉向脂質合成，從而積累蝦青素［18］。陳興才等認為缺氮培養(yǎng)基對于雨生紅球藻細胞累積蝦青素最為有利，蝦青素含量達到6.72 μg/mL［19］。楊瑾等研究發(fā)現(xiàn)當完全無氮時，脅迫程度最高，蝦青素積累最快，含量最高可達10 μg/mg以上［20］。Ngoc-Phuong Tran等實驗證明缺氮處理后3 d，蝦青素含量可從91 mg/L增至406 mg/L［21］。而Junfeng Wang等研究了室外條件下，缺氮和藻細胞初始濃度雙因素的協(xié)同影響，他們發(fā)現(xiàn)當初始濃度為0.8 g/L、完全缺氮時，最大蝦青素干重含量可達3.8%［22］。

2.2碳

充足的碳源對蝦青素的積累也同樣非常重要，由于二氧化碳是藻類自養(yǎng)培養(yǎng)時能夠保證供給的常規(guī)碳源，因此研究人員大都傾向于添加異養(yǎng)培養(yǎng)的有機碳源，包括醋酸鹽和葡萄糖等。董慶霖等對乙酸鈉誘導蝦青素積累的代謝機理進行了比較深入的研究［23］，認為乙酸鈉的代謝比二氧化碳固定相對簡單，不需要啟動復雜的光合作用系統(tǒng)，可通過乙醛酸循環(huán)直接進入糖異生途徑，而且乙酸鈉能夠降低Rubisco酶活性，抑制葉綠素和葉綠素結合蛋白的合成，提高硝酸還原酶活性，造成氮饑餓和碳饑餓，促使蝦青素的積累。實驗結果表明，當乙酸鈉濃度為2.0 g/L時，蝦青素含量能夠達到1.36 mg/g。高政權等研究了Fe2+、醋酸鹽和雙氧水這三種因子的復合影響，認為Fe2+和醋酸鹽的組合可以使蝦青素積累更快［24］。Yingxue Su等發(fā)現(xiàn)在高光照下，醋酸鹽和Fe2+脅迫均可提高蝦青素濃度，其中使用450 μmol/L的Fe2+培養(yǎng)2 d后蝦青素的含量最高，達到了3.44 μg/mL［25］。游泳等則嘗試了發(fā)酵行業(yè)常用的葡萄糖，發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)條件下葡萄糖添加量為3.161 6 g/L時，蝦青素產(chǎn)量為41.06 mg/L，是自養(yǎng)培養(yǎng)時的2.02倍［26］。

2.3其他營養(yǎng)物質

在早期研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)添加VB1、VB12、VH均能顯著促進雨生紅球藻細胞的生長［27］。凌善鋒等進一步研究表明，雨生紅球藻生物量隨著VB6濃度的增加而提高，當維生素濃度為120 μg/L時，藻細胞生物量最大，比對照高3.46%［28］。王麗麗等向培養(yǎng)基中添加花生四烯酸，結果表明當花生四烯酸質量濃度為312.5 mg/L時，蝦青素的含量最高，達3.67 mg/L［29］。

3外源試劑因素

除了參與構成藻細胞本身的各種營養(yǎng)元素，人們還廣泛嘗試了許多外源試劑，包括植物激素、抗生素等。李哲等發(fā)現(xiàn)低質量濃度的稀土元素Ce3+對微藻生長和蝦青素積累均具有明顯的促進作用，當Ce3+的質量濃度為1 mg/L時，蝦青素質量分數(shù)可達到細胞干質量的3.2%［30］。張躍群等采用氮饑餓與亞甲基藍2種誘導因子取得了類似氮饑餓與高光脅迫類似的結果，他們認為高光脅迫與亞甲基藍可能具有類似的作用機理［31］。Yandu Lu使用濃度為20 mg/L的茉莉酸甲酯、赤霉素分別處理雨生紅球藻取得了比較顯著的效果，蝦青素濃度可達到4.5 mg/g和6.5 mg/g以上［32］。Ngoc-Phuong Tran等則選取了一種非特異性蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑，通過添加濃度為2.5 mmol/L的正釩酸鈉，蝦青素含量可高達10.7 mg/g［33］。高政權、孟春曉等在外源試劑方面做了大量研究，他們先后使用了水楊酸、乙烯、萘乙酸、赤霉素、植物生長調節(jié)劑920等，取得了一系列正向研究結果［34-39］。但由于成本和利用效率的問題，外源試劑的處理方式還未能實際應用于大規(guī)模生產(chǎn)天然蝦青素。

4展望

雨生紅球藻是自然界中蝦青素含量最為豐富的生物，其蝦青素具有100%的左旋（3S，3'S）結構，能呈現(xiàn)出最強的生物學活性，所以利用雨生紅球藻生產(chǎn)天然蝦青素受到世界各國食品、保健品、藥品工業(yè)等的廣泛關注。先藻細胞增殖、再蝦青素積累的兩步法仍然是目前最成熟的工藝，促使蝦青素積累的誘導也仍然主要集中在高光照強度、高溫、缺氮等傳統(tǒng)典型脅迫條件，但近年開始越來越傾向于這些方法的復合作用，同時也進行了異養(yǎng)培養(yǎng)、添加外源試劑、補充其他營養(yǎng)元素等多種嘗試，均取得了比較明顯的正向結果，對今后天然蝦青素生產(chǎn)的工業(yè)化發(fā)展將起到良好的促進作用。

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Influences of Multiple Factors on Accumulation of Astaxanthin in Haematococcus pluvialis

MA Xin-xin，SHI Lei，YANG Qiao-li，GENG Jin-feng，F(xiàn)ENG Qian，TENG Jie，ZHAO Yan-peng，WANG Yan，LIU Min-sheng*
（State Key Laboratory of Coal-based Low Carbon Energy，ENN Science&Development Co.，Ltd.，Langfang 065001，Hebei，China）

Astaxanthin is one of the most effective natural antioxidants due to its unique molecular structure and biological activity.At present，natural astaxanthin was produced by Haematococcus pluvialis as a two-step process involving microalgae proliferation and accumulation.The stress-induced method for accumulating astaxanthin was concentrated under high intensity lighting，elevated temperatures，nitrogen deficiency and other environmental stress conditions.These techniques were further refined and compounded to enhance its effectiveness over the last few years.Additional developments such as heterotrophic culture，the introduction of foreign sourced reagents and nutrients had also come into standardized practice.

Haematococcus pluvialis；astaxanthin；accumulation；stress

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.048

2015-05-25

馬欣欣（1978—），男（漢），助理研究員，碩士，從事微藻養(yǎng)殖與光反應器制造等方面研究。

劉敏勝（1978—），男（漢），副研究員，博士。