利用實(shí)時(shí)定量PCR快速檢測冷鮮豬肉新鮮度指標(biāo)的方法研究

宋艷敏石麗敏徐瑗聰許文濤，3黃嵐梁志宏

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院，北京 100083；3.食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

利用實(shí)時(shí)定量PCR快速檢測冷鮮豬肉新鮮度指標(biāo)的方法研究

宋艷敏1石麗敏1徐瑗聰1許文濤1，3黃嵐2梁志宏1

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院，北京 100083；3.食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

目前冷鮮豬肉新鮮度指標(biāo)檢測繁瑣，探索快速檢測冷鮮豬肉新鮮度指標(biāo)新技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。利用國標(biāo)法檢測發(fā)性鹽基氮（Total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量，平板培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別檢測腐敗微生物數(shù)量。結(jié)果顯示，冷鮮豬肉在4℃條件下，隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長，微生物的菌落總數(shù)和TVB-N逐漸增加且呈線性相關(guān)，與豬肉品的腐敗程度呈正相關(guān)；丙酮-氯仿法提取的細(xì)菌基因組條帶清晰，提取效果好；基于SYBER GreenⅠ的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測的菌落數(shù)量與平板培養(yǎng)測得菌落總數(shù)利用單因素方差分析結(jié)果沒有顯著性差異（P=0.7190），一致性較好；實(shí)時(shí)定量PCR方法縮短了檢測時(shí)間，提高了檢測靈敏度。微生物是冷鮮豬肉新鮮度評價(jià)的重要指標(biāo)，實(shí)時(shí)定量PCR可以作為一種快速高效檢測冷鮮豬肉新鮮度指標(biāo)的新技術(shù)。

冷鮮豬肉；實(shí)時(shí)定量PCR；微生物；TVB-N

冷鮮肉又稱冷卻肉，是指在屠宰、加工和銷售過程中一直處于4℃低溫而不凍結(jié)的肉，目前，冷鏈銷售是一種國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的生鮮肉類銷售模式［1］。由于冷鮮肉的貨架期較短，各地儲(chǔ)藏銷售冷鏈系統(tǒng)參差不齊，所以對冷鮮肉的安全檢測和新鮮度評價(jià)就不可或缺。

根據(jù)我國對冷鮮肉的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定［2］，肉的新鮮度評價(jià)主要采用感官標(biāo)準(zhǔn)、微生物和理化標(biāo)準(zhǔn)相結(jié)合的方法。但由于其主觀因素較大、耗時(shí)耗力、檢測成本較高等缺點(diǎn)，所以專家們在不斷探索快速無損檢測方法［3］。2009年畢松等［4］通過分析細(xì)菌菌斑變化與揮發(fā)性鹽基氮（Total Volatile Basic Nitrogen，TVB-N）間的關(guān)系來檢測肉的新鮮度；2012年王麗等［5］運(yùn)用近紅外光譜技術(shù)快速無損地檢測豬肉的新鮮度；2012年Tian等［6］利用電子鼻分析檢測豬肉的新鮮度，研究中建立主要成分分析（Principal component analysis，PCA）模型并得出結(jié)果：當(dāng)豬肉中的TVB-N ≤ 15 mg/100 g 或細(xì)菌總數(shù)≤ 106CFU/g為新鮮肉；當(dāng)TVB-N≥15 mg/100 g或細(xì)菌總數(shù)≥106CFU/g視為腐敗肉。此外，還有電子舌、超生波技術(shù)、計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)［7］等。微生物是導(dǎo)致冷鮮肉腐敗變質(zhì)的因素之一，主要有腐敗微生物和病原微生物兩種，其中假單胞菌是冷鮮豬肉的主要致腐菌［8，9］。

傳統(tǒng)微生物檢測方法操作繁瑣，測量周期長，在實(shí)際應(yīng)用中有一定局限性；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、操作簡單、速度快等特點(diǎn)［10］。但是普通PCR只能定性不能定量檢測，而實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)可定量檢測微生物，這種技術(shù)不需要瓊脂糖凝膠電泳，不僅縮短了檢測時(shí)間，而且簡化了操作步驟，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。但實(shí)時(shí)定量PCR在冷鮮豬肉新鮮度指標(biāo)檢測方面的研究尚少。本研究通過分析細(xì)菌總數(shù)和TVB-N間的關(guān)系，旨在探索熒光實(shí)時(shí)定量PCR法作為一種快速靈敏的檢測手段在冷鮮豬肉細(xì)菌總數(shù)的檢測中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料肉 超市冷鮮肉，4℃用PE塑料保鮮膜封好并避光保藏。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備

1.1.2.1 主要試劑 平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，假單胞菌選擇性培養(yǎng)基（Pseudomonas selective agar，PSA），鹽酸，硼酸，甲基紅和次甲基藍(lán)指示劑，丙酮，無水乙醇，氯仿，異戊醇，所用試劑均為分析純。

1.1.2.2 主要設(shè)備 美國ABI公司的ABI-2720 PCR儀；ABI-7500 熒光定量PCR儀；北京市六一儀器廠的DYCZ-24 D垂直板電泳槽；美國生物基因系統(tǒng)公司的CHEMI- SMART3000 WL/ LC 熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)；北京毅新興業(yè)公司的Midrop100微量分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 肉樣的處理 取豬后臀尖為樣品，將購買的新鮮豬肉直接切割成200 g，隨機(jī)分成9份，用PE塑料保鮮膜封住，貼上標(biāo)簽，在4℃條件下，避光冷藏。每份分為3組，分別在標(biāo)簽上標(biāo)記Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。其中Ⅰ組用于TVB-N的測定，Ⅱ組用于平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)，Ⅲ組用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測。

1.2.2 TVB-N的測定 TVB-N具有揮發(fā)性，在測定時(shí)遇到弱堿性溶液即可以游離而被蒸餾出來，蒸餾出來的氨被H3BO3吸收，生成（NH4）2B4O7。使吸收液從酸性變?yōu)閴A性，混合指示劑由紫色變?yōu)榫G色，然后用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，使混合指示劑再由綠色變?yōu)樗{(lán)綠色即為滴定終點(diǎn)。然后根據(jù)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗量計(jì)算TVB-N含量［11］。

1.2.3 微生物指標(biāo)的檢測 將4℃條件下冷藏的豬肉放置在超凈工作臺(tái)中并在酒精燈火焰上將表面灼燒2-3 s，用高壓滅菌的剪刀隨機(jī)剪取豬肉50 g左右，放入已使用酒精棉消毒的無菌絞肉機(jī)中絞碎2次，無菌稱取25 g轉(zhuǎn)移到裝有225 mL生理鹽水的滅菌三角瓶中，搖勻，必要時(shí)可在漩渦震蕩器上進(jìn)行震蕩混勻，然后對樣品依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取適當(dāng)?shù)奶荻冗M(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，每組3個(gè)平行。細(xì)菌的計(jì)數(shù)按照國標(biāo)進(jìn)行。

1.2.3.1 菌落總數(shù) 參照 GB4789.2-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)》［12］，假單胞桿菌屬需氧型革蘭陰性菌，是腐敗豬肉中的優(yōu)勢菌［9］，另外還有大腸桿菌等需氧菌，所以用平板計(jì)數(shù)法培養(yǎng)。但也存在少量的乳酸菌等厭氧菌，培養(yǎng)時(shí)易鑲嵌在培養(yǎng)基底層或內(nèi)部，均計(jì)入結(jié)果。

1.2.3.2 假單胞桿菌 選用假單胞選擇性培養(yǎng)基（PSA）進(jìn)行平板培養(yǎng)法，并計(jì)數(shù)［13］。

1.2.4 DNA提取方法 丙酮-氯仿快速提取法，參照文獻(xiàn)［14］。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1.2.5.1 提取假單胞菌的DNA 將標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌接種于LB溶液中培養(yǎng)12 h，使其增殖，渾濁可使用提取DNA。提取前將菌液混勻，無菌槍小心吸取1 mL液體于無菌離心管中，8 000 r/min離心10 min，再加入1 mL菌液，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀。

1.2.5.2 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 測定提取DNA濃度，用水稀釋調(diào)整DNA濃度到20 ng/μL，保證CT值在18-30之間，進(jìn)行10倍梯度稀釋4次，得到10倍梯度的樣液。細(xì)菌的16S rRNA 基因具有高度的保守性，不同科、屬、種間的同源性達(dá)97%［15，16］。采用細(xì)菌通用引物usu對提取的DNA樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，總細(xì)菌引物序列［17］為usu-F：5'-AACTGGAGGAAGGTGGGGA-3'；usu-R：5'-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3'。產(chǎn)物片段長度為370 bp，反應(yīng)體系為：2.5×SYBR Green Mix 2 11.25 μL，usu-F（10 μmol/L） 和usu-R（10 μmol/L） 各0.3 μL，模板DNA 5.0 μL，超純水 13.15 μL。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)。

1.2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 以Lg（起始拷貝數(shù)/g）為橫坐標(biāo)，以CT值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 定量PCR檢測 用丙酮氯仿快速提取法提取豬肉中細(xì)菌基因組DNA，-20℃儲(chǔ)藏備用并對肉中提取的DNA進(jìn)行定量檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍可以適當(dāng)調(diào)整模板濃度。將測定的CT值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，即可得到對應(yīng)的DNA的濃度，再計(jì)算得出起始拷貝數(shù)（即初始細(xì)菌總數(shù)）。同時(shí)用國標(biāo)法測定TVB-N含量，每天測一次，3次平行測定，求平均值。

2 結(jié)果

2.1 微生物生長與TVB-N變化之間的關(guān)系

圖1顯示，隨著冷鮮肉儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，TVB-N和菌落總數(shù)均呈現(xiàn)上升趨勢，表明TVB-N和菌落總數(shù)均與豬肉的腐敗程度正相關(guān)。根據(jù)圖2菌落總數(shù)與TVB-N之間的線性關(guān)系可看出，微生物的菌落總數(shù)與TVB-N線性相關(guān)，線性方程式為：y=3.4750x-3.0954，R2=0.9636。

圖1 冷鮮豬肉揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）和菌落總數(shù)的變化

圖2 菌落總數(shù)和TVB-N的關(guān)系

2.2 豬肉中細(xì)菌DNA的提取結(jié)果

圖3中顯示，丙酮-氯仿法提取的冷鮮肉中細(xì)菌DNA條帶清晰，沒有雜條帶，紫外分光光度計(jì)測定的260 nm和280 nm光波下的紫外吸收值為1.754±0.145，提取效果比較好，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 冷鮮豬肉DNA提取結(jié)果

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

熔解曲線是用來驗(yàn)證以SYBR Green Ⅰ為熒光染料的定量PCR擴(kuò)增的特異性，圖4顯示，細(xì)菌通用引物usu擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的熔解曲線峰值為87.98℃，峰型銳利，熔解溫度較為均勻。說明本研究所使用的引物擴(kuò)增產(chǎn)物有較強(qiáng)的特異性。利用已知起始濃度的假單胞桿菌DNA標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)得到有關(guān)CT值與細(xì)菌DNA質(zhì)量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。使用dsDNA copy number calculator軟件，將測得的細(xì)菌DNA質(zhì)量轉(zhuǎn)化為Lg（目的基因拷貝數(shù)/g）得到CT值與Lg（起始拷貝數(shù)/g）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為 CT=-3.372 Lg（起始拷貝數(shù)/ g）+41.000，R2=0.999。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR測定豬肉腐敗過程中DNA含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將冷鮮肉腐敗過程中測得的CT結(jié)果記入表1，實(shí)時(shí)定量PCR得到的熔解曲線和擴(kuò)增曲線，如圖5所示。

表1 CT值（x-±s，n=3）

圖5與表1結(jié)合可以看出，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長CT呈現(xiàn)減小的趨勢，而根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線CT與起始拷貝數(shù)的對數(shù)成負(fù)相關(guān)，可以判斷細(xì)菌DNA起始拷貝數(shù)逐漸增加，并能夠得到細(xì)菌DNA起始拷貝數(shù)的具體數(shù)值，由此看出實(shí)時(shí)定量PCR可以判斷冷鮮肉是趨向腐敗的，同時(shí)與TVB-N和平板法檢測的菌落總數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。

圖5 冷鮮豬肉腐敗過程細(xì)菌DNA的定量檢測結(jié)果

在TVB-N一致的情況下，運(yùn)用SPSS軟件對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析比較兩者間差異，結(jié)果顯示，P=0.7190 ＞＞ 0.05，表明傳統(tǒng)法測得細(xì)菌菌落總數(shù)與實(shí)時(shí)定量PCR方法測得細(xì)菌DNA起始拷貝數(shù)（即為初始菌落數(shù)）之間無顯著性差異，并且兩者在數(shù)量級上一致。

表2 TVB-N的量和Log10（細(xì)菌菌落總數(shù)）、Log10（目的基因拷貝數(shù)/g濕重）（x-±s，n=3）

3 討論

肉品新鮮度通常用TVB-N含量來評價(jià)，TVB-N的產(chǎn)生是指動(dòng)物性產(chǎn)品的蛋白質(zhì)在酶和微生物的作用下分解產(chǎn)生氨和胺類等堿性含氮物質(zhì)，微生物是導(dǎo)致TVB-N產(chǎn)生的因素之一［18］。微生物的增殖是肉品質(zhì)產(chǎn)生安全問題的本質(zhì)因素，微生物侵染肉品后大量繁殖，消耗分解肉中的蛋白質(zhì)、脂類和糖類等營養(yǎng)成分導(dǎo)致的，會(huì)產(chǎn)生不悅風(fēng)味，品質(zhì)下降并可能產(chǎn)毒，對食用者造成危害。Tang等［19］預(yù)測冷鮮豬肉貨架期時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)微生物的數(shù)量達(dá)到107CFU/g時(shí)的豬肉已經(jīng)變成了腐敗肉。但是傳統(tǒng)微生物指標(biāo)檢測方法耗時(shí)長，操作繁瑣，受環(huán)境因素影響較大。而實(shí)時(shí)定量PCR作為一種生物檢測技術(shù)已應(yīng)用到魚肉和牛肉的新鮮度檢測方面［20，21］，該方法檢測速度快，靈敏性高且特異性好，成功克服了傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法的缺點(diǎn)。豬肉同魚肉和牛肉有很多相似之處，它們水分多、營養(yǎng)物質(zhì)豐富，都是一種高度易腐的產(chǎn)品。Margot等［22］和Delibato等［23］用實(shí)時(shí)定量PCR檢測豬肉中沙門氏菌的數(shù)量，結(jié)果精確度高，并且可以確定沙門氏菌檢測限量。Ye等［24］利用反轉(zhuǎn)錄定量PCR檢測冷鮮豬肉中的單增李斯特菌，結(jié)果可以粗略地預(yù)測豬肉的污染程度。

目前研究中利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)僅對牛肉和魚肉等其他肉品的新鮮度進(jìn)行評價(jià)，或只對豬肉中的特定微生物進(jìn)行定性和定量檢測，并沒有對冷鮮豬肉新鮮度指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)。本研究在已有研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步拓展了研究范圍，主要以超市的冷鮮豬肉為研究對象，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測冷鮮肉的細(xì)菌總數(shù)，既達(dá)到了定量的目的又避免了傳統(tǒng)方法繁瑣耗時(shí)的缺點(diǎn)，而且檢測靈敏度高，所以通過實(shí)時(shí)定量PCR方法代替平板培養(yǎng)法對冷鮮豬肉的新鮮度、微生物指標(biāo)進(jìn)行評定是可行的。并且定量PCR技術(shù)可應(yīng)用到未來肉制品及其他方面的檢測中，也可以深入研究確定冷鮮肉新鮮度指標(biāo)的檢測限量。本研究主要針對冷鮮豬肉展開實(shí)驗(yàn)研究，預(yù)實(shí)驗(yàn)中對生產(chǎn)加工單位和超市的冷鮮肉都做了研究，最后考慮到食品安全受眾問題，選擇超市冷鮮肉作為研究材料，在后續(xù)的研究中會(huì)將該方法應(yīng)用到食品生產(chǎn)廠家的安全監(jiān)督檢測中。

4 結(jié)論

本研究驗(yàn)證了微生物菌落總數(shù)與TVB-N呈線性相關(guān)性，因此可以根據(jù)細(xì)菌菌落總數(shù)的數(shù)量級確定判斷冷鮮肉新鮮度。將用傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法測得的菌落總數(shù)與實(shí)時(shí)定量PCR方法得到的初始拷貝數(shù)進(jìn)行對照發(fā)現(xiàn)，在TVB-N相近的條件下，傳統(tǒng)方法測得的細(xì)菌菌落總數(shù)與實(shí)時(shí)定量PCR法測定的初始拷貝數(shù)在數(shù)量級上是一致的。但實(shí)時(shí)定量PCR檢測時(shí)間短，靈敏度高，縮短了實(shí)驗(yàn)周期，降低了實(shí)驗(yàn)成本。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Fast Detection of Freshness of Chilled Pork by Real-time Quantitative PCR

Song Yanmin1Shi Limin1Xu Yuancong1Xu Wentao1，3Huang Lan2Liang Zhihong1
（1. College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083；2. College of Information and Electrical Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083；3. Beijing Food Quality and Safety Laboratory，Beijing 100083）

The current detection techniques for freshness of chilled pork are complex， so exploring fast detection techniques becomes hotspot. In this study Total Volatile Basic Nitrogen（TVB-N）was detected by the method defined in national standard， and Plate Culture Method（PCM）and real-time quantitative PCR were used to count the total amount of microorganisms causing spoilage of chilled pork. With the extension of storage time of the chilled pork at 4℃， the total number of microorganism colony and TVB-N had the linear correlation， and the level of spoilage of chilled pork behaved the positive correlation. The extracted bacterial genome by acetone-chloroform had the clear bands and showed the fine extraction result. Single-factor analysis of variance revealed that there was no significant difference of total number of colony（P=0. 7190）between by real-time quantitative PCR based on SYBER Green I and by counting in PCM， i. e. ， consistency was quite solid. The detection time was reduced by real-time quantitative PCR with higher detection sensitivity. The amount of microorganisms is a crucial index to evaluate the freshness of chilled pork， and real-time quantitative PCR can be a new technology for quickly checking the freshness of chilled pork.

chilled pork；Real-time quantitative PCR；microorganism；total volatile basic nitrogen（TVB-N）

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.013

2014-10-22

國家“863“計(jì)劃項(xiàng)目（2007AA10Z212，2012AA101609-7）

宋艷敏，女，碩士，研究方向：食品微生物；E-mail：songyanminyx@sina.com

梁志宏，女，博士，研究方向：食品微生物及生物脫毒；E-mail：lzh01@cau.edu.cn