• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    利用實(shí)時(shí)定量PCR快速檢測冷鮮豬肉新鮮度指標(biāo)的方法研究

    2015-10-27 01:25:08宋艷敏石麗敏徐瑗聰許文濤3黃嵐梁志宏
    生物技術(shù)通報(bào) 2015年6期
    關(guān)鍵詞:新鮮度拷貝數(shù)鮮肉

    宋艷敏石麗敏徐瑗聰許文濤,3黃嵐梁志宏

    (1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院,北京 100083;3.食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

    利用實(shí)時(shí)定量PCR快速檢測冷鮮豬肉新鮮度指標(biāo)的方法研究

    宋艷敏1石麗敏1徐瑗聰1許文濤1,3黃嵐2梁志宏1

    (1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院,北京 100083;3.食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

    目前冷鮮豬肉新鮮度指標(biāo)檢測繁瑣,探索快速檢測冷鮮豬肉新鮮度指標(biāo)新技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。利用國標(biāo)法檢測發(fā)性鹽基氮(Total volatile basic nitrogen,TVB-N)含量,平板培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別檢測腐敗微生物數(shù)量。結(jié)果顯示,冷鮮豬肉在4℃條件下,隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長,微生物的菌落總數(shù)和TVB-N逐漸增加且呈線性相關(guān),與豬肉品的腐敗程度呈正相關(guān);丙酮-氯仿法提取的細(xì)菌基因組條帶清晰,提取效果好;基于SYBER GreenⅠ的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測的菌落數(shù)量與平板培養(yǎng)測得菌落總數(shù)利用單因素方差分析結(jié)果沒有顯著性差異(P=0.7190),一致性較好;實(shí)時(shí)定量PCR方法縮短了檢測時(shí)間,提高了檢測靈敏度。微生物是冷鮮豬肉新鮮度評價(jià)的重要指標(biāo),實(shí)時(shí)定量PCR可以作為一種快速高效檢測冷鮮豬肉新鮮度指標(biāo)的新技術(shù)。

    冷鮮豬肉;實(shí)時(shí)定量PCR;微生物;TVB-N

    冷鮮肉又稱冷卻肉,是指在屠宰、加工和銷售過程中一直處于4℃低溫而不凍結(jié)的肉,目前,冷鏈銷售是一種國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的生鮮肉類銷售模式[1]。由于冷鮮肉的貨架期較短,各地儲(chǔ)藏銷售冷鏈系統(tǒng)參差不齊,所以對冷鮮肉的安全檢測和新鮮度評價(jià)就不可或缺。

    根據(jù)我國對冷鮮肉的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定[2],肉的新鮮度評價(jià)主要采用感官標(biāo)準(zhǔn)、微生物和理化標(biāo)準(zhǔn)相結(jié)合的方法。但由于其主觀因素較大、耗時(shí)耗力、檢測成本較高等缺點(diǎn),所以專家們在不斷探索快速無損檢測方法[3]。2009年畢松等[4]通過分析細(xì)菌菌斑變化與揮發(fā)性鹽基氮(Total Volatile Basic Nitrogen,TVB-N)間的關(guān)系來檢測肉的新鮮度;2012年王麗等[5]運(yùn)用近紅外光譜技術(shù)快速無損地檢測豬肉的新鮮度;2012年Tian等[6]利用電子鼻分析檢測豬肉的新鮮度,研究中建立主要成分分析(Principal component analysis,PCA)模型并得出結(jié)果:當(dāng)豬肉中的TVB-N ≤ 15 mg/100 g 或細(xì)菌總數(shù)≤ 106CFU/g為新鮮肉;當(dāng)TVB-N≥15 mg/100 g或細(xì)菌總數(shù)≥106CFU/g視為腐敗肉。此外,還有電子舌、超生波技術(shù)、計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)[7]等。微生物是導(dǎo)致冷鮮肉腐敗變質(zhì)的因素之一,主要有腐敗微生物和病原微生物兩種,其中假單胞菌是冷鮮豬肉的主要致腐菌[8,9]。

    傳統(tǒng)微生物檢測方法操作繁瑣,測量周期長,在實(shí)際應(yīng)用中有一定局限性;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、操作簡單、速度快等特點(diǎn)[10]。但是普通PCR只能定性不能定量檢測,而實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)可定量檢測微生物,這種技術(shù)不需要瓊脂糖凝膠電泳,不僅縮短了檢測時(shí)間,而且簡化了操作步驟,具有較高的應(yīng)用價(jià)值。但實(shí)時(shí)定量PCR在冷鮮豬肉新鮮度指標(biāo)檢測方面的研究尚少。本研究通過分析細(xì)菌總數(shù)和TVB-N間的關(guān)系,旨在探索熒光實(shí)時(shí)定量PCR法作為一種快速靈敏的檢測手段在冷鮮豬肉細(xì)菌總數(shù)的檢測中的應(yīng)用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 原料肉 超市冷鮮肉,4℃用PE塑料保鮮膜封好并避光保藏。

    1.1.2 主要試劑與設(shè)備

    1.1.2.1 主要試劑 平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基,假單胞菌選擇性培養(yǎng)基(Pseudomonas selective agar,PSA),鹽酸,硼酸,甲基紅和次甲基藍(lán)指示劑,丙酮,無水乙醇,氯仿,異戊醇,所用試劑均為分析純。

    1.1.2.2 主要設(shè)備 美國ABI公司的ABI-2720 PCR儀;ABI-7500 熒光定量PCR儀;北京市六一儀器廠的DYCZ-24 D垂直板電泳槽;美國生物基因系統(tǒng)公司的CHEMI- SMART3000 WL/ LC 熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng);北京毅新興業(yè)公司的Midrop100微量分光光度計(jì)。

    1.2 方法

    1.2.1 肉樣的處理 取豬后臀尖為樣品,將購買的新鮮豬肉直接切割成200 g,隨機(jī)分成9份,用PE塑料保鮮膜封住,貼上標(biāo)簽,在4℃條件下,避光冷藏。每份分為3組,分別在標(biāo)簽上標(biāo)記Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。其中Ⅰ組用于TVB-N的測定,Ⅱ組用于平板計(jì)數(shù)培養(yǎng),Ⅲ組用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測。

    1.2.2 TVB-N的測定 TVB-N具有揮發(fā)性,在測定時(shí)遇到弱堿性溶液即可以游離而被蒸餾出來,蒸餾出來的氨被H3BO3吸收,生成(NH4)2B4O7。使吸收液從酸性變?yōu)閴A性,混合指示劑由紫色變?yōu)榫G色,然后用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,使混合指示劑再由綠色變?yōu)樗{(lán)綠色即為滴定終點(diǎn)。然后根據(jù)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗量計(jì)算TVB-N含量[11]。

    1.2.3 微生物指標(biāo)的檢測 將4℃條件下冷藏的豬肉放置在超凈工作臺(tái)中并在酒精燈火焰上將表面灼燒2-3 s,用高壓滅菌的剪刀隨機(jī)剪取豬肉50 g左右,放入已使用酒精棉消毒的無菌絞肉機(jī)中絞碎2次,無菌稱取25 g轉(zhuǎn)移到裝有225 mL生理鹽水的滅菌三角瓶中,搖勻,必要時(shí)可在漩渦震蕩器上進(jìn)行震蕩混勻,然后對樣品依次進(jìn)行10倍梯度稀釋,選取適當(dāng)?shù)奶荻冗M(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),每組3個(gè)平行。細(xì)菌的計(jì)數(shù)按照國標(biāo)進(jìn)行。

    1.2.3.1 菌落總數(shù) 參照 GB4789.2-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)》[12],假單胞桿菌屬需氧型革蘭陰性菌,是腐敗豬肉中的優(yōu)勢菌[9],另外還有大腸桿菌等需氧菌,所以用平板計(jì)數(shù)法培養(yǎng)。但也存在少量的乳酸菌等厭氧菌,培養(yǎng)時(shí)易鑲嵌在培養(yǎng)基底層或內(nèi)部,均計(jì)入結(jié)果。

    1.2.3.2 假單胞桿菌 選用假單胞選擇性培養(yǎng)基(PSA)進(jìn)行平板培養(yǎng)法,并計(jì)數(shù)[13]。

    1.2.4 DNA提取方法 丙酮-氯仿快速提取法,參照文獻(xiàn)[14]。

    1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

    1.2.5.1 提取假單胞菌的DNA 將標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌接種于LB溶液中培養(yǎng)12 h,使其增殖,渾濁可使用提取DNA。提取前將菌液混勻,無菌槍小心吸取1 mL液體于無菌離心管中,8 000 r/min離心10 min,再加入1 mL菌液,8 000 r/min離心10 min,收集沉淀。

    1.2.5.2 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 測定提取DNA濃度,用水稀釋調(diào)整DNA濃度到20 ng/μL,保證CT值在18-30之間,進(jìn)行10倍梯度稀釋4次,得到10倍梯度的樣液。細(xì)菌的16S rRNA 基因具有高度的保守性,不同科、屬、種間的同源性達(dá)97%[15,16]。采用細(xì)菌通用引物usu對提取的DNA樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,總細(xì)菌引物序列[17]為usu-F:5'-AACTGGAGGAAGGTGGGGA-3';usu-R:5'-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3'。產(chǎn)物片段長度為370 bp,反應(yīng)體系為:2.5×SYBR Green Mix 2 11.25 μL,usu-F(10 μmol/L) 和usu-R(10 μmol/L) 各0.3 μL,模板DNA 5.0 μL,超純水 13.15 μL。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件為:95℃ 5 min;94℃ 30 s,55℃ 1 min,72℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán)。

    1.2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 以Lg(起始拷貝數(shù)/g)為橫坐標(biāo),以CT值為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.6 定量PCR檢測 用丙酮氯仿快速提取法提取豬肉中細(xì)菌基因組DNA,-20℃儲(chǔ)藏備用并對肉中提取的DNA進(jìn)行定量檢測,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍可以適當(dāng)調(diào)整模板濃度。將測定的CT值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,即可得到對應(yīng)的DNA的濃度,再計(jì)算得出起始拷貝數(shù)(即初始細(xì)菌總數(shù))。同時(shí)用國標(biāo)法測定TVB-N含量,每天測一次,3次平行測定,求平均值。

    2 結(jié)果

    2.1 微生物生長與TVB-N變化之間的關(guān)系

    圖1顯示,隨著冷鮮肉儲(chǔ)藏時(shí)間的延長,TVB-N和菌落總數(shù)均呈現(xiàn)上升趨勢,表明TVB-N和菌落總數(shù)均與豬肉的腐敗程度正相關(guān)。根據(jù)圖2菌落總數(shù)與TVB-N之間的線性關(guān)系可看出,微生物的菌落總數(shù)與TVB-N線性相關(guān),線性方程式為:y=3.4750x-3.0954,R2=0.9636。

    圖1 冷鮮豬肉揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)和菌落總數(shù)的變化

    圖2 菌落總數(shù)和TVB-N的關(guān)系

    2.2 豬肉中細(xì)菌DNA的提取結(jié)果

    圖3中顯示,丙酮-氯仿法提取的冷鮮肉中細(xì)菌DNA條帶清晰,沒有雜條帶,紫外分光光度計(jì)測定的260 nm和280 nm光波下的紫外吸收值為1.754±0.145,提取效果比較好,可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    圖3 冷鮮豬肉DNA提取結(jié)果

    2.3 實(shí)時(shí)定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

    熔解曲線是用來驗(yàn)證以SYBR Green Ⅰ為熒光染料的定量PCR擴(kuò)增的特異性,圖4顯示,細(xì)菌通用引物usu擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的熔解曲線峰值為87.98℃,峰型銳利,熔解溫度較為均勻。說明本研究所使用的引物擴(kuò)增產(chǎn)物有較強(qiáng)的特異性。利用已知起始濃度的假單胞桿菌DNA標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)得到有關(guān)CT值與細(xì)菌DNA質(zhì)量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。使用dsDNA copy number calculator軟件,將測得的細(xì)菌DNA質(zhì)量轉(zhuǎn)化為Lg(目的基因拷貝數(shù)/g)得到CT值與Lg(起始拷貝數(shù)/g)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,曲線方程為 CT=-3.372 Lg(起始拷貝數(shù)/ g)+41.000,R2=0.999。

    圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果

    2.4 實(shí)時(shí)定量PCR測定豬肉腐敗過程中DNA含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    將冷鮮肉腐敗過程中測得的CT結(jié)果記入表1,實(shí)時(shí)定量PCR得到的熔解曲線和擴(kuò)增曲線,如圖5所示。

    表1 CT值(x-±s,n=3)

    圖5與表1結(jié)合可以看出,隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長CT呈現(xiàn)減小的趨勢,而根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線CT與起始拷貝數(shù)的對數(shù)成負(fù)相關(guān),可以判斷細(xì)菌DNA起始拷貝數(shù)逐漸增加,并能夠得到細(xì)菌DNA起始拷貝數(shù)的具體數(shù)值,由此看出實(shí)時(shí)定量PCR可以判斷冷鮮肉是趨向腐敗的,同時(shí)與TVB-N和平板法檢測的菌落總數(shù)進(jìn)行比較,結(jié)果見表2。

    圖5 冷鮮豬肉腐敗過程細(xì)菌DNA的定量檢測結(jié)果

    在TVB-N一致的情況下,運(yùn)用SPSS軟件對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析比較兩者間差異,結(jié)果顯示,P=0.7190 >> 0.05,表明傳統(tǒng)法測得細(xì)菌菌落總數(shù)與實(shí)時(shí)定量PCR方法測得細(xì)菌DNA起始拷貝數(shù)(即為初始菌落數(shù))之間無顯著性差異,并且兩者在數(shù)量級上一致。

    表2 TVB-N的量和Log10(細(xì)菌菌落總數(shù))、Log10(目的基因拷貝數(shù)/g濕重)(x-±s,n=3)

    3 討論

    肉品新鮮度通常用TVB-N含量來評價(jià),TVB-N的產(chǎn)生是指動(dòng)物性產(chǎn)品的蛋白質(zhì)在酶和微生物的作用下分解產(chǎn)生氨和胺類等堿性含氮物質(zhì),微生物是導(dǎo)致TVB-N產(chǎn)生的因素之一[18]。微生物的增殖是肉品質(zhì)產(chǎn)生安全問題的本質(zhì)因素,微生物侵染肉品后大量繁殖,消耗分解肉中的蛋白質(zhì)、脂類和糖類等營養(yǎng)成分導(dǎo)致的,會(huì)產(chǎn)生不悅風(fēng)味,品質(zhì)下降并可能產(chǎn)毒,對食用者造成危害。Tang等[19]預(yù)測冷鮮豬肉貨架期時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)微生物的數(shù)量達(dá)到107CFU/g時(shí)的豬肉已經(jīng)變成了腐敗肉。但是傳統(tǒng)微生物指標(biāo)檢測方法耗時(shí)長,操作繁瑣,受環(huán)境因素影響較大。而實(shí)時(shí)定量PCR作為一種生物檢測技術(shù)已應(yīng)用到魚肉和牛肉的新鮮度檢測方面[20,21],該方法檢測速度快,靈敏性高且特異性好,成功克服了傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法的缺點(diǎn)。豬肉同魚肉和牛肉有很多相似之處,它們水分多、營養(yǎng)物質(zhì)豐富,都是一種高度易腐的產(chǎn)品。Margot等[22]和Delibato等[23]用實(shí)時(shí)定量PCR檢測豬肉中沙門氏菌的數(shù)量,結(jié)果精確度高,并且可以確定沙門氏菌檢測限量。Ye等[24]利用反轉(zhuǎn)錄定量PCR檢測冷鮮豬肉中的單增李斯特菌,結(jié)果可以粗略地預(yù)測豬肉的污染程度。

    目前研究中利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)僅對牛肉和魚肉等其他肉品的新鮮度進(jìn)行評價(jià),或只對豬肉中的特定微生物進(jìn)行定性和定量檢測,并沒有對冷鮮豬肉新鮮度指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)。本研究在已有研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步拓展了研究范圍,主要以超市的冷鮮豬肉為研究對象,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測冷鮮肉的細(xì)菌總數(shù),既達(dá)到了定量的目的又避免了傳統(tǒng)方法繁瑣耗時(shí)的缺點(diǎn),而且檢測靈敏度高,所以通過實(shí)時(shí)定量PCR方法代替平板培養(yǎng)法對冷鮮豬肉的新鮮度、微生物指標(biāo)進(jìn)行評定是可行的。并且定量PCR技術(shù)可應(yīng)用到未來肉制品及其他方面的檢測中,也可以深入研究確定冷鮮肉新鮮度指標(biāo)的檢測限量。本研究主要針對冷鮮豬肉展開實(shí)驗(yàn)研究,預(yù)實(shí)驗(yàn)中對生產(chǎn)加工單位和超市的冷鮮肉都做了研究,最后考慮到食品安全受眾問題,選擇超市冷鮮肉作為研究材料,在后續(xù)的研究中會(huì)將該方法應(yīng)用到食品生產(chǎn)廠家的安全監(jiān)督檢測中。

    4 結(jié)論

    本研究驗(yàn)證了微生物菌落總數(shù)與TVB-N呈線性相關(guān)性,因此可以根據(jù)細(xì)菌菌落總數(shù)的數(shù)量級確定判斷冷鮮肉新鮮度。將用傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法測得的菌落總數(shù)與實(shí)時(shí)定量PCR方法得到的初始拷貝數(shù)進(jìn)行對照發(fā)現(xiàn),在TVB-N相近的條件下,傳統(tǒng)方法測得的細(xì)菌菌落總數(shù)與實(shí)時(shí)定量PCR法測定的初始拷貝數(shù)在數(shù)量級上是一致的。但實(shí)時(shí)定量PCR檢測時(shí)間短,靈敏度高,縮短了實(shí)驗(yàn)周期,降低了實(shí)驗(yàn)成本。

    [1] 石麗敏, 黃嵐, 梁志宏, 等. 冷鮮豬肉的新鮮度評價(jià)研究進(jìn)展[J]. 肉類研究, 2011, 12:40-43.

    [2] 劉蘭圖, 邵秀芝, 李愛珍. 泡菜安全性的研究[J]. 糧油加工,2010(8):168-170.

    [3] 蔣麗施. 肉品新鮮度的檢測方法[J]. 肉類研究, 2011, 25(1):46-49.

    [4]畢松, 郭培源. 基于細(xì)菌菌斑變化的豬肉新鮮度檢測方法研究[J]. 農(nóng)機(jī)化研究, 2009, 31(5):67-71.

    [5]王麗, 劉兆豐, 勵(lì)建榮, 等. 近紅外光譜技術(shù)快速檢測豬肉新鮮度指標(biāo)的方法研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2012, 12(6):159-165.

    [6]Tian XY, Cai Q, Zhang YM. Rapid classification of hairtail fish and pork freshness using an electronic nose based on the PCA method[J]. Sensors, 2011, 12(1):260-277.

    [7]岳燕霞, 李亞麗, 張明玉. 肉新鮮度檢測方法研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊), 2014, 14:76-77, 79.

    [8]張黎利. 冷鮮豬肉中微生物生物模型和檢測方法及其植物精油抗菌包裝的研究[D]. 合肥:合肥工業(yè)大學(xué), 2011.

    [9]Jiang Y, Gao F, Xu XL, et al. Changes in the composition of the bacterial flora on tray-packaged pork during chilled storage analyzed by PCR-DGGE and Real-Time PCR[J]. Journal of Food Science,2011, 76(1):M27-M33.

    [10]馬月萍, 戴思蘭, 馬艷蓉, 等. 熒光定量PCR技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2011(7):37-45.

    [11]SC/T 3032-2007 水產(chǎn)品中揮發(fā)性鹽基氮的測定.

    [12]GB 4789. 2-2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定.

    [13]趙國嬌, 王宏勛, 劉明芹, 等. 冷鮮五花肉中假單胞菌預(yù)測模型的建立與驗(yàn)證[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2013(12):217-220.

    [14]劉剛, 翟朝陽. 一種通用的從少量培養(yǎng)液中快速提取細(xì)菌染色體DNA的方法[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2004, 16(2):3.

    [15]李聰智, 譚德明, 魯猛厚, 等. 聚合酶鏈反應(yīng)檢測細(xì)菌16S rRNA基因[J]. 湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1999(2):136-138.

    [16]趙文靜, 李妍, 高鵬飛, 等. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在乳酸菌定量檢測中的應(yīng)用[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2009, 28(4):433-437.

    [17]趙傳鵬, 浦躍樸, 尹立紅, 等. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測環(huán)境假單胞菌屬細(xì)菌豐度[J]. 東南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006, 36(1):143-146.

    [18] 王天佑, 王玉娟, 秦文, 等. 豬肉揮發(fā)性鹽基氮值指標(biāo)與其感官指標(biāo)的差異研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2007(12):124-126.

    [19]Tang X, Sun X, Wu VCH, et al. Predicting shelf-life of chilled pork sold in China[J]. Food Control, 2013, 32(1):334-340.

    [20]Duflos G, Theraulaz L, Giordano G, et al. Quantitative PCR method for evaluating freshness of whiting(Merlangius merlangus)and plaice(Pleuronectes platessa)[J]. Food Protection, 2010, 73(7):1344-1347.

    [21] Dolan AA, Burgess CM, Fanning SS, et al. Application of quantitative reverse-transcription PCR(qRT-PCR)for the determination of the total viable count(TVC)on meat samples[J]. Applied Microbiology, 2010, 109(1):91-98.

    [22]Margot HH, Stephan RR, Guarino SS, et al. Inclusivity, exclusivity and limit of detection of commercially available real-time PCR assays for the detection of Salmonella[J]. Food Microbiology,2013, 165(3):221-226.

    [23]Delibato E, Rodriguez-Lazaro D, Gianfranceschi M, et al. European validation of Real-Time PCR method for detection of Salmonella spp. in pork meat[J] . Food Microbiology, 2014:184134-184138.

    [24]Ye K, Zhang Q, Jiang Y, et al. Rapid detection of viable Listeria monocytogenes in chilled pork by real-time reverse- transcriptase PCR[J]. Food Control, 2012, 25(1):117-124.

    (責(zé)任編輯 馬鑫)

    Fast Detection of Freshness of Chilled Pork by Real-time Quantitative PCR

    Song Yanmin1Shi Limin1Xu Yuancong1Xu Wentao1,3Huang Lan2Liang Zhihong1
    (1. College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083;2. College of Information and Electrical Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083;3. Beijing Food Quality and Safety Laboratory,Beijing 100083)

    The current detection techniques for freshness of chilled pork are complex, so exploring fast detection techniques becomes hotspot. In this study Total Volatile Basic Nitrogen(TVB-N)was detected by the method defined in national standard, and Plate Culture Method(PCM)and real-time quantitative PCR were used to count the total amount of microorganisms causing spoilage of chilled pork. With the extension of storage time of the chilled pork at 4℃, the total number of microorganism colony and TVB-N had the linear correlation, and the level of spoilage of chilled pork behaved the positive correlation. The extracted bacterial genome by acetone-chloroform had the clear bands and showed the fine extraction result. Single-factor analysis of variance revealed that there was no significant difference of total number of colony(P=0. 7190)between by real-time quantitative PCR based on SYBER Green I and by counting in PCM, i. e. , consistency was quite solid. The detection time was reduced by real-time quantitative PCR with higher detection sensitivity. The amount of microorganisms is a crucial index to evaluate the freshness of chilled pork, and real-time quantitative PCR can be a new technology for quickly checking the freshness of chilled pork.

    chilled pork;Real-time quantitative PCR;microorganism;total volatile basic nitrogen(TVB-N)

    10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.013

    2014-10-22

    國家“863“計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z212,2012AA101609-7)

    宋艷敏,女,碩士,研究方向:食品微生物;E-mail:songyanminyx@sina.com

    梁志宏,女,博士,研究方向:食品微生物及生物脫毒;E-mail:lzh01@cau.edu.cn

    猜你喜歡
    新鮮度拷貝數(shù)鮮肉
    鮮肉藕夾
    線粒體DNA拷貝數(shù)變異機(jī)制及疾病預(yù)測價(jià)值分析
    胎兒染色體組拷貝數(shù)變異與產(chǎn)前超聲異常的相關(guān)性分析
    進(jìn)擊鮮肉
    Coco薇(2016年2期)2016-03-22 17:01:25
    陳坤演繹“小鮮肉”的完美進(jìn)化
    鮮肉長得對還不如穿得對
    Coco薇(2015年11期)2015-11-09 12:45:03
    DNA序列拷貝數(shù)變化決定黃瓜性別
    基于TTI的冷鮮羊肉新鮮度研究
    不同新鮮度金槍魚肉蒸煮品質(zhì)的研究
    幾種魚體新鮮度快速檢測方法的研究進(jìn)展
    色在线成人网| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲国产欧美人成| 22中文网久久字幕| 看黄色毛片网站| 干丝袜人妻中文字幕| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲国产精品sss在线观看| 少妇高潮的动态图| av在线老鸭窝| 一进一出抽搐动态| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 色5月婷婷丁香| 国产v大片淫在线免费观看| 欧美激情在线99| 久久久久久久久久黄片| 久久热精品热| av中文乱码字幕在线| 又黄又爽又免费观看的视频| 校园春色视频在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 天堂√8在线中文| 欧美又色又爽又黄视频| 国产精品国产高清国产av| 午夜久久久久精精品| 久99久视频精品免费| 免费观看人在逋| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美日韩黄片免| 欧美日韩国产亚洲二区| 日本三级黄在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 成年人黄色毛片网站| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 黄色日韩在线| 国产av麻豆久久久久久久| 国产精品伦人一区二区| 亚洲va在线va天堂va国产| 色综合站精品国产| 亚洲精品成人久久久久久| 中文亚洲av片在线观看爽| 看片在线看免费视频| 老司机福利观看| 国内精品宾馆在线| 免费大片18禁| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产精品人妻久久久影院| av女优亚洲男人天堂| 我要搜黄色片| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 日本五十路高清| 一级黄色大片毛片| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 校园春色视频在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 他把我摸到了高潮在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| av天堂中文字幕网| 在线国产一区二区在线| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲在线观看片| 日本黄色片子视频| 99久久精品国产国产毛片| 欧美一区二区亚洲| 国产精品一及| 亚洲乱码一区二区免费版| 99视频精品全部免费 在线| 在线国产一区二区在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| xxxwww97欧美| 免费观看的影片在线观看| 观看美女的网站| 欧美精品国产亚洲| 精品久久久久久久久亚洲 | 久久亚洲精品不卡| 久久中文看片网| 国产三级在线视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产精品一区二区免费欧美| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品伦人一区二区| 久久午夜亚洲精品久久| 搡老妇女老女人老熟妇| 免费高清视频大片| 亚洲精品日韩av片在线观看| 两个人的视频大全免费| 免费av不卡在线播放| 亚洲国产精品合色在线| 99精品在免费线老司机午夜| 日韩欧美在线二视频| 精品无人区乱码1区二区| 桃红色精品国产亚洲av| 一夜夜www| 久久久久久国产a免费观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 国产爱豆传媒在线观看| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 中文字幕免费在线视频6| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲av免费高清在线观看| 日韩高清综合在线| 日本免费a在线| 麻豆国产97在线/欧美| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品无大码| 此物有八面人人有两片| 日本黄大片高清| 婷婷精品国产亚洲av| 一个人看视频在线观看www免费| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日本一本二区三区精品| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲欧美清纯卡通| 在线看三级毛片| 久久精品国产亚洲网站| 三级毛片av免费| 午夜精品在线福利| 中亚洲国语对白在线视频| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美性猛交黑人性爽| 国产免费av片在线观看野外av| 精品不卡国产一区二区三区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久精品国产亚洲网站| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久九九热精品免费| 日韩欧美精品免费久久| 日本 欧美在线| 亚洲欧美清纯卡通| 中文字幕免费在线视频6| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 1000部很黄的大片| 美女黄网站色视频| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 伊人久久精品亚洲午夜| 美女大奶头视频| 日韩欧美免费精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 成人美女网站在线观看视频| 免费看日本二区| 成人亚洲精品av一区二区| 天堂网av新在线| 国产精品一区二区免费欧美| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产精品久久电影中文字幕| 99久国产av精品| 欧美丝袜亚洲另类 | 小说图片视频综合网站| 成人亚洲精品一区在线观看 | 国产极品天堂在线| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲av中文av极速乱| 午夜福利网站1000一区二区三区| 永久网站在线| 身体一侧抽搐| 我的老师免费观看完整版| 一区二区三区精品91| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 中文字幕av成人在线电影| 日韩一本色道免费dvd| 久久久久久九九精品二区国产| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美精品一区二区大全| 国产永久视频网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产免费一级a男人的天堂| 身体一侧抽搐| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 婷婷色麻豆天堂久久| freevideosex欧美| 街头女战士在线观看网站| 色婷婷av一区二区三区视频| www.色视频.com| 高清日韩中文字幕在线| 爱豆传媒免费全集在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 国内揄拍国产精品人妻在线| 精品久久久久久电影网| 国产成人91sexporn| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 各种免费的搞黄视频| 国产亚洲欧美精品永久| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| av一本久久久久| 综合色丁香网| 嫩草影院入口| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 热re99久久精品国产66热6| 晚上一个人看的免费电影| 国产久久久一区二区三区| av在线app专区| 青春草视频在线免费观看| 久久久精品免费免费高清| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日本黄色日本黄色录像| 国产男女超爽视频在线观看| 全区人妻精品视频| 久久久久久九九精品二区国产| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲天堂av无毛| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲精品乱久久久久久| 多毛熟女@视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久久久久久久精品精品| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 嫩草影院新地址| 亚洲高清免费不卡视频| 热99国产精品久久久久久7| 少妇 在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 新久久久久国产一级毛片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久亚洲国产成人精品v| 九草在线视频观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日本与韩国留学比较| 亚洲欧洲国产日韩| 七月丁香在线播放| 一边亲一边摸免费视频| 午夜福利影视在线免费观看| 51国产日韩欧美| 国产精品久久久久久久久免| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美变态另类bdsm刘玥| 不卡视频在线观看欧美| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产 一区精品| 国产精品av视频在线免费观看| 777米奇影视久久| 18禁在线播放成人免费| 97热精品久久久久久| 水蜜桃什么品种好| 中文字幕亚洲精品专区| 国产 一区 欧美 日韩| kizo精华| 久久国产精品大桥未久av | 美女主播在线视频| 久久久久久伊人网av| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲,一卡二卡三卡| 男人和女人高潮做爰伦理| 超碰97精品在线观看| 少妇精品久久久久久久| 日韩成人伦理影院| 色网站视频免费| 日韩av在线免费看完整版不卡| 26uuu在线亚洲综合色| 高清av免费在线| 一二三四中文在线观看免费高清| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 联通29元200g的流量卡| 免费看光身美女| 成人毛片60女人毛片免费| 欧美日韩精品成人综合77777| 777米奇影视久久| 简卡轻食公司| 中文字幕制服av| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 1000部很黄的大片| 日韩中字成人| 久久久国产一区二区| 国产成人免费无遮挡视频| 水蜜桃什么品种好| 99久久人妻综合| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 欧美日韩综合久久久久久| 久久久午夜欧美精品| 精品一区二区免费观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产免费一区二区三区四区乱码| 另类亚洲欧美激情| 国产成人精品福利久久| 日韩av在线免费看完整版不卡| 男女边吃奶边做爰视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产成人aa在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 中文资源天堂在线| 寂寞人妻少妇视频99o| 99热国产这里只有精品6| 免费av中文字幕在线| 精品久久久久久久末码| a级毛色黄片| 成人综合一区亚洲| 国产在线免费精品| 男人舔奶头视频| av免费在线看不卡| 国精品久久久久久国模美| 久久精品夜色国产| 亚洲国产毛片av蜜桃av| www.av在线官网国产| 2022亚洲国产成人精品| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产中年淑女户外野战色| 在线观看一区二区三区激情| www.av在线官网国产| 久久久午夜欧美精品| 亚洲av福利一区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 超碰97精品在线观看| 人妻 亚洲 视频| 制服丝袜香蕉在线| 99久久精品热视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 99热6这里只有精品| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产高清不卡午夜福利| 五月伊人婷婷丁香| 舔av片在线| 国产精品一区www在线观看| 老女人水多毛片| 亚洲中文av在线| 深夜a级毛片| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 男女边摸边吃奶| 黑人高潮一二区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 欧美 日韩 精品 国产| 中文资源天堂在线| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 五月玫瑰六月丁香| 午夜福利影视在线免费观看| 内地一区二区视频在线| 国产探花极品一区二区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 九色成人免费人妻av| 99久久精品国产国产毛片| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产黄频视频在线观看| 日韩强制内射视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日韩电影二区| 男女免费视频国产| 有码 亚洲区| 久久精品久久久久久久性| 午夜免费观看性视频| 国产精品一区二区性色av| 91久久精品电影网| 亚洲国产欧美人成| 国产美女午夜福利| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 永久网站在线| 97超视频在线观看视频| 亚洲成人手机| 亚洲人成网站在线播| 国产在线视频一区二区| 国产一区二区三区av在线| 欧美一区二区亚洲| 性色av一级| 伦精品一区二区三区| 黄片无遮挡物在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 韩国av在线不卡| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 精品一区在线观看国产| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲国产av新网站| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产精品.久久久| 久久精品国产自在天天线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲精品国产av蜜桃| 伦理电影大哥的女人| 看非洲黑人一级黄片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 欧美 日韩 精品 国产| 成人一区二区视频在线观看| www.av在线官网国产| 国产黄频视频在线观看| 亚洲国产av新网站| 能在线免费看毛片的网站| 久久久a久久爽久久v久久| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲国产精品成人久久小说| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 偷拍熟女少妇极品色| 99久久人妻综合| 亚洲精品aⅴ在线观看| 一级毛片电影观看| 国产视频内射| 日本黄色日本黄色录像| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 欧美成人a在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 两个人的视频大全免费| 夫妻午夜视频| 成年免费大片在线观看| 亚洲最大成人中文| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久久久久九九精品二区国产| 精品一区在线观看国产| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 色综合色国产| 十分钟在线观看高清视频www | 亚洲av男天堂| 99久国产av精品国产电影| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 我的女老师完整版在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精华霜和精华液先用哪个| 精品久久久久久久末码| 99热这里只有是精品50| 国产永久视频网站| 综合色丁香网| 亚洲精品一区蜜桃| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产精品一区二区在线不卡| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日韩视频在线欧美| 在线观看免费日韩欧美大片 | 国产一区二区三区综合在线观看 | 99热网站在线观看| 丝袜脚勾引网站| 免费观看av网站的网址| 精品久久国产蜜桃| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美最新免费一区二区三区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| a级毛色黄片| 国产黄片美女视频| 大片电影免费在线观看免费| 成年免费大片在线观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 高清av免费在线| 嘟嘟电影网在线观看| 日本免费在线观看一区| 多毛熟女@视频| 18禁动态无遮挡网站| 日本-黄色视频高清免费观看| 欧美国产精品一级二级三级 | 日韩一区二区三区影片| 国产黄片美女视频| 日韩av免费高清视频| 美女视频免费永久观看网站| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 欧美少妇被猛烈插入视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 在线观看免费日韩欧美大片 | 国产片特级美女逼逼视频| 99久久精品一区二区三区| 在线观看三级黄色| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 精品久久久久久电影网| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 色5月婷婷丁香| 最近最新中文字幕免费大全7| 在线免费观看不下载黄p国产| 性高湖久久久久久久久免费观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲成人一二三区av| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 99九九线精品视频在线观看视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久韩国三级中文字幕| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲av男天堂| 亚洲精品456在线播放app| 国产成人精品久久久久久| 日韩成人av中文字幕在线观看| 一级爰片在线观看| 观看av在线不卡| av女优亚洲男人天堂| 伦理电影大哥的女人| 免费av中文字幕在线| 99久久人妻综合| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产在视频线精品| 大陆偷拍与自拍| 成人漫画全彩无遮挡| tube8黄色片| av国产免费在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 伦理电影免费视频| 免费黄频网站在线观看国产| 日本av免费视频播放| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 一级a做视频免费观看| 直男gayav资源| 街头女战士在线观看网站| 久久久色成人| 网址你懂的国产日韩在线| 中国国产av一级| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲美女视频黄频| 性色av一级| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 99久久综合免费| 麻豆成人av视频| 九色成人免费人妻av| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 中文欧美无线码| 国产精品久久久久久精品古装| 制服丝袜香蕉在线| 国产成人a∨麻豆精品| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 欧美精品国产亚洲| 久久精品国产a三级三级三级| 日本av免费视频播放| 乱系列少妇在线播放| av.在线天堂| 大片免费播放器 马上看| 国产精品99久久久久久久久| 国产男女内射视频| 一个人免费看片子| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产精品久久久久成人av| 一个人看的www免费观看视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 精品一品国产午夜福利视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 成年av动漫网址| 深夜a级毛片| 人妻系列 视频| 日韩一本色道免费dvd| 日本欧美国产在线视频| 亚洲成人av在线免费| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 熟女av电影| 男女国产视频网站| 赤兔流量卡办理| 中国国产av一级| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲国产欧美在线一区| 精品亚洲成a人片在线观看 | 热re99久久精品国产66热6| 日韩av在线免费看完整版不卡| 在线 av 中文字幕| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 亚洲色图av天堂| 国精品久久久久久国模美| 亚洲在久久综合| 青青草视频在线视频观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产成人精品婷婷| 日本欧美视频一区| 久久久久视频综合| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 少妇人妻久久综合中文| 国产深夜福利视频在线观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 香蕉精品网在线| 成人黄色视频免费在线看| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲精品,欧美精品| 国产精品国产三级国产专区5o| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产精品久久久久久久久免| 街头女战士在线观看网站| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲av中文av极速乱| 97精品久久久久久久久久精品| 国产爱豆传媒在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 边亲边吃奶的免费视频| 在线 av 中文字幕| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲av欧美aⅴ国产| 最近2019中文字幕mv第一页| 中文字幕av成人在线电影| 欧美精品亚洲一区二区| 国产乱人视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 男人舔奶头视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产精品一二三区在线看| 日本与韩国留学比较| 天堂俺去俺来也www色官网| 午夜福利在线在线| 99热这里只有是精品在线观看| 日本av免费视频播放| av在线老鸭窝| 麻豆国产97在线/欧美| 国产在线男女| 亚洲精品国产成人久久av| 蜜桃在线观看..| 视频中文字幕在线观看|