一株好氧反硝化-異養(yǎng)硝化菌的篩選及脫氮特性研究

連紅民 邱忠平 何昆明 周文秀

（西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031）

一株好氧反硝化-異養(yǎng)硝化菌的篩選及脫氮特性研究

連紅民 邱忠平 何昆明 周文秀

（西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031）

針對滲濾液中硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮難以轉(zhuǎn)化的問題，從好氧生物反應(yīng)器填埋場中篩選出一株好氧反硝化菌-異養(yǎng)硝化菌HN，初步鑒定該菌為假單胞菌（Pseudomonas）。通過對不同氮源的生物轉(zhuǎn)化作用研究了HN的脫氮特性，并對其脫氮條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，在有氧條件下，以硝酸鉀為唯一氮源，HN在96 h時(shí)對硝酸鹽氮的去除率達(dá)到95.44%；以硫酸銨為唯一氮源時(shí)，HN在60 h時(shí)對氨氮的去除率達(dá)到85.14%；當(dāng)碳源為乙醇，碳氮比為7∶1，初始pH為7.5，溫度為35℃，接種量為10%時(shí)，菌株HN脫氮效率最高。

生物脫氮；好氧反硝化；異養(yǎng)硝化；假單胞菌

滲濾液是垃圾填埋過程中產(chǎn)生的廢水，具有化學(xué)需氧量（Chemical oxygen demand，COD）高，氨氮濃度高的特點(diǎn)［1］，但其生化需氧量（Biochemical oxygen demand，BOD）與總氮（Total nitrogen，TN）的比值較低，造成反硝化難以進(jìn)行、硝酸鹽氮累積、TN去除率低的問題［2］。生物脫氮法具有高效、安全、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，是目前污水脫氮最常用的技術(shù)。但傳統(tǒng)的生物脫氮過程是由相互獨(dú)立的好氧硝化與厭氧反硝化構(gòu)成，兩個(gè)反應(yīng)階段的作用菌群及環(huán)境要求各異，造成脫氮工藝復(fù)雜，在一定程度上限制了生物脫氮的應(yīng)用［3］。好氧反硝化是微生物在有氧條件下，利用氧和硝酸鹽或亞硝酸鹽為電子受體，將硝酸鹽和亞硝酸鹽還原為氣態(tài)氮氧化物的過程［4，5］。與傳統(tǒng)的厭氧反硝化相比，好氧反硝化使硝化/反硝化在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行，可以大大減少占地面積和建設(shè)資金，縮短處理周期；同時(shí)，在運(yùn)行過程中不需補(bǔ)充碳源和調(diào)節(jié)pH，節(jié)約了成本［6］。一些好氧反硝化菌同時(shí)具有異養(yǎng)硝化的性能［7］，這個(gè)發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步豐富了同步硝化反硝化理論，為反應(yīng)器中的同步硝化反硝化提供了可能。

好氧反硝化菌在20世紀(jì)80年代首次被發(fā)現(xiàn)［8］，關(guān)于好氧反硝化菌的篩選、鑒定與反硝化特性的研究，科研人員已有諸多嘗試［9-11］，但是針對滲濾液中氮素轉(zhuǎn)化的好氧反硝化菌的研究還鮮見報(bào)道。本研究從好氧生物反應(yīng)器填埋場中篩出一株好氧反硝化菌，對其初步鑒定后，研究該菌的好氧反硝化性能與異養(yǎng)硝化性能，并優(yōu)化脫氮條件，旨在為滲濾液生物脫氮提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 含菌樣品 含菌樣品取自課題組填埋5個(gè)月好氧生物反應(yīng)器填埋場內(nèi)的填埋垃圾。

1.1.2 培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏1.0 g，蛋白胨5.0 g，KNO31.0 g，蒸餾水1 000 mL。

馴化培養(yǎng)基：檸檬酸三鈉5.0 g，KNO31.2 g，MgSO4·7H2O 0.2g，KH2PO41.0 g，K2HPO43.0 g，NaCl 0.5 g。

溴百里香酚藍(lán)（BTB）初篩培養(yǎng)基：瓊脂20 g，KNO31 g，KH2PO41 g，F(xiàn)eCl2·6H2O 0.5 g，CaCl2·7H2O 0.2 g，MgSO4·7H2O 1 g，琥珀酸鈉8.5 g，BTB（1%乙醇溶液）1 mL，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH7.0-7.3，121℃滅菌20 min。

反硝化培養(yǎng)基：KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eCl20.05 g，K2HPO41 g，KNO31 g，碳源、氮源可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選與初步鑒定 使用QYC-200型全溫振蕩搖床（上海福碼實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司），通過菌體對數(shù)生長期轉(zhuǎn)接以及逐漸增加培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)基比例的方式進(jìn)行富集馴化。菌株的形態(tài)試驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)［12］進(jìn)行。生理生化鑒定使用細(xì)菌生理生化鑒定試劑盒，按照操作說明進(jìn)行鑒定，結(jié)果根據(jù)文獻(xiàn)［13］進(jìn)行分析。

1.2.2 菌株脫氮特性研究

1.2.2.1 好氧反硝化特性 保存的菌種在反硝化培養(yǎng)基中活化1 d后，以5%的接種量接種到裝有100 mL反硝化培養(yǎng)基（以硝酸鉀為唯一氮源）的250 mL錐形瓶中，在恒溫?fù)u床中進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)定溫度30℃，轉(zhuǎn)速200 r/min。每隔8 h取一次樣，測定培養(yǎng)液中的pH、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮及總氮濃度，至反應(yīng)穩(wěn)定。以不接種的液體培養(yǎng)基為空白對照，并設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2 菌株的異養(yǎng)硝化特性 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的一個(gè)特征就是pH會先降低后升高。在異養(yǎng)硝化階段，菌株利用氨氮生成硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮，同時(shí)產(chǎn)酸；好氧反硝化將硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化成氣體排出，完成脫氮反應(yīng)，同時(shí)這是一個(gè)產(chǎn)堿過程，可以中和異養(yǎng)硝化過程中產(chǎn)生的酸，使pH保持相對穩(wěn)定［14］。

以硫酸銨為唯一氮源，菌種活化1 d后，以5%的接種量接種到100 mL硫酸銨培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床中進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)定溫度30℃，轉(zhuǎn)速200 r/min。每隔一段時(shí)間檢測一次培養(yǎng)液中的pH、氨氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮濃度，至硫酸銨濃度穩(wěn)定。以不接種的液體培養(yǎng)基為空白對照，并設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 菌株最佳脫氮條件的研究 選擇對菌株生長和脫氮影響比較顯著的碳源、碳氮比、初始pH、溫度和接種量為單因素變量，對HN菌株脫氮條件進(jìn)行優(yōu)化。將菌種活化1 d后，接種到單因素變量培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后測定硝酸鹽氮濃度和OD600。

1.2.3.1 碳源 反硝化實(shí)質(zhì)上是氮的還原［15］，碳源作為電子供體。分別以無水乙醇、三水合乙酸鈉、琥珀酸鈉、蔗糖、葡萄糖為唯一碳源，測定24 h后培養(yǎng)基中的硝酸鹽氮濃度以及OD600。

1.2.3.2 碳氮比 碳氮比主要影響細(xì)菌在生長與合成之間的關(guān)系，對細(xì)菌的代謝活動影響很大［16］。設(shè)置碳氮比為1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、10∶1、12∶1，測定24 h后培養(yǎng)基中的硝酸鹽氮濃度以及OD600。

1.2.3.3 初始pH pH能夠?qū)w內(nèi)酶活性產(chǎn)生不同影響，改變細(xì)胞膜上的電荷，影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，甚至能夠改變有害物質(zhì)對生物體的毒性［17］。設(shè)定初始pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，測定24 h后培養(yǎng)基中的硝酸鹽氮濃度以及OD600。

1.2.3.4 溫度 溫度影響酶的活性。設(shè)定20℃、25℃、30℃、35℃和40℃五個(gè)溫度梯度，測定24 h后培養(yǎng)基中的硝酸鹽氮濃度以及OD600。

1.2.3.5 接種量 在環(huán)境中能源一定時(shí)，接種量可以通過菌群數(shù)量大小來對微生物的生長及生命活動產(chǎn)生影響。按1%、5%、10%、15%和20%五種不同的接種量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定24 h后培養(yǎng)基中的硝酸鹽氮濃度以及OD600。

1.2.3.6 優(yōu)化后菌株的脫氮效率 根據(jù)之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以無水乙醇為碳源，硝酸鉀為唯一氮源，碳氮比設(shè)為7∶1，初始pH為7.5，培養(yǎng)溫度35℃，接種量為10%，考察菌種對硝酸鹽氮的去除效率。

1.2.4 分析方法 NO3-N濃度的測定采用酚二磺酸分光光度法，NO2-N濃度的測定采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法，氨氮濃度的測定采用納氏試劑分光光度計(jì)法，總氮采用過氧化鉀氧化-紫外分光光度法，菌體生長吸光度（OD600）采用比濁法測定（用721可見分光光度計(jì)在光密度為600 nm處測定菌液吸光度值）。

2 結(jié)果

2.1 菌株的篩選與初步鑒定

在BTB固體培養(yǎng)基上劃線，反硝化菌使pH升高，培養(yǎng)基變藍(lán)色，如圖1所示。挑選有藍(lán)色反應(yīng)的菌落進(jìn)一步劃線篩分，最終篩出1株具有好氧反硝化能力的單菌，編號為HN。

圖1 不同時(shí)期BTB培養(yǎng)基的顏色

菌株HN在液體反硝化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，培養(yǎng)基中有綠色熒光物質(zhì)產(chǎn)生；菌落形態(tài)：黃白色，圓形，半透明，表面光滑，邊緣不整齊；革蘭氏染色陰性，短桿狀。生理生化反應(yīng)：氧化酶實(shí)驗(yàn)陽性；葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）實(shí)驗(yàn)為有氧氧化，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；精氨酸雙水解酶、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽、乙酰胺均為陽性；蔗糖、麥芽糖、木糖、DNA實(shí)驗(yàn)為陰性；不液化明膠，不水解淀粉。根據(jù)上述形態(tài)學(xué)特征和生理生化反應(yīng)，初步鑒定HN為假單胞菌（Pseudonomas sp.），命名為Pseudonomas HN。

2.2 菌株脫氮特性研究

2.2.1 好氧反硝化特性 圖2顯示，在實(shí)驗(yàn)開始的12 h內(nèi)，菌株處于適應(yīng)期，反硝化酶活性很低；亞硝酸鹽氮有一定積累，pH從6升高到7.5，表明HN最先產(chǎn)生硝酸鹽氮還原酶，將硝酸鹽氮還原成亞硝酸鹽氮，使pH升高。12-60 h之間，總氮和硝酸鹽氮濃度快速降低，分別從157 mg/L和117 mg/L降低到20.6 mg/L和16.3 mg/L，同時(shí)，亞硝酸鹽氮濃度保持穩(wěn)定水平，pH穩(wěn)定在7.5。60 h后，總氮和硝酸鹽氮濃度下降緩慢，到96 h時(shí)分別穩(wěn)定在9.6 mg/L和6.7 mg/L，去除率分別達(dá)到94.11%和95.44%。

圖2 以硝酸鉀為唯一氮源時(shí)HN的好氧反硝化特性

2.2.2 菌株的異養(yǎng)硝化特性 圖3顯示，HN對氨氮的轉(zhuǎn)化過程可以概括為兩個(gè)階段：0-24 h內(nèi)是硝化階段，氨氮濃度迅速降低，從172 mg/L降低到29.6 mg/L，去除率為82.79%；硝酸鹽氮在24 h時(shí)積累到最大量7.66 mg/L，pH下降，到最低值6.5，有很少的亞硝酸鹽氮積累。24 h以后是反硝化階段，氨氮去除速度變慢并趨于穩(wěn)定，最終濃度為25.5 mg/L，去除率為85.17%；硝酸鹽氮濃度下降至最終消失，同時(shí)亞硝酸鹽氮有一定積累，pH升高，抑制了硝化反應(yīng)的進(jìn)行。

2.3 菌株最佳脫氮條件的研究

2.3.1 碳源 圖4顯示，在以無水乙醇和琥珀酸鈉為碳源的培養(yǎng)基中，HN生長情況最好，OD600達(dá)到0.876，硝酸鹽氮的去除率也最高，達(dá)到了99%；而在三水合乙酸鈉為碳源的培養(yǎng)基中，HN生長緩慢，OD600只有0.005，對硝酸鹽氮的去除率最低，為38.5%。表明碳源可以通過影響菌的生長來影響其反硝化效率，HN的最適碳源為無水乙醇。

圖3 以硫酸銨為唯一氮源時(shí)HN的異養(yǎng)硝化特性

圖4 碳源對HN菌株生長和反硝化效率的影響

2.3.2 碳氮比 圖5顯示，經(jīng)過24 h培養(yǎng)，碳氮比為7時(shí)，HN的生長狀況最好，OD600為0.928，脫氮效率也最高，達(dá)到99.5%。碳氮比為1時(shí)，碳源提供的能量不足，限制了菌株的生長，OD600只有0.395，脫氮率只有47.2%；碳氮比為12時(shí)，由于乙醇對微生物有毒害作用，菌株的生長狀況反而變差，OD600為0.705，脫氮效率變低，為90%。綜合考慮，選擇7∶1為最佳碳氮比。

圖5 碳氮比對HN菌株生長和反硝化效率的影響

2.3.3 初始pH 圖6顯示，經(jīng)過24 h培養(yǎng)，初始pH為7.5時(shí)，HN的生長狀況最好，OD600為0.94，硝酸鹽氮去除率達(dá)到了100%；初始pH在6-7之間時(shí)，HN的生長狀況都很好，OD600在0.90左右，脫氮效率都達(dá)到了98%以上，表明在偏酸的環(huán)境中，HN可以通過自身的反硝化產(chǎn)堿調(diào)節(jié)環(huán)境pH，使pH維持在中性偏堿；當(dāng)初始pH調(diào)節(jié)到8時(shí)，HN的生長和脫氮都受到了很大的抑制，OD600只有0.018，脫氮率降到了14.7%。綜合考慮，選擇pH7為HN的最適初始pH。

圖6 初始pH對HN菌株生長和反硝化效率的影響

圖7 溫度對HN菌株生長和反硝化效率的影響

2.3.4 溫度 圖7顯示，溫度為35℃時(shí)，HN菌株的生長狀況最好，OD600為0.941，對硝酸鹽氮的去除率也最高，達(dá)到了96.6%。溫度過高或過低時(shí)都會影響菌體的生長狀況，20℃時(shí)脫氮率為38.3%，40℃時(shí)的脫氮率為68%。

2.3.5 接種量 圖8顯示，在1%-10%的接種范圍范圍內(nèi)，接種量越大，菌液濃度越高，其反硝化性能越強(qiáng)，10%接種量時(shí)，OD600和脫氮率均最高，分別為0.915，97.7%。當(dāng)接種量超過10%之后，菌株的脫氮率下降到97.2%；接種量超過15%時(shí)，菌液濃度和硝酸鹽氮的去除率均有較為明顯的下降，OD600為0.903，脫氮率為95.5%。推測原因是培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)無法滿足全部菌體的生長，導(dǎo)致細(xì)菌的反硝化性能無法發(fā)揮到最佳狀態(tài)。綜上所述，HN菌株的最佳接種量為10%。

圖8 接種量對HN菌株生長和反硝化效率的影響

2.3.6 優(yōu)化后菌株的脫氮效率 圖9顯示，實(shí)驗(yàn)開始后16 h時(shí)，硝酸鹽氮濃度從138 mg/L降低至35.1 mg/L，去除率達(dá)到了74.2%，亞硝酸鹽氮濃度為5.12 mg/L。到48 h時(shí)，硝酸鹽氮被完全轉(zhuǎn)化，亞硝酸鹽氮也只有少量積累，有1.46 mg/L。說明在優(yōu)化條件下，菌株適應(yīng)期更短，且對硝酸鹽氮的去除能力更強(qiáng)。

圖9 優(yōu)化后菌株的反硝化效率

3 討論

在已有報(bào)道中，好氧反硝化菌主要存在于副球菌屬（Paracoccus）、假單胞菌屬（Psuedomonas）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）和芽孢桿菌屬（Bacillus）中［18］，其中假單胞菌屬包括施氏假單胞菌［19］、產(chǎn)堿假單胞菌［20］及惡臭假單胞菌［21］。本研究所得菌株初步鑒定為假單胞菌屬的熒光假單胞菌，接下來通過分子鑒定進(jìn)一步確認(rèn)后，對研究好氧反硝化菌的生態(tài)學(xué)有一定參考價(jià)值。已報(bào)道菌株大多分離自活性污泥、農(nóng)田土壤以及生活污水，在較低的氨氮或硝酸鹽氮濃度下對總氮有較好的去除率。陳茂霞等［22］從活性污泥中篩選到一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌，以氨氮、亞硝氮、硝氮為唯一氮源，當(dāng)濃度為150 mg/L時(shí)，24 h總氮去除率分別為77.71%、53.34%和56.80%。而HN分離自生物反應(yīng)器填埋場，對滲濾液有天然親和力，結(jié)果表明，HN在氨氮、硝氮濃度較低時(shí)的脫氮表現(xiàn)良好，下一步可以將HN添加到滲濾液處理工藝中，檢驗(yàn)其對高濃度氨氮和硝氮的去除能力。

好氧反硝化菌使硝化反硝化能夠在同一單元內(nèi)實(shí)現(xiàn)，研究人員還發(fā)現(xiàn)，即使在單一微生物體內(nèi)也能完成將氨氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)產(chǎn)物的過程。Richardson等［23］研究了同步異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的脫氮機(jī)理：菌體內(nèi)有兩種酶，一種是氨單加氧酶（AMO）和羥胺氧化鎂（HAO），分別催化氨氮氧化為羥胺、羥胺轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽的過程；另一種是周質(zhì)硝酸鹽還原酶類（NAP），可以把硝酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛猁}，最終轉(zhuǎn)化為氣態(tài)產(chǎn)物。結(jié)果顯示，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化過程中pH先降低后升高：菌株首先利用氨氮生成硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮，同時(shí)產(chǎn)酸；硝酸鹽氮經(jīng)過反硝化過程轉(zhuǎn)化成氣體排出，同時(shí)產(chǎn)堿，使pH保持相對穩(wěn)定，這在一定程度上驗(yàn)證了異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的脫氮機(jī)理。

4 結(jié)論

從好氧生物反應(yīng)器填埋場的填埋垃圾中分離得到一株具有好氧反硝化能力的菌株，初步鑒定為假單胞菌（Pseudonomas sp.），命名為PseudonomasHN。菌株HN在以硝酸鉀為唯一氮源時(shí)，對硝酸鹽氮去除率達(dá)到了95.4%，pH穩(wěn)定在7.5，有少量亞硝酸鹽氮積累；以硫酸銨為唯一氮源時(shí)，對氨氮去除率達(dá)到了85.2%，pH先降低到6.5，再升高，最后穩(wěn)定在7.5，有少量亞硝酸鹽氮的積累。表明菌株HN具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化特性。當(dāng)碳源為乙醇，碳氮比為7∶1，初始pH為7.5，溫度為35℃，接種量為10%時(shí)，菌株HN脫氮效率最高，在48 h內(nèi)對硝酸鹽氮的去除率達(dá)到100%。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Screening and Denitrification Characteristics of an Aerobic Denitrifying-Heterotrophic Nitrification Bacterium

Lian Hongmin Qiu Zhongping He Kunming Zhou Wenxiu
（School of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031）

Aiming at the fact that the degradation of NO3-N and NO2-N in leachate is difficult， an aerobic denitrifying bacterium HN，preliminary identified as Pseudomonas， was isolated from an aerobic biological reactor landfill. Based on its degradation capacities to different nitrogen sources， we studied the denitrification characteristics of HN and optimized the conditions for denitrification. The results showed that under aerobic conditions and potassium nitrate as sole nitrogen source， the removal efficiency of nitrogen in nitrate was up to 95.44% at 96 h；when using ammonium sulfate as sole nitrogen source， HN could remove 85.14% nitrogen in ammonia at 60 h；when the carbon source was ethanol， C/N was 7∶1， initial pH was 7.5， the temperature was 35℃ and inoculation amount was 10%， HN had the highest removal efficiency.

biological denitrification；aerobic denitrification；heterotrophic nitrification；Pseudomonas

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.021

2014-09-19

四川省科技支撐計(jì)劃（2015NZ0097），2015年研究生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)實(shí)踐項(xiàng)目（YC201410225），2014年西南交通大學(xué)國創(chuàng)項(xiàng)目（201410613055）

連紅民，男，碩士研究生，研究方向：環(huán)境生物技術(shù)；E-mail：leehon20085132@163.com

邱忠平，女，博士，副教授，研究方向：環(huán)境生物技術(shù)；E-mail：zhpqiu@sina.com