參附注射液對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2表達(dá)的影響*

胡丹丹　樓黎明　徐慧連

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江杭州310005）

·研究報(bào)告·

參附注射液對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2表達(dá)的影響*

胡丹丹樓黎明徐慧連△

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江杭州310005）

目的觀察參附注射對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響，探討參附注射液抗膿毒癥心肌損傷的相關(guān)機(jī)制。方法將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、模型組和參附組，以盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法建立膿毒癥大鼠動(dòng)物模型，觀察各組大鼠心肌酶譜變化；凋亡原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，以RT-PCR法檢測(cè)心肌細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)。結(jié)果參附組大鼠心肌酶譜升高程度較模型組低（P＜0.05），模型組較假手術(shù)組心肌酶水平高（P＜0.05）；參附組大鼠心肌細(xì)胞TUNEL評(píng)分平均光密度（MOD）較模型組明顯降低（P＜0.05），模型組較假手術(shù)組升高（P＜0.05）；模型組心肌細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低（P＜0.05），參附組較模型組升高（P＜0.05）。結(jié)論參附注射液能減輕膿毒癥大鼠的心肌損傷，其作用機(jī)制與上調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)、減少心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)。

參附注射液膿毒癥細(xì)胞凋亡Bcl-2

膿毒癥是感染性疾病和創(chuàng)傷性疾病應(yīng)激過程中常見的并發(fā)癥，具有發(fā)病率、死亡率高的臨床特點(diǎn)，其高死亡率與其易導(dǎo)致多臟器功能損傷有直接關(guān)系，而其中有40%～50%的膿毒癥為導(dǎo)致心功能不全，其病理表現(xiàn)為心室擴(kuò)張、收縮及舒張功能障礙［1］。心臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的損傷是心功能不全發(fā)生的主要原因。細(xì)胞凋亡在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，已有的試驗(yàn)已證明抗凋亡治療有逆轉(zhuǎn)膿毒癥心肌損傷的作用［2］。而在中醫(yī)學(xué)膿毒癥認(rèn)識(shí)中，心功能不全多責(zé)之于邪氣損傷心陽、心陽不足。參附注射液具有溫陽祛邪的作用，尤其多用于癥見心陽不足的患者，而對(duì)其抗膿毒癥心肌損傷的機(jī)制探討較少。因此本研究通過觀察參附注射液對(duì)大鼠膿毒癥模型心肌損傷標(biāo)記物、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響，探討參附注射液對(duì)膿毒癥大鼠心臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物雄性清潔級(jí)SD大鼠，24只，體質(zhì)量（200± 20）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。造模前于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.2藥物與試劑參附注射液（雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20043117）。戊巴比妥鈉。氯仿，異丙醇，二硫代蘇糖醇，RNasin，dNTP，隨機(jī)引物，DNaseI，逆轉(zhuǎn)錄酶，SYBR I，50×Calibration，HS ExTaq酶及10×Buffer等；TNF-α ELISA試劑盒（煙臺(tái)賽爾斯公司）；LightShift化學(xué)發(fā)光EMSA試劑盒（Pierce，美國(guó)）等。低溫離心機(jī)；紫外分光光度計(jì)；電泳轉(zhuǎn)膜裝置；數(shù)顯恒溫水浴鍋；Model 550酶標(biāo)儀；BioSenSC300凝膠圖像分析系統(tǒng)；PTC-225 Peltier Thermal Cycler；Rotor-Gene RG-3000 Real-Time Thermal Cycler等。

1.3分組與造模按體質(zhì)量隨機(jī)將24只SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組和參附組，每組8只動(dòng)物。膿毒癥模型制備方法參照文獻(xiàn)報(bào)道以盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法制備膿毒癥模型［3］。模型組大鼠行CLP術(shù)后，分別于0、6、12 h尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液5 mL/kg，參附組分別于CLP術(shù)后0、6、12 h行尾靜脈注射參附注射液5 mL/kg。

1.4標(biāo)本采集與檢測(cè)各組于CLP術(shù)后24 h分別麻醉并腹主動(dòng)脈采血處死，留取心肌組織行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)；假手術(shù)組麻醉后開腹翻動(dòng)腸道，關(guān)腹，24 h后麻醉，腹主動(dòng)脈采血處死，留取心肌組織行相關(guān)檢測(cè)。應(yīng)用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)心肌損傷標(biāo)志物，指標(biāo)包括心肌肌酸激酶（CK）和心肌肌酸激酶同工酶（CK-MB）。TUNEL法檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡取心肌組織，制備石蠟切片。具體方法依照試劑盒說明書。熒光定量PCR法檢測(cè)心肌Bcl-2 mRNA水平，總RNA提取方法如下：1）約100 mg組織于冰浴勻漿器中，冰上迅速研磨成勻漿液，加入1 mL Trizol，劇烈震蕩，室溫放置5 min。2）加入0.2 mL的氯仿，蓋好后漩渦劇烈震蕩15 s，室溫放置2～3 min，然后離心12000 r/min，15 min，4℃。離心后分成3層，下面的紅色為酚-氯仿相，1個(gè)中間層，一面是無色的水相。RNA只存在于水相中。3）將上層水相轉(zhuǎn)移到另一干凈的EP管中，加入等體積的異丙醇，靜置30 min，-20℃，然后離心12000 r/min，15 min，4℃。4）去上清液，加入1 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，振蕩器混勻，離心7500×g，5 min，4℃。5）去上清，置真空或空氣中5～10 min，干燥RNA沉淀。根據(jù)沉淀的量加入適量的RNase free水溶解RNA，去除基因組DNA；RNA定量后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；引物序列為Bcl-2（110bp），F(xiàn)：5′-AGTACCTGAACCGGC ATCTG-3。R：5′-CAGCCAGGAGAAATCAACAG-3′。GAPDH（130bp），F(xiàn)：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3。R：5′-GGCATG GACTGTGGTCATGAG-3′。以總cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，應(yīng)用相對(duì)定量方法分析各樣本的ΔCt值（ΔCt=母的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值），再依據(jù)ΔΔCt值=實(shí)驗(yàn)組ΔCt值-對(duì)照組ΔCt值計(jì)算2-ΔΔCt的值。當(dāng)目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率接近時(shí)，2-ΔΔCt的值表示目的基因在實(shí)驗(yàn)組樣本中相對(duì)于對(duì)照組樣本的表達(dá)倍數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。各項(xiàng)計(jì)量資料以（±s）表示。采用單因素方差分析；方差齊性選用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett’s T3法檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠心肌酶譜水平比較見表1。與假手術(shù)組比較，模型組、參附組大鼠血清CK-MB、CK較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，參附組大鼠血清CK-MB、CK較模型組明顯降低（P＜0.05）。

表1　各組大鼠心肌酶水平比較（U/L，±s）

表1　各組大鼠心肌酶水平比較（U/L，±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別nCK-MBCK假手術(shù)組82187.41±556.631189.40±245.87模型組84208.51±382.57*3216.75±565.42*參附組83584.59±347.06*△1986.21±366.73*△

2.2各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡比較見表2和圖1。各組均可見凋亡細(xì)胞，模型組、參附組大鼠心肌細(xì)胞TUNEL評(píng)分平均光密度（MOD）均高于假手術(shù)組（P＜0.05）；參附組MOD較模型組明顯降低（P＜0.05）。

表2　各組大鼠心肌細(xì)胞MOD及Bcl-2 mRNA表達(dá)比較（±s）

表2　各組大鼠心肌細(xì)胞MOD及Bcl-2 mRNA表達(dá)比較（±s）

組別n假手術(shù)組8模型組8參附組8 MOD（U/L）Bcl-2 mRNA（10-3）0.09±0.055.75±0.09 0.24±0.11*3.83±0.07*0.18±0.09*△4.86±0.08*△

圖1　各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況（20倍）

2.3各組大鼠心肌組織Bcl-2 mRNA表達(dá)水平變化見表2。模型組、參附組大鼠心肌Bcl-2 mRNA均較假手術(shù)組明顯降低（P＜0.05）；參附組大鼠心肌Bcl-2 mRNA與模型組明顯升高（P＜0.05）。

3　討論

膿毒癥可使多個(gè)器官同時(shí)受損，而心臟是其損傷最為重要的靶器官。心肌酶屬胞漿酶，組織損傷時(shí)由于細(xì)胞膜的完整性破壞而釋放出來，血清CK、CK-MB是最常用的心肌損害指標(biāo)。CK-MB絕大部分存在于心肌細(xì)胞內(nèi)，是心肌細(xì)胞特異性酶，能夠及時(shí)反映心肌損害的程度；CK主要分布在骨骼肌、心肌和腦組織。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組和治療組兩種酶均有不同程度的升高，與假手術(shù)組比較有顯著差異，表明CLP動(dòng)物存在心肌的病理損傷。治療組與模型組比較，兩種酶均有所降低，表明參附注射液對(duì)膿毒癥心肌損傷有一定的保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥心肌損傷除與心肌細(xì)胞低氧、線粒體損傷能量代謝障礙有關(guān)，還與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)［1］。膿毒癥心肌細(xì)胞的凋亡過程涉及多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中線粒體途徑是最重要的通路之一［4］。Bcl-2是此途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，有抑制凋亡作用。Bcl-2表達(dá)占優(yōu)勢(shì)時(shí)可阻止細(xì)胞凋亡［5］。在小鼠CLP模型，抗凋亡蛋白Bcl-2的過表達(dá)可抑制巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞凋亡［6］，腸道特異Bcl-2過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠膿毒癥死亡率較其他小鼠低［7］。陳華文等［8］研究亦發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)下降，心肌細(xì)胞凋亡增加。本研究顯示，模型組及參附組大鼠心肌Bcl-2 mRNA表達(dá)均高于假手術(shù)組，心肌細(xì)胞凋亡增加，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為正氣不足是膿毒癥發(fā)生之根本。“正氣存內(nèi)，邪不可干”“邪之所湊，其氣必虛”，從根本上闡明了疾病發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在“正虛”因素，也為扶正祛邪防治膿毒癥及膿毒癥器官損傷提供了理論依據(jù)?！秲?nèi)經(jīng)》有“少火生氣，壯火食氣”的論述，膿毒癥邪氣傷人，先傷臟腑之功能，后則損及形質(zhì)，重癥膿毒癥的高熱階段必然耗損正氣，甚則陽氣耗散，膿毒癥心臟損傷，也表現(xiàn)為先傷及心陽而后心之形質(zhì)受損?！瓣柣瘹?、陰成形”，膿毒癥時(shí)邪氣損傷心陽，心陽受損、氣化失司，陰血不生，臟腑失養(yǎng)而進(jìn)一步加劇心臟功能障礙。因此溫陽益氣是治療膿毒癥心臟損傷的關(guān)鍵，通過溫心陽，心陽恢復(fù)、氣化得行則陰血自生，從而恢復(fù)正常的臟腑功能。

膿毒癥心肌損傷，為邪氣盛實(shí)，心陽虛衰。參附注射液由紅參、附子組成，主要有效成分為人參皂苷和烏頭堿，具有溫陽益氣養(yǎng)心、回陽救逆之效。臨床常用于膿毒癥而癥見胸悶、氣促、悸動(dòng)不安、動(dòng)則尤甚等心陽不足證候者。參附注射液具有抗缺血再灌注損傷、改善心臟功能、抗休克、增強(qiáng)心肌收縮力等作用。江榮林等［9］研究表明，參附注射液能夠顯著改善膿毒癥患者的組織缺氧。邱澤亮等［10］則發(fā)現(xiàn)參附注射液可以降低嚴(yán)重膿毒癥患者急性生理和慢性健康狀況評(píng)分（APACHE）Ⅱ、Marshall評(píng)分及白介素-6（IL-6）和C反應(yīng)蛋白（CRP）水平，明顯升高CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞HLA－DR，提示參附注射液能夠調(diào)節(jié)促炎和抗炎的平衡，并雙向調(diào)節(jié)膿毒癥導(dǎo)致的免疫紊亂。本研究顯示，與模型組比較，參附組大鼠心肌Bcl-2 mRNA表達(dá)較模型組上調(diào)，細(xì)胞凋亡明顯減少，心肌損傷酶學(xué)指標(biāo)較模型組降低。通過上述實(shí)驗(yàn)分析，可證明參附注射液可以通過上調(diào)心肌細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)，減少膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡，改善膿毒癥相關(guān)的心肌損傷。

膿毒癥心肌損傷機(jī)制繁多，同時(shí)也存在其他治法及方劑使用的臨床及實(shí)驗(yàn)報(bào)道，對(duì)于參附注射液逆轉(zhuǎn)膿毒癥心肌損傷的劑量療效關(guān)系、其他作用機(jī)制及與其他治法方劑的比較仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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Effect of Shenfu Injection on the Cardiomyocyte Apoptosis and the Expression of Bcl-2 in Rat with Sepsis

HU Dandan，LOU Liming，XU Huilian.The Third Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310005，China

Objective：To investigate the anti-myocardial injury mechanism of Shengfu Injection by the change of myocardial enzyme and the expression of Bcl-2 and myocardial cell apoptosis in rat model with sepsis.Methods：24 male SD rats were randomly divided into three groups：the sham-operated group，the model group and the Shenfu group，8 rats in each.Rat sepsis models were established with CLP.The change of myocardial enzyme spectrum was observed.Myocardial apoptosis was detected with TUNEL，and the expression of Bcl-2 mRNA in myocardial cell was detected with RT-PCR.Results：The rise of myocardial enzyme spectrum in Shengfu Injection group was lower than that of the model group（P＜0.05）.Myocardial enzyme level of the model group was higher than that of the sham-operated group（P＜0.05）.TUNE L scores of cardiac muscle cells and MOD of Shengfu Injection group was lower than that of the model group（P＜0.05），and higher than that of the sham-operated group（P＜0.05）.The expression level of Bcl-2 mRNA in myocardial cell of model group was lower than the sham-operated group（P＜0.05），while the Shengfu Injection group was higher than the model grou（P＜0.05）. Conclusons：Shengfu Injection can alleviate injury in cardiac muscle caused by sepsis by upregulating the expression level of BCL-2 and reducing myocardial apoptosis.

Shengfu Injection；Sepsis；Apoptosis；Bcl-2

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1540-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.013

2015-04-18）

浙江中醫(yī)藥大學(xué)科研項(xiàng)目（2010LX22）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院一般項(xiàng)目（ZS10CA15）

（電子郵箱：xhl9366@163.com）