響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取杏鮑菇黃酮類化合物工藝研究

孫　瓊，張直峰，李月梅

（山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041000）

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取杏鮑菇黃酮類化合物工藝研究

孫瓊，張直峰，李月梅*

（山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041000）

以工廠化生產(chǎn)的杏鮑菇為原料，利用超聲波輔助提取，響應(yīng)面法優(yōu)化杏鮑菇黃酮類化合物的提取工藝參數(shù)。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間進(jìn)行了Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并運(yùn)用Design Expert 8.06軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和優(yōu)化。結(jié)果表明：杏鮑菇黃酮類化合物的最佳提取工藝參數(shù)為乙醇濃度80%、料液比1∶40（g/mL）、超聲溫度80℃、超聲時(shí)間100min，此工藝條件下，提取液中杏鮑菇黃酮類化合物提取率為2.92%。

杏鮑菇，黃酮類化合物，超聲波輔助提取，響應(yīng)面分析法

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹側(cè)耳，隸屬于擔(dān)子菌亞門，傘菌目，側(cè)耳科，側(cè)耳屬［1］，是從國(guó)外引進(jìn)開發(fā)的一種藥食兩用珍稀食用菌。杏鮑菇子實(shí)體色澤白、肉肥厚、質(zhì)地脆，具有獨(dú)特的杏仁香味和鮑魚味，素有“平菇王”之稱［2］。杏鮑菇富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素及鈣、鎂、銅、鋅等多種營(yíng)養(yǎng)成分，此外還含有多糖、多肽、酚類、海藻糖等多種活性物質(zhì)，具有抗癌、降血脂、促進(jìn)腸胃消化、防止心血管病等多種功效［3-4］。因杏鮑菇主要是作為食材利用，為此對(duì)其的研究多集中在栽培技術(shù)［5-6］、病蟲害防治［7］、加工工藝及營(yíng)養(yǎng)成分分析［8-9］等方面，有關(guān)其生物活性成分的研究報(bào)道較少，僅見于蛋白、多糖等方面［10］。

黃酮類化合物是普遍存在于植物中的一類生物活性成分。因其具有抗癌、抗氧化、抗衰老、降血脂、抑菌、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性而廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品保健等領(lǐng)域。近年來關(guān)于黃酮類化合物的提取技術(shù)已廣見報(bào)道，如水浸提法、酶解法、超臨界萃取法、微波輔助提取法與超聲波輔助提取法等［11-15］。在這些技術(shù)當(dāng)中，超聲波輔助提取法因操作簡(jiǎn)單、方便、能耗低、無副產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞［16］。基于此，本研究采用超聲輔助法對(duì)杏鮑菇中黃酮類化合物進(jìn)行了提取，并采用響應(yīng)面法（RMS）［17-19］優(yōu)化了提取工藝，旨在為杏鮑菇黃酮類化合物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

杏鮑菇由山西侯臨農(nóng)業(yè)有限公司提供，洗凈、切片、烘干、粉碎后裝于密封袋中備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

FW100型高速萬能粉碎機(jī)天津市泰斯特儀器有限公司；101-3BS型電熱鼓風(fēng)干燥箱金壇市榮華儀器制造有限公司；KQ-500E型超聲波清洗器（功率200W） 昆山市超聲儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；722s可見分光光度計(jì)上海菁華科技儀器有限公司；電子天平（max210g，d= 0.1mg） 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1杏鮑菇黃酮類化合物提取工藝流程［20］杏鮑菇→干燥→粉碎→過篩→稱量→料液混勻→超聲波處理→過濾→離心分離→取上清液測(cè)含量

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與杏鮑菇黃酮類化合物含量測(cè)定精確稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用70%的乙醇溶解并定容至100mL，使其濃度為100μg/mL。將蘆丁溶液用70%乙醇稀釋成0、20、40、60、80、100μg/mL，各取1mL于10mL帶塞比色管中，加70%乙醇1mL，加5%NaNO2溶液0.3mL，搖勻，靜置6min，然后加10%的Al（NO3）3溶液0.3mL，搖勻，靜置6min，再加4%NaOH溶液2mL，蒸餾水定容至5mL，搖勻靜置15min后，以加入蘆丁溶液0mL的比色管作為參比，于510nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度A。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.0026x-0.0019，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。

杏鮑菇黃酮類化合物含量測(cè)定采取硝酸鋁顯色法［21］，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出杏鮑菇黃酮類化合物含量。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行響應(yīng)面分析之前，先通過單因素實(shí)驗(yàn)確定不同因素的實(shí)驗(yàn)水平。分別考察乙醇濃度、料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間四個(gè)因素對(duì)超聲波輔助提取效果的影響，以杏鮑菇黃酮類化合物提取率作為考察指標(biāo)。

1.2.3.1不同乙醇濃度對(duì)杏鮑菇黃酮類化合物提取率的影響準(zhǔn)確稱取杏鮑菇粉末5份，每份1.00g，設(shè)定超聲溫度60℃，料液比1∶30，超聲時(shí)間60min時(shí)，考察不同乙醇濃度（40%～90%）對(duì)杏鮑菇黃酮類化合物提取率的影響。

1.2.3.2不同料液比對(duì)杏鮑菇黃酮類化合物提取率的影響準(zhǔn)確稱取杏鮑菇粉末5份，每份1.00g，設(shè)定超聲溫度為60℃，乙醇濃度70%，超聲時(shí)間60min時(shí)，考察不同料液比（1∶10～1∶60）對(duì)杏鮑菇黃酮類化合物提取率的影響。

1.2.3.3不同超聲溫度對(duì)杏鮑菇黃酮類化合物提取率的影響準(zhǔn)確稱取杏鮑菇粉末5份，每份1.00g，設(shè)定乙醇濃度為70%，料液比1∶30，超聲時(shí)間60min時(shí)，考察不同超聲溫度（40～80℃）對(duì)杏鮑菇黃酮類化合物提取率的影響。

1.2.3.4不同超聲時(shí)間對(duì)杏鮑菇黃酮類化合物提取率的影響準(zhǔn)確稱取杏鮑菇粉末5份，每份1.00g，設(shè)定超聲溫度為60℃，乙醇濃度70%，料液比1∶30時(shí)，考察不同的超聲時(shí)間（30～180min）對(duì)杏鮑菇黃酮類化合物提取率的影響。

1.2.4響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選取乙醇濃度、料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間四個(gè)因素與杏鮑菇黃酮類化合物提取率進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表1），得出相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得出優(yōu)化杏鮑菇黃酮類化合物提取工藝參數(shù)，并開展驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。

表1　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1　Experimental variables and levels for the Box-Behnken experimental design

1.2.5杏鮑菇黃酮類化合物提取率計(jì)算

式中，c：線性計(jì)算出杏鮑菇黃酮類化合物的濃度（mg/mL）；v：提取液定容量（mL）；n：稀釋倍數(shù)；m：取樣的質(zhì)量（g）。

1.2.6數(shù)據(jù)處理每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，取平均值，數(shù)據(jù)采用Sigma Plot 10.0軟件和Design Expert 8.06軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

圖1　乙醇濃度對(duì)杏鮑菇黃酮類化合物提取率的影響Fig.1　Effect of ethanol concentration on yield of total flavonoids in Pleurotus eryngii

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1乙醇濃度對(duì)黃酮類化合物提取率的影響由圖1可知，隨著乙醇濃度的增大，杏鮑菇中黃酮類化合物的提取率也相應(yīng)的提高，當(dāng)乙醇濃度大約為80%時(shí)提取率達(dá)到最大，此后隨著乙醇濃度的增大提取率開始下降。分析其原因一方面可能是黃酮類化合物的極性范圍很大，隨著乙醇濃度的變化，溶劑的極性也在改變，根據(jù)相似相溶原理，推測(cè)80%乙醇極性可能與杏鮑菇中黃酮類化合物的極性相似，更有利于化合物的溶出；另一方面，可能是隨著乙醇濃度的增大，一些醇溶性的雜質(zhì)溶出，與黃酮類化合物競(jìng)爭(zhēng)乙醇，導(dǎo)致其提取率的降低。因此，在其他條件確定時(shí)乙醇適宜濃度約為80%。

2.1.2料液比對(duì)黃酮類化合物提取率的影響由圖2可知，料液比在1∶10～1∶40之間，隨著提取劑用量的增大，黃酮類化合物的提取率也隨之增加，提取劑在一定范圍內(nèi)，隨著其量的增加，增大了物料與溶劑的接觸面積，有利于反應(yīng)的充分進(jìn)行及物質(zhì)的溶出。當(dāng)料液比超過1∶50時(shí)，黃酮類化合物的提取率呈明顯的下降趨勢(shì)，推測(cè)其原因是提取劑量過大，材料內(nèi)部與溶劑之間的溶質(zhì)已經(jīng)達(dá)到平衡，材料表面與溶劑之間的濃度差不再是影響黃酮類化合物提取率的主要因素，此時(shí)溶劑溶解的雜質(zhì)量也隨之增多，使得黃酮類化合物提取率下降。因此，在其他條件一定時(shí)，適宜的料液比為1∶40。

圖2　料液比對(duì)杏鮑菇黃酮類化合物提取率的影響Fig.2　Effect of liquid to solid ratio on yield of total flavonoids in Pleurotus eryngii

2.1.3超聲溫度對(duì)黃酮類化合物提取率的影響由圖3可知，隨著溫度的不斷增高，黃酮類化合物的提取率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在70℃時(shí)提取率達(dá)到最大值。分析其原因?yàn)?，在一定溫度范圍?nèi)，隨著溫度的升高分子運(yùn)動(dòng)速度加快和滲透擴(kuò)散能力增強(qiáng)，更有利于物質(zhì)的溶出，但是溫度過高可能會(huì)導(dǎo)致黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)破壞，其提取率有所下降。因此，在其他條件確定時(shí)，黃酮類化合物超聲提取的適宜溫度為70℃。

圖3　超聲溫度對(duì)杏鮑菇黃酮類化合物提取率的影響Fig.3　Effect of ultrasonic treatment temperature on yield of total flavonoids in Pleurotus eryngii

2.1.4超聲時(shí)間對(duì)黃酮類提取率的影響由圖4可知，黃酮類化合物的提取率隨著超聲時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，在90min時(shí)達(dá)到最大，之后隨著時(shí)間的加長(zhǎng)，提取率有所下降。分析其原因可能為一方面提取時(shí)間太長(zhǎng)，導(dǎo)致乙醇揮發(fā)增大，其濃度下降，不利于物質(zhì)的提取。另一方面可能是提取時(shí)間過長(zhǎng)，溫度有所增加，可能造成黃酮類化合物結(jié)構(gòu)的破壞。因此，在其他條件確定時(shí)，適宜的超聲時(shí)間為90min。

圖4　超聲時(shí)間對(duì)杏鮑菇黃酮類化合物提取率的影響Fig.4　Effect of ultrasonic treatment time on yield of total flavonoids in Pleurotus eryngii

2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1二次響應(yīng)面回歸模型的建立響應(yīng)面法優(yōu)化杏鮑菇中黃酮類化合物提取的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

采用Design-Expert 8.06軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，可得到提取條件與黃酮類化合物提取率之間的二次多項(xiàng)式模型為：

Y=2.91+0.013X1-0.069X2+0.064X3+0.047X4-0.015X1X2-0.042X1X3+0.027X1X4+0.015X2X3+0.083X2X4+ 0.05X3X4-0.051X12-0.063X22-0.053X32-0.091X42

2.2.2響應(yīng)面結(jié)果分析為了檢驗(yàn)回歸方程的可靠性，進(jìn)一步確定各影響因素對(duì)黃酮類化合物提取率的影響程度，對(duì)回歸方程進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見表3。

表3為回歸分析結(jié)果，回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)表明，該模型回歸極顯著（p＜0.01）。失擬項(xiàng)p=0.9385＞0.05，意味著其相對(duì)于純誤差是不顯著的，此結(jié)果表明，在被檢測(cè)變量值的任意組合條件下，用模型方程預(yù)測(cè)杏鮑菇黃酮類化合物的提取率都是適合的。方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合程度較好，模型能夠較好地預(yù)測(cè)杏鮑菇黃酮類化合物提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并能較準(zhǔn)確地對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。方差分析還表明，回歸方程一次項(xiàng)X2和X3對(duì)黃酮類化合物的提取率影響極顯著（p＜0.01），X4對(duì)黃酮類化合物提取率影響顯著（p＜0.05）；交互項(xiàng)X2X4影響顯著（p＜0.05），其余不顯著；二次項(xiàng)X42達(dá)到極顯著（p＜0.01）水平，X22達(dá)到顯著（p＜0.05）水平，其余不顯著。進(jìn)一步表明各因素的交互作用對(duì)黃酮類化合物的提取存在影響，而不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。另外，由F值可得到各因素的主效應(yīng)關(guān)系為：X2（料液比）＞X3（溫度）＞X4（時(shí)間）＞X1（乙醇濃度）。

2.2.3響應(yīng)面圖形分析由以上方差分析表可知，本實(shí)驗(yàn)所建立的數(shù)學(xué)模型中，僅有X2X4（料液比與超聲時(shí)間）的交互作用影響顯著，簡(jiǎn)單的一次線性方程難以對(duì)其進(jìn)行解析，故進(jìn)一步采用X2與X4響應(yīng)面圖形進(jìn)行分析（圖5），其余交互項(xiàng)均不顯著，故不再列出。響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各因素構(gòu)成的三維空間曲面圖［22］，在其他兩因素固定不變的情況下，可直觀的反映交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響。響應(yīng)曲面越陡峭，表明操作條件的改變對(duì)響應(yīng)值的影響越大；相反曲面坡度越平緩，表明響應(yīng)值對(duì)于操作條件的改變?cè)讲幻舾小?/p>

表2　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　Design and results of the Box-Behnken experiments

表3　回歸方程方差分析表Table 3　Analysis results of regression and variance

圖5　超聲時(shí)間和料液比對(duì)黃酮類化合物提取率的交互影響Fig.5　Effect of ultrasonic treatment time and liquid to solid ratio on yield of total flavonoids

由圖5可以看出，響應(yīng)面為開口向下的突出橢圓形曲面，當(dāng)料液比一定時(shí)，黃酮類化合物提取率隨著超聲時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí)，黃酮類化合物提取率也隨著料液比的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；表明超聲時(shí)間過長(zhǎng)或過短、料液比過大或過小都不利于杏鮑菇中黃酮類化合物的提取。另外等高線呈橢圓形，也說明超聲時(shí)間與料液比交互作用顯著，等高線沿料液比軸向較超聲時(shí)間軸向密集，說明料液比對(duì)杏鮑菇黃酮類化合物提取率的影響比超聲時(shí)間的影響大。

2.2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert 8.06軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，獲得的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度79.1%、料液比1∶38、提取溫度78.4℃、提取時(shí)間101.7min，考慮到實(shí)際操作的可行性，將最佳提取工藝參數(shù)修正為乙醇濃度80%、料液比1∶40、提取溫度80℃、提取時(shí)間100min。此外，在最佳提取條件下經(jīng)3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得杏鮑菇的平均提取率為2.92%，與模型預(yù)測(cè)值2.95%相近。說明運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法獲得提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3　結(jié)論

杏鮑菇中含有豐富的黃酮類化合物，具有很好的食用、藥用價(jià)值，具有一定的開發(fā)利用前景，而超聲波輔助提取具有操作簡(jiǎn)便，能耗低等優(yōu)點(diǎn)，利用其產(chǎn)生的“空穴作用”，加速黃酮類化合物的溶出與擴(kuò)散。本文通過響應(yīng)面分析得出影響黃酮類化合物提取率的主次因素為：X2（料液比）＞X3（溫度）＞X4（時(shí)間）＞X1（乙醇濃度）。通過回歸方程優(yōu)化得到杏鮑菇中黃酮類化合物的最佳提取工藝為乙醇濃度80%、料液比1∶40、提取溫度80℃、提取時(shí)間100min，此條件下，杏鮑菇中黃酮類化合物提取率為2.92%。本研究結(jié)果為杏鮑菇黃酮類化合物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

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Optimized ultrasonic-assisted extraction process of flavonoids from Pleurotus eryngii by response surface methodology

SUN Qiong，ZHANG Zhi-feng，LI Yue-mei*
（College of Life Science，Shanxi Normal University，Linfen 041000，China）

In this study，Pleurotus eryngii being used as the material，flavonoids was extracted through ultrasonicassisted method.Response surface method was applied to obtain the optimum extracting conditions for flavonoids from Pleurotus eryngii.The effect of ethanol concentration，liquid-solid ratio，ultrasonic time and temperature on the yield of flavonoids were investigated by single factor experiments.Subsequently，the Box-Behnken center combination experimental design was used to investigate the effect of four factors on the yield of flavonoids extraction.The optimum combination was obtained by design expert 8.06 and response surface analysis.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows:ethanol concentration 80%，liquid-solid ration 1∶40（g/mL），ultrasonic temperature 80℃，ultrasonic time 100min.Under the above optimized conditions，the yield of flavonoids was 2.92%.

Pleurotus eryngii；flavonoids；ultrasonic-assisted extraction；response surface method

TS201.1

B

1002-0306（2015）10-0264-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.047

2014－10－08

孫瓊（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食用菌栽培及生理生化研究。

李月梅（1962-），女，碩士，教授，研究方向：食用菌栽培及資源開發(fā)利用。

山西省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（20120311020-4）。