RP-HPLC法測定酪蛋白水解物中ACE抑制肽的含量

趙　　勇，胡志和，*，孫振剛，武文起，馮永強(qiáng)，薛　　璐

（1.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134；2.天津海河乳業(yè)有限公司，天津300402）

RP-HPLC法測定酪蛋白水解物中ACE抑制肽的含量

趙勇1，胡志和1，*，孫振剛2，武文起2，馮永強(qiáng)2，薛璐1

（1.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134；2.天津海河乳業(yè)有限公司，天津300402）

目的：為了建立定量檢測酪蛋白水解物中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制肽的反相高效液相色譜（RP-HPLC）方法。方法：酪蛋白先經(jīng)過胃蛋白酶水解、再經(jīng)過胰蛋白酶水解，用風(fēng)味蛋白酶和離子交換樹脂對(duì)水解物先后進(jìn)行脫苦和脫鹽處理。建立標(biāo)準(zhǔn)品十肽酪氨酸-谷氨酰胺-賴氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸（YQKFPQYLQY）的RP-HPLC檢測方法，運(yùn)用外標(biāo)法測定酪蛋白水解物中的ACE抑制肽YQKFPQYLQY的含量。結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)品十肽YQKFPQYLQY質(zhì)量濃度在2.5～4.5mg/mL（R2=0.95496）范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。酪蛋白水解物中所含十肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.96694%±0.00131%。結(jié)論：本液相檢測方法操作簡便、快速，適用于ACE抑制肽YQKFPQYLQY的定量檢測分析。

酪蛋白，水解物，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽，定量檢測，反相高效液相色譜法（RP-HPLC）

高血壓與冠心病等心腦血管疾病有十分緊密的相關(guān)性［1］，全世界的高血壓平均發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，高血壓對(duì)人類的生命健康構(gòu)成了巨大威脅［2］。目前治療高血壓一般使用合成藥物，藥物治療高血壓雖然有一定療效，但可能引起腎臟損傷等毒副作用［3-4］。此外，長期服用藥物會(huì)產(chǎn)生藥物依賴或抗藥性。Maruyama等［5］從酪蛋白水解物中提取出具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）活性的十二肽苯丙氨酸-苯丙氨酸-纈氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-谷氨酸-纈氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-賴氨酸（FFVAPFPEVFGK）。Nakamura等［6-7］從酸奶中分離出兩個(gè)三肽纈氨酸-脯氨酸-脯氨酸（VPP）和異亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸（IPP），體外和體內(nèi)檢測證明具有ACE活性抑制作用。人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)食物蛋白質(zhì)經(jīng)過水解后所得到的小肽具有很好的降壓效果，并且無毒副作用，因此，食物源ACE抑制肽逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)話題［8］。

目前，ACE活性抑制肽主要采用體內(nèi)和體外兩種方法進(jìn)行檢測［9］。體內(nèi)檢測即用原發(fā)性高血壓大鼠（SHR）進(jìn)行灌胃，測定灌胃前后的大鼠尾動(dòng)脈收縮壓，來判斷ACE活性抑制肽的作用效果［10］。體外檢測最常用的方法是Cushman和Cheung［11］提出并建立的紫外分光光度法，ACE可以催化馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL）分解產(chǎn)生馬尿酸（Hip）和二肽組氨酸-亮氨酸（HL），ACE抑制肽通過抑制ACE活性致使Hip生成量減少，在228nm測定Hip的紫外吸收值，并計(jì)算得到ACE抑制肽的抑制率和IC50（ACE活性抑制率達(dá)到50%時(shí)，所需抑制劑的濃度值，IC50用以表示ACE活性抑制肽的作用效果［12］。但是這兩種檢測ACE活性抑制肽的方法不能夠快速、定量確定樣品中ACE活性抑制肽的含量。廖曉慧等［13］通過建立RP-HPLC法對(duì)重組大腸桿菌發(fā)酵液中的降壓肽進(jìn)行定量測定，得到了快速、穩(wěn)定的檢測方法。Yamada等［14］采用RP-HPLC法對(duì)牛乳酪蛋白水解物中的ACE活性抑制肽甲硫氨酸-賴氨酸-脯氨酸（MKP）進(jìn)行含量測定。此外，醋酸艾塞那肽［15］、胸腺五肽［16］、螞蟥多肽［17］和β-酪啡肽［18］等肽類都可以通過高效液相色譜法進(jìn)行靈敏、精準(zhǔn)的定量檢測。

本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中，先用胃蛋白酶，再用胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白，獲得兩個(gè)具有ACE活性抑制作用的酪蛋白片段（十肽YQKFPQYLQY和二肽酪氨酸-絲氨酸（YS））［19］。本研究采用RP-HPLC法對(duì)酪蛋白雙酶水解物中所含的ACE抑制肽（十肽：YQKFPQYLQY）進(jìn)行定量測定，為水解酪蛋白制備ACE抑制肽提供快速的檢測和監(jiān)測方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

酪蛋白（酪蛋白含量≥80%） 新西蘭TATUA公司；胃蛋白酶（10000U/g）、胰蛋白酶（10000U/g）、NHippuryl-His-Leuhydrate（HHL）、Angiotensin Converting Enzyme from rabbit lung（ACE，來源于兔肺）美國Sigma公司；風(fēng)味蛋白酶（15000U/g）丹麥Novo公司；001×7強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂、201×7強(qiáng)減性苯乙烯系陰離子交換樹脂南開大學(xué)化工廠；三氟乙酸（色譜純） 天津南開允公合成技術(shù)有限公司；乙腈（色譜純） 美國J T Baker公司；超純水SMART系列超純水系統(tǒng)制；十肽標(biāo)準(zhǔn)品（YQKFPQYLQY） 批號(hào)BV11101201，經(jīng)過HPLC檢測和MS檢測，純度99.08%，分子量1377.58，上海楚肽生物技術(shù)有限公司合成；氯化鈉、硼酸、硼砂、乙酸乙酯均為分析純，天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；鹽酸分析純，天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司國。

Vydac 218TP54 C18液相分析型色譜柱（250mm× 4.6mm，5μm） 美國Grace公司；FA1104N電子天平上海精密科學(xué)儀器有限公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；EMS-8A加熱磁力攪拌器天津市歐諾儀器儀表有限公司；L535-1低速離心機(jī)長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；3-18K高速冷凍離心機(jī)美國Sigma公司；冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；NF膜實(shí)驗(yàn)機(jī)系統(tǒng)海得科膜分離技術(shù)（北京）有限公司；6000u中空纖維膜組件天津膜天膜工程技術(shù)有限公司；SMART-N SMART系列超純水系統(tǒng)上?？道追治鰞x器有限公司；TU-1810DPC紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；1500 Q05/2000ES全自動(dòng)四元梯度高效液相色譜儀（配有UV1000紫外檢測器） 美國SSI/Alltech公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1酪蛋白水解產(chǎn)物的制備

1.2.1.1胃蛋白酶水解底物質(zhì)量濃度為7g/100mL，水解溫度為37℃，pH3.0，酶與底物的質(zhì)量比為1∶100，水解時(shí)間為3h。水解過程中滴加1mol/L HCl溶液或1mol/L NaOH溶液維持pH3.0，3h后煮沸滅酶結(jié)束反應(yīng)［20］。

1.2.1.2胰蛋白酶水解將經(jīng)胃蛋白酶水解后的酶解液降溫至48℃，調(diào)整pH7.7，用胰蛋白酶繼續(xù)水解，酶與底物的質(zhì)量比為1∶500，水解過程中滴加1mol/L HCl溶液或1mol/L NaOH溶液維持pH7.7，3h后煮沸滅酶結(jié)束反應(yīng)［21］。

1.2.1.3風(fēng)味蛋白酶水解將經(jīng)胰蛋白酶水解后的酶解液滅酶后冷卻至50℃，調(diào)整pH6.8，用風(fēng)味蛋白酶水解，酶底比（［E］/［S］）為2800U/g，水解時(shí)間為3h。水解過程中滴加1mol/L HCl溶液或1mol/L NaOH溶液維持pH6.8，3h后煮沸滅酶結(jié)束反應(yīng)，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至7.0，用4000r/min轉(zhuǎn)速離心15min，收集上清液［22-23］。

1.2.1.4水解物的超濾利用截留分子量為6000u的中空纖維膜組件，對(duì)收集的上清液進(jìn)行循環(huán)超濾［24-26］。在25℃條件下，將壓力控制在0.05～0.10MPa，收集濾出物，即得到分子量在6000u以下的溶液。

1.2.1.5超濾物的脫鹽將超濾后所得到的溶液先經(jīng)過強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，再經(jīng)過強(qiáng)減性苯乙烯系陰離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽［27-28］。陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂裝柱體積各為35mL，超濾溶液上樣體積為150mL，流速為5.0mL/min。將脫鹽后的溶液進(jìn)行冷凍干燥，制成粉末待用。

1.2.2水解產(chǎn)物中目標(biāo)肽的檢測

1.2.2.1色譜條件［13，16，18］用1500 Q05/2000ES型全自動(dòng)四元梯度高效液相色譜儀（配有UV1000紫外檢測器）對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行分析，色譜柱：Vydac 218TP54 C18液相分析型色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相A：含0.1%三氟乙酸的超純水；流動(dòng)相B：含0.1%三氟乙酸的乙腈；流速：1.0mL/min；檢測波長：220nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。十肽梯度洗脫程序見表1。

表1　十肽YQKFPQYLQY梯度洗脫程序Table 1　Gradient elution condition of decapeptide YQKFPQYLQY

1.2.2.2目標(biāo)肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品十肽（YQKFPQYLQY），加超純水配制濃度為2.5、3、3.5、4、4.5、5mg/mL溶液，然后經(jīng)過0.45μm的微孔濾膜過濾，得到不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按照1.2.2.1的色譜條件檢測標(biāo)準(zhǔn)肽的各濃度下峰面積，然后用峰面積和濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.3樣品中目標(biāo)肽的檢測準(zhǔn)確稱取自制樣品粉末20.0mg，加超純水配制成20mg/mL的溶液，經(jīng)過0.45μm的微孔濾膜過濾，充分搖勻。然后按照1.2.2.1的條件分別對(duì)自制樣品中的十肽進(jìn)行檢測。目標(biāo)肽含量計(jì)算公式如下。

目標(biāo)肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）=水解物中目標(biāo)肽的質(zhì)量/水解物的質(zhì)量×100

1.2.3水解產(chǎn)物及十肽的ACE抑制率及半數(shù)抑制濃度（IC50）的測定

1.2.3.1ACE抑制率的體外檢測采用HHL法［29］進(jìn)行體外ACE抑制率的檢測，方法見表2。1mol/L HCl溶液：作為反應(yīng)終止劑，用超純水配制；100mmol/L硼酸-硼砂緩沖溶液：其中含300mmol/L NaCl，用超純水配制，調(diào)pH至8.3；5mmol/L HHL試劑：將25mg HHL溶解于硼酸-硼砂緩沖溶液；0.1U/mL ACE試劑：將0.25U的ACE溶解于2.5mL硼酸-硼砂緩沖溶液；抑制劑：將待測樣品用硼酸-硼砂緩沖溶液配制成不同濃度。按表2將各試劑分別加入到5mL離心管中并混勻，每管做3個(gè)平行。待反應(yīng)結(jié)束后，向離心管中加入1.7mL乙酸乙酯進(jìn)行萃取，經(jīng)過充分振蕩混勻后，在4000r/min、15min、4℃條件下離心。離心結(jié)束后，吸取1mL上層乙酸乙酯層于試管中，在120℃經(jīng)過30min烘干，取出后，向試管中加入3mL超純水，經(jīng)過20s振蕩混勻后，在228nm條件下檢測吸光度，所測樣品的ACE抑制率計(jì)算公式為：

ACE抑制率（%）=（B-A）/（B-C）×100

式中：A為ACE抑制劑和ACE同時(shí)存在時(shí)的吸光度；B為不加ACE抑制劑的吸光度，即對(duì)照；C為ACE和HHL空白反應(yīng)的吸光度，即空白。

表2　ACE抑制率體外檢測方法（μL）Table 2　Detection method of ACE activity inhibition peptide in vitro（μL）

1.2.3.2IC50的測定稱取標(biāo)準(zhǔn)品十肽YQKFPQYLQY，用硼酸-硼砂緩沖液配制成濃度為5、10、20、40、60μg/mL的溶液。稱取水解產(chǎn)物冷凍干燥后所制得的粉末，用緩沖液配制成濃度為0.1、0.2、0.3、0.6、1.0mg/mL的溶液，分別測定各溶液的ACE抑制率，以ACE抑制率為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制ACE抑制率曲線，并計(jì)算得出IC50值。

1.3數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用軟件Origin 8.0，以十肽標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)制作十肽標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品所測得的峰面積，運(yùn)用2.2中所列十肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算公式計(jì)算得到樣品中十肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)。運(yùn)用軟件Microsoft Excel，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以ACE抑制率為縱坐標(biāo)，分別制作十肽質(zhì)量濃度與ACE抑制率關(guān)系曲線（或酪蛋白水解產(chǎn)物質(zhì)量濃度與ACE抑制率關(guān)系曲線），擬合方程，然后令A(yù)CE抑制率=50%，即縱坐標(biāo)y=50，移項(xiàng)得到一個(gè)僅有x的一元二次方程ax2+bx+c=0，通過一元二次方程求根公式計(jì)算得到，舍去不在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的根，得到的另一根x即為IC50值。

2　結(jié)果與分析

2.1十肽標(biāo)準(zhǔn)曲線

將1.2.2.2配制好的質(zhì)量濃度分別為2.5、3、3.5、4、4.5mg/mL的十肽系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.2.2.1中表1條件注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得十肽的回歸方程為：y= 0.9347x-0.92592，R2=0.95496，結(jié)果見表3、圖1、圖2。保留時(shí)間平均值為19.3596min，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1126min，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.58%，峰面積百分比平均值為96.1714%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1327%，RSD為0.14%。

表3　十肽標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與相應(yīng)質(zhì)量濃度Table 3　Peak area of decapeptide standard substance and corresponding concentration

圖1　2.5mg/mL十肽標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖Fig.1　Liquid chromatograph of 2.5mg/mL decapeptide standard substance

圖2　十肽標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Standard curve of decapeptide standard substance

2.2樣品中十肽含量的測定

將1.2.2.3配制好的濃度為20mg/mL的樣品溶液按照1.2.2.1中表1條件注入液相色譜儀，記錄所得峰面積，根據(jù)所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中所含十肽的含量。按照相同條件重復(fù)進(jìn)樣4次，所得保留時(shí)間平均值為19.598min，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.099min，RSD為0.50%，峰面積平均值為25993，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2452，RSD為9.43%，樣品中十肽質(zhì)量濃度平均值為0.99339mg/mL，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.00026mg/mL，RSD為0.026%，樣品中十肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為4.96694%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.00131%，RSD為0.026%，結(jié)果見表4、圖3。

表4　樣品中十肽含量測定結(jié)果Table 4　Determination results of decapeptide in sample

圖3　樣品中十肽含量液相色譜圖Fig.3　Liquid chromatograph of decapeptide in sample

2.3標(biāo)準(zhǔn)品及酪蛋白水解產(chǎn)物的ⅠC50值

2.3.1十肽YQKFPQYLQY的IC50值通過一元二次回歸分析，得到回歸方程為y=-0.0225x2+2.1623x+27.396（R2=0.9709），計(jì)算得到十肽的IC50值為11.75μg/mL。

圖4　十肽質(zhì)量濃度與ACE抑制率關(guān)系曲線Fig.4　Decapeptide concentration curve with ACE inhibition rate

2.3.2酪蛋白水解產(chǎn)物的IC50值通過一元二次回歸分析，得到回歸方程為y=-148.70x2+243.29x-2.2954（R2=0.9955），計(jì)算得到酪蛋白水解產(chǎn)物的IC50值為0.27mg/mL。

圖5　酪蛋白水解產(chǎn)物質(zhì)量濃度與ACE抑制率關(guān)系曲線Fig.5　Casein hydrolyzate concentration curve with ACE inhibition rate

由圖4、圖5可以看出十肽和酪蛋白水解物的ACE抑制率隨著質(zhì)量濃度的升高而增加，所以十肽和水解物都具有一定的質(zhì)量濃度-效應(yīng)關(guān)系。由十肽的IC50值為11.75μg/mL可知十肽具有較高的ACE抑制效果，酪蛋白水解物的IC50約為十肽的23倍，說明水解物的ACE活性抑制作用低于十肽。結(jié)合RP-HPLC檢測結(jié)果可知，當(dāng)酪蛋白水解物的IC50為0.27mg/mL時(shí)，其中所含十肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.96694% ±0.00131%。

3　結(jié)論

酪蛋白先經(jīng)過胃蛋白酶（pH3.0）水解3h后，再胰蛋白酶（pH7.7）水解3h，水解物經(jīng)風(fēng)味蛋白酶脫除苦味，經(jīng)過6000u的中空纖維膜組件得到分子質(zhì)量在6000u以下的混合多肽，通過離子交換樹脂除鹽，得到具有ACE抑制作用的水解物，其IC50為0.27mg/mL。應(yīng)用RP-HPLC法對(duì)水解物中所含十肽進(jìn)行定量檢測分析，測得水解物中所含十肽YQKFPQYLQY的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.96694%±0.00131%，RSD為0.026%。經(jīng)過體外ACE抑制檢測，十肽的IC50值為11.75μg/mL。因此，采用RP-HPLC法，可以快速地進(jìn)行定量檢測酪蛋白水解產(chǎn)物中所含有的ACE抑制肽（十肽：YQKFPQYLQY），操作簡便。在實(shí)際生產(chǎn)中，可用于目標(biāo)肽的檢測和監(jiān)測。

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Quantitative determination of ACE inhibitory peptides in casein hydrolyzate by RP-HPLC

ZHAO Yong1，HU Zhi-he1，*，SUN Zhen-gang2，WU Wen-qi2，F(xiàn)ENG Yong-qiang2，XUE Lu1
（1.Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China；2.Tianjin Haihe Dairy Co.，Ltd.，Tianjin 300402，China）

The purpose was to establish a method for quantitative determination angiotensin converting enzyme（ACE）inhibitory peptides in hydrolyzate of casein using reversed-phase high performance liquid chromatography（RP-HPLC）.Casein was hydrolyzed by pepsin，and then was hydrolyzed by trypsin.With flavourzyme for debittering of casein hydrolyzate.Salts of casein hydrolyzate were removed by ion exchange resin.The RPHPLC method to detect decapeptide YQKFPQYLQY was established.Using external standard method to determine YQKFPQYLQY of casein hydrolyzate.Results showed that，the linear range of decapeptide was 2.5～4.5mg/mL（R2=0.95496）.The decapeptide concentration in the casein hydrolyzate was 4.96694%±0.00131%. Therefore，the RP-HPLC was simple and rapid，suitable for the quantitative detection of ACE inhibitory peptides YQKFPQYLQY.

casein；hydrolyzate；angiotensin converting enzyme inhibitory peptide；quantitative determination；reversed phase-high performance liquid chromatography（RP-HPLC）

TS252.4

A

1002-0306（2015）10-0054-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.002

2014－08－29

趙勇（1989-），男，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

胡志和（1962-），男，碩士，教授，研究方向：專用功能食品。

天津市科技支撐項(xiàng)目（14ZCZDNC00017）；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（TD12-5049）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（14JCZDJC34500）。