基于脂肪酸生物標記與16S rRNA的芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析比較

劉國紅 劉波 林營志 唐建陽

（福建省農業(yè)科學院農業(yè)生物資源研究所，福州 350003）

基于脂肪酸生物標記與16S rRNA的芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析比較

劉國紅 劉波 林營志 唐建陽

（福建省農業(yè)科學院農業(yè)生物資源研究所，福州 350003）

旨在探究脂肪酸作為一種有效的芽胞桿菌分類標記，以25種芽胞桿菌模式菌株為研究對象，對芽胞桿菌進行脂肪酸組分和16S rRNA基因系統(tǒng)進化分析比較。結果表明，脂肪酸系統(tǒng)發(fā)育分析能充分體現(xiàn)芽胞桿菌種類間的親緣關系，并且按生物學特性進行聚類分群，而16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育僅完美體現(xiàn)出種間的親緣關系。利用脂肪酸分析可將25種芽胞桿菌完全準確分開，且將生物學特性相同的芽胞桿菌種類聚為一類，如堿性條件下生長良好的4種芽胞桿菌（B. agaradhaerens、B. alacalphilus、B. alkalitelluris和B. fastidiosus）聚為一類，芽胞桿菌為圓形的芽胞桿菌（B. fusiformis、B. odysseyi 和B. sphaericus）聚為一類。結果表明，脂肪酸分析不僅根據親緣關系進行聚類，還可以根據生物學特性對芽胞桿菌進行分類。

芽胞桿菌；脂肪酸生物標記；16S rRNA；系統(tǒng)發(fā)育分析

芽胞桿菌屬（Bacillus）屬于細菌界（Bacteria），厚壁菌門（Firmicutes），桿菌綱（Bacilli），芽胞桿菌目（Bacillales），芽胞桿菌科（Bacillaceae），是一類好氧或兼性厭氧、產芽胞的革蘭氏陽性桿狀細菌。由于大多數芽胞桿菌種類可以產生多種多樣的活性物質，在工業(yè)、農業(yè)、醫(yī)學、環(huán)境等領域有著重要的經濟價值，因此研究它們的分類地位對其應用有著更重要的研究意義［1，2］。

在研究微生物進化分類時，人們通常根據一些相對保守的序列進行分析，如rRNA序列、蛋白質的氨基酸序列、編碼蛋白質的核酸序列。原因一方面是由于這些保守的序列會帶來相對可靠的結果；另一方面是由于在數據庫中，這些序列可以比較方便的得到。細菌分類及系統(tǒng)發(fā)育分析常借助16S rRNA作為標尺，但16S rRNA序列的保守性使得某些親緣關系密切的種類無法區(qū)分開，在系統(tǒng)進化分析上存在一些缺陷［3］。鑒于芽胞桿菌分類的復雜性，使得尋找和建立這類細菌準確的分類方法頗受關注。由于細菌不同屬、種，甚至不同株之間脂肪酸碳鏈長度、雙鍵位置、取代基團等都存在差異，脂肪酸是細胞膜的重要遺傳表達產物，與DNA具有同源性，因此脂肪酸分析技術在細菌分類中具有重要作用［4］。1963年，Able等［5］首次提出證據表明細胞脂肪酸可以成功的鑒定細菌。Kaneda［6］將22株芽胞桿菌分為6個群，K?mpfer［7］證明脂肪酸生物標記具有遺傳穩(wěn)定性，可以作為芽胞桿菌屬種類分類鑒定的一種有效手段。張曉霞等［8］利用脂肪酸成分對不動桿菌進行鑒定，研究結果表明脂肪酸鑒定結果和16S rRNA基因分析結果一致，在種水平上利用16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析結果與脂肪酸組分分析的結果可互為補充，相互印證。目前隨著脂肪酸分析技術的日益成熟，基于脂肪酸分析技術的氣相色譜Sherlock微生物鑒定系統(tǒng)，使脂肪酸分析更加快速、準確，在細菌分類中被廣泛應用。脂肪酸分析可區(qū)分屬、種并進行聚類。本研究對25種芽胞桿菌屬模式菌株進行脂肪酸組成分析，并與16S rRNA系統(tǒng)進化分析進行比較，旨在為揭示基于脂肪酸生物標記的芽胞桿菌鑒定的準確性，基于脂肪酸生物標記的芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育與芽胞桿菌生物學演化的關系，與16S rRNA芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育的差異提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 所有供試菌株來自于本實驗室福建省農業(yè)科學院農業(yè)生物資源所農業(yè)生物研究中心，分別引自德國微生物菌種保藏中心（DSMZ）、美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）和瑞典Geborg大學菌物保藏中心（CCUG），詳見表1。

表1 供試菌株信息

1.1.2 主要試劑和儀器 皂化試劑（試劑I）：150mL去離子水和150 mL甲醇混勻合，加入45 g NaOH，同時攪拌至完全溶解；甲基化試劑（試劑II）：325 mL 6 mol/L的鹽酸加入到275 mL甲醇中，混合均勻；萃取試劑（試劑III）：加200 mL甲基叔丁基醚到200 mL正己烷中，混合均勻；洗滌試劑（試劑IV）：在900 mL去離子水中加入10.8 g NaOH，攪拌至完全溶解；飽和NaCl溶液：在100 mL去離子水中加入40 g NaCl。以上所有有機試劑均為色譜（HPLC）級，購于Sigma公司，無機試劑均為優(yōu)級純。安捷倫7890 N型氣相色譜、Sherlock MIS、振蕩器、水浴鍋、10 mL帶蓋試管、玻璃量筒等。所有的玻璃器皿均須烘干后使用。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化和保存 所有供試菌株均采用TSA（BD，US）培養(yǎng)基進行活化，28℃培養(yǎng)2 d。采用-80℃甘油冷凍法保存供試菌株，進一步試驗備用。

1.2.2 芽胞桿菌脂肪酸的提取、檢測及分析

1.2.2.1 菌體獲取及脂肪酸的提取 參照文獻［4］的方法進行。在TSB培養(yǎng)基上新鮮培養(yǎng)的待測菌株按四區(qū)劃線接種至新鮮TSB培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h。刮取20 mg菌體，置于試管，加入1 mL溶液I，100℃水浴30 min。冰浴中迅速冷卻后加入2 mL溶液II，混勻后80℃水浴作用10 min。迅速冷卻，加入1.25 mL溶液III。震蕩10 min，吸棄下層溶液。然后中加入3 mL溶液IV及兩滴飽和NaCl溶液，震蕩5 min。靜止，待溶液分層后，吸取上層液體于GC樣品管中待測。

1.2.2.2 細菌脂肪酸成分檢測 采用美國Agilent 7890 N型氣相色譜系統(tǒng)，包括全自動進樣裝置、石英毛細管柱及氫火焰離子化檢測器；通過細菌細胞脂肪酸成分進行細菌鑒定的分析軟件采用Sherlock MIS6.0（Microbial Identification System）（美國MIDI公司產品）。在下述色譜條件下平行分析脂肪酸甲酯混合物標樣和待檢樣本：二階程序升高柱溫，170℃起始，每分鐘升溫5℃，升至260℃，而后再每分鐘升溫40℃，升至310℃，維持90 s；汽化室溫度250℃、檢測器溫度300℃；載氣為氫氣（2 mL/ min）、尾吹氣為氮氣（30 mL/min）；柱前壓68.95 Kpa；進樣量1 μL，進樣分流比100∶1。

1.2.2.3 統(tǒng)計分析 利用林營志等［9］編程軟件PLFAEco處理后提取出脂肪酸數據，然后利用生物統(tǒng)計軟件SPSS16.0進行統(tǒng)計分析。

1.2.3 基于16S rRNA基因序列的芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析 芽胞桿菌模式菌株序列來自EzTaxon網站［10］。16S rRNA序列經過ClustalX2［11］程序多重比對，系統(tǒng)進化矩陣根據Jukes-Cantor模型［12］估計，利用Mega4.0軟件［13］采用鄰接法（Neighbour-Joining）［14］進行聚類分析構建系統(tǒng)進化樹。同時采用1 000次自展值（Bootstrap value）分析來評估系統(tǒng)進化樹拓撲結構的穩(wěn)定性［15］。

2 結果

2.1 芽胞桿菌的脂肪酸成分分析

對25種芽胞桿菌進行了脂肪酸成分的測定，檢測出22種已知脂肪酸和4種Summed Feature型，每種芽胞桿菌的具體脂肪酸成分見表 2。

表2顯示，芽胞桿菌的脂肪酸主要以支鏈脂肪酸為主，少數種類含有不飽和脂肪酸，主要類型即脂肪酸含量大于10%的為15：0 iso、15：0 anteiso、17：0 iso、14：0 iso、16：0、16：0 iso和 17：0 anteiso。不同芽胞桿菌種類的脂肪酸成分和含量不同，如蠟狀芽胞桿菌類群主要脂肪酸類型為15：0 iso、17：0 iso、16：0、13：0 iso和Summed Feature 3（16：1 ω6c and/or 16：1 ω7c），其次為15：0 anteiso、17：1 iso ω5c、14：0 iso、17：0 anteiso和13：0 anteiso。球形芽胞桿菌類群B. fusiformis、B. odysseyi、B. sphaericus主要脂肪酸為15：0 iso、15：0 anteiso和16：0 iso，其次為17：0 iso、17：0 anteiso、16：1 ω7c alcohol、14：0 iso和16：0?？莶菅堪麠U菌類群B. vallismortis、B. atrophaeus和B. mojavensis脂肪酸主要為15：0 iso、15：0 anteiso和17：0 anteiso，其次為17：0 iso、16：0 iso、16：0和14：0 iso。酸性芽胞桿菌B. acidicola和B. acidiproducens主要脂肪酸為15：0 anteiso和17：0 anteiso。嗜堿芽胞桿菌類群B. agaradhaerens、B. alacalphilus、B. alkalitelluris和B. fastidiosus脂肪酸主要為16：0、15：0 iso、15：0 anteiso和17：0 iso。短小芽胞桿菌類群B. altitudinis、B. pumilus和B. safensis脂肪酸主要為15：0 iso和15：0 anteiso， 其 次 為17：0 anteiso、17：0 iso、16：0 iso、16：0和14：0 iso。簡單芽胞桿菌類群B. koreensis、B. aryabhattai、B. megaterium、B. muralis、B. simplex和B. novalis的主要脂肪酸為15：0 iso和15：0 anteiso，其次為17：0 anteiso、17：0 iso、16：0 iso、16：0、14：0和14：0 iso。

表2 供試菌株的脂肪酸含量

2.2 基于脂肪酸生物標記的芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析

利用生物統(tǒng)計軟件SPSS16.0采用歐式距離對25種芽胞桿菌進行脂肪酸聚類分析，可以分為兩大類，具體見圖 1。第一類包含13種菌，進一步可分為4個小分支：B. safensis、B. pumilus和B. altitudinis聚為一個分支，B. aryabhattai、B. novalis和B. koreensis聚為一個分支，B. odysseyi、B. sphaericus和B. fusiformis聚為一個分支，B. mycoides、B. thuringiensis、B. cereus和B. pseudomycoides聚為一個分支。第二類包含12種菌，可分為兩個小分支：B. alcalophilus、B. fastidiosus、B. alkalitelluris、B. vallismortis和B. agaradhaerens聚為一個分支，B. acidicola和B. acidiproducens、B. atrophaeus和B. mojavensis、B. megaterium、B. simplex和B. muralis聚為一個分支。

圖1 基于脂肪酸生物標記的芽胞桿菌聚類分析

2.3 基于16S rRNA基因芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析

25種芽胞桿菌采用ClustalX 2軟件進行多序列分析，并通過Mega4軟件構建系統(tǒng)進化樹（圖2）。結果顯示，芽胞桿菌16S rRNA分類將芽胞桿菌分為兩大類，第一類包含4個小分支，分別為：B. fastidiosus、B. alkalitelluris、B. megaterium、B. aryabhattai和B. koreensis聚為一個分支，B. novalis、B. simplex和B. muralis聚為一個分支，B. odysseyi、B. sphaericus和B. fusiformis聚為一個分支，B. mycoides、B. thuringiensis、B. cereus和B. pseudomycoides聚為一個分支。第二類包含3個小分支，分別為：B. acidicola和B. acidiproducens聚為一個分支，B. alcalophilus和B. agaradhaerens聚為一個分支，B. safensis、B. pumilus和 B. altitudinis，B. atrophaeus、B. vallismortis和 B. mojavensis聚為一個分支。

2.4 芽胞桿菌脂肪酸與16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析比較

基于脂肪酸生物標記的芽胞桿菌聚類與16S rRNA聚類分析相比有一些差異，表 3顯示，脂肪酸聚類結果與16S rRNA不同的是B. novalis和B. megaterium在聚類樹中的位置互換，B. fastidiosus、B. alkalitelluris、B. alcalophilus和B. agaradhaerens在脂肪酸聚類分析中僅聚為一個分支，而非16S rRNA進化樹中的兩個獨立分支，B. vallismortis與后4種芽胞桿菌聚在一起。脂肪酸分類主要依據是生物學特性，而16S rRNA分類則主要依據DNA堿基相似性。

圖2 基于16S rRNA芽胞桿菌系統(tǒng)進化分析

3 討論

本研究針對25個芽胞桿菌種類進行了基于16S rRNA基因和脂肪酸生物標記系統(tǒng)發(fā)育分析的比較，結果表明，脂肪酸生物標記可以如16S rRNA基因一樣為研究近親緣物種之間的進化關系提供有用的信息，而且在有些種類的分群上脂肪酸更具有優(yōu)勢。隨著數據庫中芽胞桿菌脂肪酸數據的增加，可以進行更深入的研究。盡管脂肪酸提取分析需要較嚴格的操作標準，同時需要實驗室具備專門的儀器，這些局限性隨著科學技術和經濟的發(fā)展都已逐步得到改善。脂肪酸鑒定已發(fā)展一種相對成熟的鑒定方法，在許多菌株中都曾有過應用。Abel 等［5］早在1963年就指出脂肪酸可用于細菌鑒定，細胞脂肪酸分析（Microbial identification system，MIDI）鑒定系統(tǒng)的應用使微生物脂肪酸分析標準化、自動化，操作簡單，檢測結果迅速而準確，且費用低廉，因此近些年被廣泛地應用于細菌的分類鑒定中［16］。吳愉萍等［17］也將Sherlock MIS系統(tǒng)應用于土壤細菌鑒定的研究，結果表明該系統(tǒng)可以將分離菌株準確地鑒定到種，甚至可以進行種下分化鑒定分析。Whittaker等［18］研究證明脂肪酸分析可以快速靈敏地鑒定Francisella tularensis。劉波［19］出版的《微生物脂肪酸生態(tài)學》中，以本實驗室分離芽胞桿菌為例，比較了脂肪酸鑒定與16S rRNA分子鑒定，結果表明，98%的芽胞桿菌種類用脂肪酸鑒定結果與16S rRNA分子鑒定結果相同，說明脂肪酸組成分析可快速而準確地對芽胞桿菌類群的菌株進行初步的鑒定。黃朱梁［20］用Sherlock微生物自動鑒定系統(tǒng)鑒定了從貽貝中分離的蠟樣芽胞桿菌，并用生理生化鑒定和PCR鑒定驗證了該方法的準確性。同時，通過對芽胞桿菌模式菌株的脂肪酸分析，我們首次報道了芽胞桿菌脂肪酸聚類分析與16S rRNA聚類結果的比較分析。

另外，由于16S rRNA基因高度保守，親緣關系在種以上水平的菌株具有很高的分辨率，但對親緣關系比較近的種分辨率不高。一般來講，菌株之間16S rRNA基因序列相似性＞97%，可能屬于同一種；但16S rRNA基因序列相似性在99%以上，仍可能屬于不同的種，需要DNA-DNA雜交等試驗來進一步確定?；?6S rRNA的芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育，唯一依據就是基因序列相似性，這一結果無法完美地體現(xiàn)芽胞桿菌生物學特性與系統(tǒng)發(fā)育的關系，如喜酸環(huán)境生存的芽胞桿菌B. acidicola、B. acidiproducens、B. atrophaeus和B. mojavensis等，喜堿環(huán)境生存的芽胞桿菌B. alcalophilus、B. fastidiosus、B. alkalitelluris和B. agaradhaerens等，不能聚為同一個分支。

表3 芽胞桿菌脂肪酸和16S rRNA分類結果比較

本研究選取了25種芽胞桿菌模式菌株作為研究對象，比較分析了芽胞桿菌脂肪酸聚類和16S rRNA聚類分析的差異。研究發(fā)現(xiàn)利用脂肪酸組成分析也可以成功將供試菌株完全準確地區(qū)分開，這一點與16S rRNA的分類結果一致。我們還發(fā)現(xiàn)在芽胞桿菌“種”的分類地位上，脂肪酸聚類結果比16S rRNA基因進化分析更具有優(yōu)勢，不僅可以根據進化關系確定種的分類地位，還根據生物學特性將相同的菌株聚在一起，如本研究的供試菌株4種芽胞桿菌均為嗜堿菌，在16S rRNA進化分析中聚類為兩個獨立分支，而脂肪酸則根據其相同的生物學特性將其聚為一個分支。

本研究僅以芽胞桿菌屬的種類為研究對象進行分析，對脂肪酸生物標記在芽胞桿菌近緣屬上的應用是否具有同樣的效果需要進一步研究驗證。

4 結論

本研究比較分析了25種芽胞桿菌模式菌株脂肪酸組分和16S rRNA基因系統(tǒng)進化，結果表明脂肪酸分析可將25種芽胞桿菌完全準確地分開，且將生物學特性相同的芽胞桿菌種類聚為一類，如堿性條件下生長良好的4種芽胞桿菌（B. agaradhaerens、B. alacalphilus、B. alkalitelluris和B. fastidiosus）聚為一類，芽胞桿菌為圓形的芽胞桿菌（B. fusiformis、B. odysseyi 和B. sphaericus）聚為一類。

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（責任編輯 馬鑫）

The Comparsion of Bacillus Species Classification Based on Fatty Acid and 16S rRNA Gene

Liu Guohong Liu Bo Lin Yingzhi Tang Jianyang
（Agricultural Bio-resource Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou 350003）

In order to explore the application of fatty acid composition in taxonomy of Bacillus species， the fatty acid constitutions of 25 strains were detected by Microbial Identification System（MIDI）. The clusters of fatty acid profiles and 16S rRNA gene sequences were analyzed by SPPS16.0 and Mega4， respectively. The results showed that phylogeny analysis based on the fatty acid biomarkers could not only fully reflect the relationships among the Bacillus species， but also group the Bacillus species according to the biological characteristics. However，16S rRNA phylogeny only perfectly showed the relationships among the species. For example， four species growing well under the alkaline conditions and three species round spore-forming were clustered together， respectively. Result showed that Bacillus species can be clustered together not only according to the related ship， but also classified by the biological characteristics.

Bacillus；fatty acid profile；16S rRNA；phylogeny

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.021

2014-08-05

國家自然科學基金項目（31370059），“973”前期研究專項（2011CB111607），農業(yè)部“948計劃”（2011-G25）

劉國紅，博士，研究方向：芽胞桿菌資源分類及功能研究；E-mail：Liuguohong624@sina.com

劉波，博士，研究員，研究方向：微生物生物技術與農業(yè)生物藥物；E-mail：fzliubo@163.com