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    DIS3通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路促進人骨髓瘤細胞凋亡

    2021-02-10 06:01:02王蘭蘭
    山西醫(yī)科大學學報 2021年12期
    關鍵詞:兔抗人骨髓瘤通路

    王蘭蘭,張 婷,周 英,關 軍,程 平,鄒 亮

    (武漢市第一醫(yī)院血液內(nèi)科,武漢 430022;*通訊作者,E-mail:zouliang0127@163.com)

    多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一種以骨痛與病理性骨折、貧血、復發(fā)性感染、高鈣血癥、腎衰竭和異常出血為常見臨床表現(xiàn)的惡性腫瘤[1],其特征是單克隆漿細胞在骨髓中不受控制地增殖[2]。凋亡是一種程序化細胞死亡,許多針對血液系統(tǒng)惡性腫瘤凋亡的藥物顯示出較好的治療效果[3]。因此,抑制骨髓瘤細胞過度增殖,促進凋亡是一個重要方向。DIS3基因突變被認為是MM發(fā)病原因之一[4],但其具體作用機制目前還不清楚。PI3K/AKT/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)各種生物過程,在細胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用,阻斷PI3K/AKT/mTOR通路已成為多種癌細胞治療新的靶點[5]。研究顯示,PI3K/AKT/mTOR與MM之間關系密切[6,7],因此,我們推測DIS3可能是通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路來發(fā)揮其作用。在本實驗中,我們通過過表達及干擾骨髓瘤細胞中DIS3基因,研究由此所致的細胞凋亡及其潛在作用機制,為臨床治療MM提供些許思路。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料

    人骨髓瘤細胞株NCI-H929、RPMI 8226和U266購自美國模式菌種收集中心(ATCC)。RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清及Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司;真核表達載體PEGFP-N1購自美國Addgen公司;Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD Biosciences公司;Bax、Bcl-2、Caspase-3、PI3K、AKT、mTOR、GAPDH以及山羊抗兔二抗IgG購自美國Abcam公司。

    1.2 細胞的復蘇、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

    將人骨髓瘤細胞株NCI-H929、RPMI 8226和U266分別培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中(含10% FBS,1%青鏈霉素溶液),置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中(5% CO2)進行培養(yǎng)。將PEGFP-N1-DIS3及DIS3-siRNA根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書對NCI-H929、RPMI 8226和U266細胞進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染8 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.3 流式細胞術檢測細胞凋亡

    將3種細胞均按照以下模式分成5組:對照組(control)、DIS3-siRNA陰性對照(negative control, NC)組、DIS3空載組、DIS3過表達組、DIS3-siRNA組。將轉(zhuǎn)染后48 h的各組細胞按104個/孔的濃度進行接種,每孔加100 μl細胞培養(yǎng)液,置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后收集各組細胞,消化重懸后,4 ℃下1 000g,離心5 min,棄上清;加入1 ml預冷PBS后,1 000g,4 ℃離心5 min,然后分別加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各10 μl,輕輕混勻,室溫下避光孵育30 min后加入300 μl binding buffer,上機檢測;使用CYEXPERT分析軟件對所獲數(shù)據(jù)進行分析。

    1.4 RT-qPCR檢測凋亡相關基因Bax、Bcl-2和Caspase-3及PI3K/AKT/mTOR信號通路相關基因mRNA的表達水平

    48 h后收集各組細胞,分別提取各組細胞樣本RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用20 μl PCR反應體系擴增:上、下游引物各0.5 μl,SYBR Green Mix 10 μl,cDNA模板1 μl,ddH2O 8 μl。引物序列見表1。PCR反應程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 5 s、56 ℃ 10 s、72 ℃ 25 s,39個循環(huán);65 ℃ 5 s、95 ℃ 50 s。以GAPDH為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法進行統(tǒng)計分析。

    表1 凋亡相關基因和PI3K/AKT/mTOR信號通路相關基因的引物序列Table 1 Primer sequences of apoptosis-related genes and PI3K/AKT/mTOR signaling pathway-related genes

    1.5 Western bolt檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3及PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白表達量

    轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細胞,室溫下充分裂解細胞,離心后取上清,用BCA法對蛋白進行測定。每孔上樣20 μg蛋白,經(jīng)12% SDS-PAGE電泳、分離、轉(zhuǎn)移、封閉后,分別加入兔抗人Bax抗體(1 ∶800),兔抗人Bcl-2抗體(1 ∶1 000),兔抗人Caspase-3抗體(1 ∶500),兔抗人PI3K抗體(1 ∶500),兔抗人AKT抗體(1 ∶500),兔抗人mTOR抗體(1 ∶800)及兔抗人GAPDH抗體(1 ∶1 000)。4 ℃孵育過夜后,加入羊抗兔IgG二抗,室溫孵育1 h,用PBST洗滌3次,每次5 min后,加入ECL化學發(fā)光劑,然后將膜置于全自動化學發(fā)光分析儀中檢測。

    1.6 統(tǒng)計學分析

    2 結(jié)果

    2.1 DIS3過表達或干擾對細胞凋亡的影響

    與DIS3空載組比較,DIS3過表達組細胞凋亡率明顯升高(P<0.01);與DIS3-siRNA NC組比較,DIS3-siRNA組的細胞凋亡率明顯降低(P<0.05或P<0.01,見圖1)。

    與DIS3空載組比較,**P<0.01;與DIS3-siRNA NC組比較,#P<0.05,##P<0.01圖1 流式細胞術檢測NCI-H929、RPMI 8226和U266細胞凋亡水平Figure 1 Apoptosis of NCI-H929, RPMI 8226 and U266 cells detected by flow cytometry

    與DIS3空載組比較,**P<0.01;與DIS3-siRNA NC組比較,#P<0.05,##P<0.01圖1 流式細胞術檢測NCI-H929、RPMI 8226和U266細胞凋亡水平Figure 1 Apoptosis of NCI-H929, RPMI 8226 and U266 cells detected by flow cytometry

    2.2 DIS3過表達或干擾對凋亡相關基因Bax、Bcl-2、Caspase-3表達水平的影響

    與DIS3空載組相比,DIS3過表達組NCI-H929、RPMI 8226和U266細胞Bax和Caspase-3 mRNA表達量顯著上調(diào)(P<0.01),Bcl-2 mRNA表達量顯著下調(diào)(P<0.05或P<0.01);與DIS3-siRNA NC組比較,DIS3-siRNA組3種細胞Bax和Caspase-3 mRNA表達量顯著下調(diào)(P<0.01),而Bcl-2 mRNA表達量顯著上調(diào)(P<0.01,見圖2)。

    2.3 DIS3過表達或干擾對凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表達的影響

    與DIS3空載組比較,DIS3過表達組3種細胞Bax和Caspase-3蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05),Bcl-2蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05或P<0.01);與DIS3-siRNA NC組比較,DIS3-siRNA組細胞Bax和Caspase-3蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05),Bcl-2蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05,見圖3)。

    與DIS3空載組比較,*P<0.05,**P<0.01;與DIS3-siRNA NC組比較,##P<0.01圖2 細胞凋亡相關指標Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA水平的表達變化Figure 2 The mRNA levels of apoptosis-related indicators Bax, Bcl-2 and Caspase-3

    與DIS3空載組比較,*P<0.05,**P<0.01;與DIS3-siRNA NC組比較,#P<0.01圖3 細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表達量變化Figure 3 Changes in the expression of apoptotic proteins Bax, Bcl-2 and Caspase-3

    2.4 DIS3過表達或干擾對PI3K、AKT、mTOR基因表達水平的影響

    與DIS3空載組比較,DIS3過表達組3種細胞PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達量顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01);與DIS3-siRNA NC組比較,DIS3-siRNA組細胞PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達量顯著下調(diào)(P<0.01,見圖4)。

    與DIS3空載組比較,*P<0.05,**P<0.01;與DIS3-siRNA NC組比較,##P<0.01圖4 各組細胞PI3K、AKT、mTOR基因mRNA水平表達Figure 4 The mRNA level expression of PI3K, AKT, mTOR in three kinds of cells in each group

    2.5 DIS3過表達或干擾對PI3K、AKT、mTOR蛋白表達的影響

    與DIS3空載組比較,DIS3過表達組3種細胞PI3K、AKT、mTOR蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05或P<0.01);與DIS3-siRNA NC組比較,DIS3-siRNA組細胞PI3K、AKT、mTOR蛋白相對表達量顯著降低(P<0.01,見圖5)。

    3 討論

    本課題組前期研究結(jié)果顯示,DIS3過表達組及DIS3干擾組轉(zhuǎn)染效果良好,其中DIS3-siRNA2對DIS3的沉默效果最佳[8],因此選用DIS3-siRNA2用于后續(xù)DIS3-siRNA組。本課題組前期研究結(jié)果顯示[9],DIS3能使人骨髓瘤細胞阻滯在G0/G1期,且可降低腫瘤相關蛋白的表達。但其對骨髓瘤細胞表現(xiàn)出的惡性生物學特征的機制還有待進一步研究。王欣等[10]研究結(jié)果顯示,MTH1抑制劑能明顯抑制MM細胞增殖和誘導細胞凋亡,可有效治療MM。提示抑制MM細胞增殖及促進MM細胞凋亡對于治療MM具有重要意義。本研究結(jié)果顯示,DIS3過表達能顯著促進3種人骨髓瘤細胞的凋亡水平,表現(xiàn)為顯著增加的細胞總凋亡率、促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表達升高以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達降低;反之,通過siRNA技術抑制DIS3的表達則從一定程度上抑制了癌細胞的凋亡進程,表現(xiàn)為細胞總凋亡率降低、促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表達下降以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達升高;提示對DIS3進行表達調(diào)控能顯著影響骨髓瘤細胞的凋亡進程,其中過表達DIS3能對骨髓瘤細胞起到顯著的促凋亡作用。

    PI3K/AKT/mTOR是一種重要的信號通路,其可以精確調(diào)控細胞內(nèi)外的信號進而調(diào)節(jié)細胞代謝、增殖和生存[11],其過度活化能夠抑制細胞凋亡,增強細胞對低氧和營養(yǎng)缺乏的耐受能力[12,13]。因此,PI3K/AKT/mTOR也成為多種腫瘤藥物的潛在作用靶點。研究表明,研究表明,在MM細胞中,敲低類固醇5α-還原酶I型基因表達通過PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制了細胞凋亡和自噬的發(fā)生,提示MM細胞的惡性生物學特征的改變在一定程度上依賴于PI3K/AKT/mTOR信號通路的活化[14]。在本研究中,我們也檢測了PI3K/AKT/mTOR信號通路相關基因在mRNA及蛋白水平上的表達,結(jié)果顯示,DIS3過表達能顯著促進PI3K、AKT、mTOR mRNA和蛋白表達量,而干擾DIS3表達能顯著抑制PI3K、AKT、mTOR mRNA和蛋白表達量,提示DIS3的表達調(diào)控對骨髓瘤細胞凋亡進程的影響可能是通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路來實現(xiàn)的。

    與DIS3空載組比較,**P<0.01;與DIS3-siRNA NC組比較,#P<0.05,##P<0.01圖5 各組細胞PI3K、AKT、mTOR蛋白水平表達變化Figure 5 Protein expression of PI3K, AKT, mTOR in each group

    綜上所述,DIS3過表達能顯著促進骨髓瘤細胞凋亡,促進促凋亡基因Bax、Caspase-3的表達水平并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,其機制可能與激活PI3K/AKT/mTOR途徑的活性有關。本實驗在前期研究的基礎上,進一步深入研究了DIS3對MM細胞凋亡的影響及其潛在的作用機制,這為靶向治療MM的研究提供了一定的理論基礎。

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