異育銀鯽GABA A受體γ2亞基全長克隆及生物信息學(xué)分析

趙依妮胡鯤孫琪，2楊先樂阮記明周愛玲

（1. 上海海洋大學(xué)國家水生動物病原庫，上海 201306；2. 上海黛龍生物科技工程有限公司，上海 201414）

異育銀鯽GABA A受體γ2亞基全長克隆及生物信息學(xué)分析

趙依妮1胡鯤1孫琪1，2楊先樂1阮記明1周愛玲1

（1. 上海海洋大學(xué)國家水生動物病原庫，上海 201306；2. 上海黛龍生物科技工程有限公司，上海 201414）

近年來GABA A受體亞基特異性在藥物篩選、研發(fā)過程中的應(yīng)用得到廣泛地關(guān)注，其中有關(guān)α1、β2和γ2三種功能性亞基的研究最為深入。異育銀鯽因其良好的生長、繁殖優(yōu)勢，在國內(nèi)得到廣泛養(yǎng)殖。采用RACE法克隆得到了異育銀鯽GABA A受體γ2亞基基因全長cDNA，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。該基因長2 763 bp，其中CDS區(qū)長1437 bp，可編碼477個氨基酸的前體蛋白。預(yù)測蛋白分子量55.3 kD，理論等電點(diǎn)9.13。異育銀鯽體內(nèi)GABA A受體γ2亞基氨基酸序列N端存在1個長度為35個氨基酸的信號肽，4個長度分別為23、20、23和23個氨基酸的跨膜區(qū)，3個N-糖基結(jié)合位點(diǎn)和2個O-糖基化位點(diǎn)，1個特異性結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列具有明顯的氯離子門控通道家族特征。氨基酸序列與其他物種氨基酸序列的同源性都在89%以上，表明該蛋白屬于GABA A受體亞基家族。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明異育銀鯽與斑馬魚聚為一支，親緣關(guān)系最近。

異育銀鯽；GABA A受體γ2亞基；克隆；生物信息學(xué)分析

γ-氨基丁酸（GABA）是腦組織內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，主要通過GABA受體起作用。根據(jù)受體對激動劑及拮抗劑的敏感性差異，可將GABA受體分為A、B、C三種類型［1］，其中A型受體是一種跨膜門控氯離子通道，可介導(dǎo)階段性的抑制突觸傳遞，也可強(qiáng)直性抑制外周突觸傳遞，因此在神經(jīng)性疾病如焦慮和癲癇的病理生理學(xué)中起著至關(guān)重要的作用［2］。GABA A受體上存在GABA、苯二氮卓類和神經(jīng)甾體三種結(jié)合位點(diǎn)，它是幾種臨床常用抗焦慮、抗癲癇藥物和麻醉劑的主要藥物標(biāo)靶［3］。該受體是一種由4次跨膜亞基聚合形成的五聚體，中間是中空的氯離子通道。迄今，已發(fā)現(xiàn)的GABA A受體亞基可分為7種（α1-6，β1-3，γ1-3，ρ1-3，δ，ε，θ）［4］。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)GABA A受體是由α、β和γ亞基組成，且構(gòu)成比多為2∶2∶1［4，5］，其中α1、β2和γ2形成的五聚體約占40 %［6］。不同亞單位組合成的GABA A受體的生理學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)不同，γ2亞基在發(fā)育中和成熟腦以及脊髓中廣泛表達(dá)，84%的GABA A受體包含γ2亞基［7，8］，是GABA A受體主要的功能性亞基之一［9］。研究發(fā)現(xiàn)γ2亞基在GABA A受體突觸聚集、突觸后的定位、GABA A受體的胞吞作用、BDZ識別方面起著重要作用［10-13］。 此外，γ2亞基也為氯離子通道正常導(dǎo)電所必需［14］。研究發(fā)現(xiàn)γ2亞基存在兩個剪接變體γ2L和γ2S，而這兩種剪接變體表達(dá)的失衡將會導(dǎo)致GABA A受體表達(dá)的改變，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生；進(jìn)一步的研究表明γ2亞基的突變與GABA A受體功能障礙和家族性癲癰綜合征有關(guān)［10-12，15］。目前，有關(guān)GABA A受體的研究主要集中在癲癇病治療藥物、抗抑郁等神經(jīng)藥物和農(nóng)用殺蟲劑的創(chuàng)新與研制等方面［16-19］，而在水產(chǎn)動物領(lǐng)域的相關(guān)研究鮮見報道。異育銀鯽（Carassais auratus gibebiol）具有生長快、個體大、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中顯示出良好的經(jīng)濟(jì)性狀，在國內(nèi)得到廣泛養(yǎng)殖。迄今為止，有關(guān)GABA A受體γ2亞基基因克隆在哺乳動物神經(jīng)性疾病、新型藥物研發(fā)的研究報道中較多，而在魚類中的研究報道較少。本研究以異育銀鯽為研究對象，利用 RACE 法對GABA A受體γ2亞基基因進(jìn)行克隆和序列分析，以期為后續(xù)研究GABA A受體γ2亞基基因在漁藥研發(fā)及安全性評估奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 健康的異育銀鯽購買于江蘇省南通某國營農(nóng)場，體重（61±5.5）g。用2% NaCl浸泡10 min，然后放置于高錳酸鉀消毒后的水族箱（100×80×80 cm3）內(nèi)暫養(yǎng)2周，飼喂普通顆粒飼料。試驗(yàn)期間使用自動控溫系統(tǒng)控制水溫為（20±2）℃，24 h 充氣，2 d換一次水。試驗(yàn)時取異育銀鯽6條，取腦組織樣品，液氮迅速冷卻，儲存在-70℃條件下備用。

1.1.2 主要試劑和儀器 Trizol試劑（美國Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄酶、Ex Taq DNA聚合酶（日本TaKara 公司），SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech），DH5α感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa），引物、AXYGEN柱式凝膠回收試劑盒、AXYGEN小量質(zhì)粒提取試劑盒（上海生工生物有限公司）。PCR儀為eppendof Mastercycle Gradient，核酸測定儀為eppendof Biophotomter。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 分離異育銀鯽腦組織，按Trizol法提取總RNA。采用紫外分光光度計(jì)與1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度及完整性，-80℃保存?zhèn)溆?。使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)條件按照試劑盒推薦體系進(jìn)行。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)、基因片段的克隆及測序 應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)GeneBank發(fā)表的斑馬魚（NM_001256250.1）GABA A受體的γ2亞基序列設(shè)計(jì)一對特異性引物F1&R1（表1），引物由上海生工生物有限公司合成。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件按照試劑盒推薦體系進(jìn)行。1.0 % 的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，按瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒操作說明純化回收特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，并連接至pMD19-T vector 載體，將鏈接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，通過藍(lán)白斑篩選和菌落PCR初步鑒定后，陽性菌落于37℃震蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒后將鑒定為陽性的克隆送上海生工生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 5' RACE 和 3' RACE 以獲得的基因片段為模板設(shè)計(jì)用于 3' 和 5' 端 RACE 所需引物（表 1）。利用BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 第一鏈為模板，按照試劑盒推薦體系進(jìn)行3' 和 5' RACE 反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物的檢驗(yàn)、純化、克隆、測序與上述基因片段的克隆所述相同。

表1 本文所用引物

1.2.4 序列拼接與生物信息學(xué)分析 利用DNAStar軟件中的 SeqMan 程序?qū)y序結(jié)果進(jìn)行載體序列的去除和拼接。序列同源性對比和相似性搜索用NCBI BLAST軟件進(jìn)行；開放閱讀框（ORF）的尋找用NCBI上的ORF Finder進(jìn)行；信號肽查找用Sginal P 4.1 Server程序進(jìn)行；利用TMHMM對跨膜域進(jìn)行預(yù)測；蛋白特征模體查找采用SMART軟件；蛋白質(zhì)性質(zhì)分析采用ExPASy server軟件；多序列比對采用ClustalW 1.8軟件，用MEGA4.0的鄰接法對異育銀鯽GABA A受體γ2亞基氨基酸序列與GenBank上發(fā)表的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，1 000次重復(fù)計(jì)算自展分析值，利用NCBI在線軟件預(yù)測結(jié)構(gòu)特征。

2 結(jié)果

2.1 GABA A 受體 γ2亞基基因全長cDNA的獲得

以異育銀鯽腦組織 cDNA 為模板，利用所設(shè)計(jì)的特異性引物 F1 和 R1 擴(kuò)增獲得了一條長約850 bp的特異性條帶（圖1-A），與預(yù)期大小相同。以異育銀鯽腦組織總RNA為模板，用RACE試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、5' RACE 和 3' RACE反應(yīng)，分別獲得了一條長約1 400 bp 和 1 600 bp 的特異性條帶（圖1-B，1-C）。

圖1 GABA A受體 γ2 亞基擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 GABA A 受體 γ2亞基基因序列測定及分析

序列拼接后得到長度為2 763 bp的異育銀鯽GABA A受體γ2亞基的cDNA序列（圖2），其中5'非編碼區(qū)長64 bp，3'非編碼區(qū)長1 262 bp，蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS）長1 437 bp，CDS區(qū)可編碼477個氨基酸的前體蛋白。

2.3 GABA A 受體 γ2亞基蛋白生物信息學(xué)分析

Protparam 在線軟件分析表明γ2亞基基因編碼蛋白的分子式為C2515H3891N657O697S26，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量約為55.3 kD，理論等電點(diǎn)是9.13。GABA A受體γ2亞基蛋白質(zhì)在異育銀鯽體內(nèi)半衰期30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為37.09，總平均親水性為-0.062。以ProtScale程序分析GABA A受體γ2亞基CDS區(qū)cDNA編碼的氨基酸，發(fā)現(xiàn)親水性殘基所占比列遠(yuǎn)大于疏水性殘基，因此推測GABA A受體γ2亞基CDS區(qū)編碼蛋白是親水性的。

采用Signal P預(yù)測GABA A受體γ2亞基CDS區(qū)序列特征，結(jié)果表明存在1個信號肽，長35氨基酸，信號肽序列為MVIMASSSHRSSKCLNAMMIPAI SLKLCLWALLIA，故推測GABA A受體γ2亞基屬于分泌型蛋白。TMHMM分析（圖3）表明GABA A受體γ2亞基含有4個明顯的跨膜區(qū)，長度分別為23、20、23、23個氨基酸，與其進(jìn)行膜內(nèi)外Cl-離子傳遞功能有關(guān)，屬于跨膜蛋白類。通過NetNGlyc1.0 分析推測GABA A受體γ2亞基糖基結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果表明GABA A受體γ2亞基在含有3個N-糖基化位點(diǎn)、分別位于第53、第130和第248氨基酸處，且這3處氨基酸都是天門冬酰胺，此外，GABA A受體γ2亞基還含有兩個O-糖基化位點(diǎn)，因此推測GABA A受體γ2亞基可能是個糖蛋白。

2.4 GABA A受體γ2亞基基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2 異育銀鯽GABA A受體 γ2亞基基因cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

使用Blast程序檢索異育銀鯽GABA A受體γ2亞基氨基酸序列與其他物種的同源性（圖4）。利用CLUSTAL 1.83軟件將異育銀鯽γ2亞基氨基酸序列與斑馬魚（Danio rerio，NP_001243179.1）、斑馬宮麗魚（Maylandia zabra，XP_004550435.1）、羅非魚（Oreochromis niloticus，XP_005452616.1）、青鱂（Oryzias latipes，XP_004076169.1）、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripesTakifugu rubripes，XP_003970978.1）， 斑 點(diǎn)雀鱔（Lepisosteus oculatus，XP_006631877.1），美洲狼鱸（Morone Americana，AAL50804.1），維多利亞湖慈鯛（Pundamilia nyererei，XP_005727815.1）進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相似性在89%-95%之間。根據(jù) GenBank 上已注冊該亞基的氨基酸序列，使用MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖 5）。結(jié)果顯示，異育銀鯽 GABA A 受體γ2 亞基的氨基酸與斑馬魚的聚為一支，表明其親緣性最近。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn) GABA A 受體γ2 亞基前體蛋白結(jié)構(gòu)域包含1個配體門控離子通道（LGICs）超家族共有的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域保守核心區(qū)域氨基酸序列具有明顯的氯離子門控超級家族的特征：主要位于N端細(xì)胞外域，約由240個氨基酸組成的親水性肽鏈，含有兩個保守性N糖基化位點(diǎn)，是主要的胞外配體結(jié)合區(qū)域。雖然不同物種之間該結(jié)構(gòu)域氨基酸序列有一定差異性，但是其總體拓?fù)浜驼郫B結(jié)構(gòu)是高度保守的。

圖3 GABA A受體γ2亞基蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析結(jié)果

3 討論

本研究獲得了異育銀鯽GABA A受體γ2亞基2 763 bp的cDNA全長序列，其中5'非編碼區(qū)長64 bp，3'非編碼區(qū)長1 262 bp，蛋白質(zhì)編碼區(qū)長1 437 bp，可編碼477個氨基酸。到目前為止，在斑馬魚（Danio rerio，NP_001243179.1）、斑馬宮麗魚（Maylandia zabra，XP_004550435.1）、 羅 非 魚（Oreochromis niloticus，XP_005452616.1）、青鱂（Oryzias latipes，XP_004076169.1）、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripesTakifugu rubripes，XP_003970978.1），斑點(diǎn)雀鱔（Lepisosteus oculatus，XP_006631877.1），美洲狼鱸（Morone Americana，AAL50804.1），維多利亞湖慈鯛（Pundamilia nyererei，XP_005727815.1）等水產(chǎn)動物中都已發(fā)現(xiàn)有GABA A受體γ2 亞基的存在。對GABA A受體γ2 亞基氨基酸序列進(jìn)行種間相似性分析及MEGA4系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明異育銀鯽與斑馬魚遺傳距離更近。鯉魚、鯽魚和斑馬魚又同屬于鯉形目鯉科，而異育銀鯽是以天然雌核發(fā)育的方正銀鯽為母本，以興國紅鯉為父本，經(jīng)人工授精繁育的子代，因此異育銀鯽與斑馬魚親緣關(guān)系比較近。陳笑霞［20］對魚類GABA A受體的研究也發(fā)現(xiàn)異育銀鯽同斑馬魚的遺傳距離更近。斑馬宮麗魚、羅非魚、維多利亞湖慈鯛同屬鱸形目慈鯛科，因此聚為一支。而美洲狼鱸雖然也屬于鱸形目，卻并未與上述幾種鱸形目魚類聚為一支，顯示出GABA A受體γ2 亞基在進(jìn)化上的差異性。通常認(rèn)為，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)及其功能較核酸一級序列（基因序列）具有更大的保守性，因此一般來講，如果蛋白質(zhì)序列間的相似性大于30%，它們很可能是同源的［21］。通過蛋白質(zhì)同源性檢索發(fā)現(xiàn)，γ2 亞基氨基酸序列種間相似性在89%-95%之間，表明γ2 亞基氨基酸序列的折疊結(jié)構(gòu)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)具有較高的保守性。在相似的基礎(chǔ)上，不同動物之間GABA A受體亞基的氨基酸序列的相似性有所不同，這在一定程度上反映了生物進(jìn)化的關(guān)系；同時，GABA A受體亞基的氨基酸結(jié)構(gòu)具有較高的保守性，但不同物種間仍存在一定差異，反映出不同種屬GABA A受體在生理功能上存在的差異性［22］。

異育銀鯽γ2 亞基氨基酸序列及其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)具有明顯的GABA A受體亞基家族的特征。首先，所有跨膜區(qū)域都是以α-螺旋形式橫過細(xì)胞膜，彼此之間通過親水性氨基酸相連，并相互作用形成氯離子通道，而細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)大量帶正電的氨基酸殘基則形成離子通道口，起著陰離子濾膜的作用，這與其進(jìn)行調(diào)控膜內(nèi)外氯離子傳遞這一功能有關(guān)［23］。此外，TM1部位脯氨酸（P 283）的存在，使肽鏈具備彎曲的能力，也使TM1在氯離子通道的打開及關(guān)閉過程中起著關(guān)鍵性作用［24］；TM2構(gòu)成了受體氯離子通道內(nèi)壁且TM2中的氨基酸殘基決定了受體對氯離子的選擇性，進(jìn)一步的研究表明TM2跨膜區(qū)域較多的蘇氨酸（T 306、311、312、315、317、318和321）和絲氨酸（S 307，320），將有利于氯離子在通道內(nèi)的流動［25］；TM3-TM4之間有一個大的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其上包含了許多潛在的磷酸化位點(diǎn)，因而它是受體磷酸化調(diào)節(jié)的主要區(qū)域［24］。其次，GABA A受體γ2亞基包含1個氯離子門控超級家族胞外共有結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域主要位于N端，是長鏈的親水區(qū)域，在GABA A受體形成過程中，親水性氨基末端大量N糖基化部位（N- 53、130和248）形成了各種配體（GABA等激動劑和苯二氮卓類配體）的結(jié)合部位［26］。本研究還發(fā)現(xiàn)位于N端的胞外結(jié)構(gòu)域其上的3個N糖基化位點(diǎn)在不同物種間都發(fā)生于相同的氨基酸殘基處，這一結(jié)果同王秀坤等［27］所得結(jié)論相一致。

4 結(jié)論

本研究首次克隆得到了異育銀鯽GABA A受體γ2 亞基基因全長序列，并對其進(jìn)行了詳細(xì)的位點(diǎn)分析和結(jié)構(gòu)域預(yù)測，填補(bǔ)了國內(nèi)外在該研究領(lǐng)域的空缺。同時，γ2 亞基全長基因克隆為異育銀鯽體內(nèi)GABA A受體其他亞基基因克隆提供參照，推動魚類受體研究的發(fā)展，為進(jìn)一步探討GABA A受體在漁藥安全性評價和新型漁藥開發(fā)等方面的研究與應(yīng)用提供奠定基礎(chǔ)。

［1］ 謝怡， 沈閱， 徐亞歐， 等. 癲癇患者額葉及顳葉腦組織A型GABA受體α1亞型基因表達(dá)定量研究［J］. 中國科學(xué)C輯：生命科學(xué)， 2009（9）：904-907.

［2］ Gangisetty O， Reddy D S. The optimization of TaqMan real-time RTPCR assay for transcriptional profiling of GABA-A receptor subunit plasticity［J］. Journal of Neuroscience Methods， 2009， 181（1）：58-66.

［3］ Hosie AM， Wilkins ME， Smart TG， et al. Neurosteroid binding sites on GABAAreceptors［J］. Pharmacology & Therapeutics， 2007. 116（1）：7-19.

［4］ Korpi ER， Gründer G， Lüddens H， et al. Drug interactions at GABAAreceptors［J］. Progress in Neurobiology， 2002. 67（2）：113-159.

［5］ Fritschy J， Brünig I. Formation and plasticity of GABAergic synapses：physiological mechanisms and pathophysiological implications［J］. J Med Chem， 2004. 47（24）：5829-5832.

［6］ Mark SC， John RA， Robert WC， et al. An orally bioavaialable，functionally selective inverse agonist at the benzodiazepine site of GABAA 5 receptoes with congnition enhancing properties［J］. Progress in Neurobiology， 2002， 67（2）：113-159.

［7］ Mascia MP， Biggio F， Mancuso L， etal. Changes in GABA（A）receptor gene expression induced by withdrawal of， but not by longterm exposure to， ganaxolone in cultured rat cerebellar granule cells［J］. J Pharmacol Exp Ther， 2002， 303（3）：1014-1020.

［8］ Benke D， Honer M， Michel C， et al. GABAAreceptor subtypes differentiated by their γ subunit variants：prevalence， pharmacology and subunit architecture［J］. Neuropharmacology， 1996， 35（9-10）：1413-1423.

［9］ Somogyi P， Fritschy JM， Benke D， et al. The gamma 2 subunit of the GABAAreceptor is concentrated in synaptic junctions containing the alpha 1 and beta 2/3 subunits in hippocampus， cerebellum and globus pallidus［J］. Neuropharmacology， 1996， 35（9-10）：1425-1444.

［10］ 李艷芳. 新生大鼠反復(fù)驚厥對腦內(nèi)價氨基丁酸A受體γ2亞單位表達(dá)的影響［D］. 長沙：中南大學(xué)， 2008.

圖5 不同物種GABA A受體 γ2亞基的系統(tǒng)進(jìn)化樹

［11］ Bowser DN， Wagner DA， Czajkowski C， et al. Altered kinetics and benzodiazepine sensitivity of a GABAAreceptor subunit mutation［γ2（R43Q）］found in human epilepsy［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99：15170-15175.

［12］ Chou IC， Lee CC， Tsai CH， et al. Association of GABRG2 polymorphisms with idiopathic generalized epilepsy［J］. Pediatr Neurol，2007， 36（1）：40-44.

［13］ Subramaniam JR， Corsi L， Vicini S， et al. Ribozyme-mediated reduction of the GABA（A）receptor alpha1 subunit［J］. Molecular Brain Research， 2001， 92（1-2）：149-156.

［14］ Mu W， Burt DR. Transcriptional regulation of GABA receptor γ2 subunit gene［J］. Brain Res Mol Brain Res， 1999， 67（1）：137-147.

［15］ Baulac S， Huberfeld G， Gourfinkel-An I， et al. First genetic evidence of GABA（A）receptor dysfunction in epilepsy：a mutation in the gamma2-subunit gene［J］. Nat Genet， 2001， 28（1）：46-48.

［16］ Whiting PJ. GABA-A receptor subtypes in the brain：a paradigm for CNS drug discovery？［J］. Drug Discovery Today， 2003， 8（10）：445-450.

［17］ Whiting PJ. The GABAAreceptor gene family：new opportunities for drug development. Curr Opin Drug Discov Devel［J］. Curr Opin Drug discov Devel， 2003， 6（5）：648-657.

［18］ Clément Y. Structural and pharmacological aspects of the GABA receptor：Involvement in behavioral pathogenesis［J］. Journal of Physiology， Paris， 1996， 90：1-13.

［19］ Korpi ER， Sinkkonen ST. GABA（A）receptor subtypes as targets for neuropsychiatric drug development［J］. Pharmacol Ther，2006， 109（1-2）：12-32.

［20］ 陳笑霞， 李艷芬， 龍?zhí)斐? 南方鲇延髓面葉氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量研究［J］. 廣州大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版， 2010， 9（5）：88-91.

［21］ 程章， 聶湘平， 王芳， 等. 阿部鯔鰕鯱P450 1A1克隆與分析［J］. 水生生物學(xué)報， 2009， 33（4）：782-788.

［22］ 李冰， 王杰， 張成鋒， 等. 建鯉催乳素受體基因全長cDNA的克隆、序列分析與組織表達(dá)［J］. 中國水產(chǎn)科學(xué)， 2013， 20（4）：722-732.

［23］ 付立志， 徐進(jìn)宜， 吳曉明， 等. γ-氨基丁酸受體及相關(guān)藥物研究進(jìn)展［J］. 中國醫(yī)療前沿， 2007， 2（8）：35-37.

［24］ Peran M， Hooper H， Rayner SL， et al. GABAAreceptor 1 and 6 subunits mediate cell surface anchoring in cultured cells［J］. Neurosci Lett， 2004， 364（2）：67-70.

［25］ Sarto I， Wabnegger L， Dogl E， et al. Homologous sites of GABAAreceptor alpha1， beta3 and gamma2 subunits are importantfor assembly［J］. Neuropharmacology， 2002， 43（4）：482-491.

［26］ Sieghart W. Structure， pharmacology， and function of GABAAreceptor subtypes［J］. Adv Pharmacol， 2006， 54：231-263.

［27］ 王秀坤， Nielsen M. GABAA受體藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］. 國外醫(yī)學(xué). 藥學(xué)分冊， 2001， 28（1）：29-34.

（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Bioinformatics Analysis of GABA A Receptor γ2 Subunit Gene in Carassais auratus gibebiol

Zhao Yini1Hu Kun1Sun Qi1，2Yang Xianle1Ruan Jiming1Zhou Ailing1
（1. State Collection Center of Aquatic Pathogen，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；2. Delon Hi-Tech Ltd.，Shanghai 201414）

The application of the specificity of GABA receptor subunits in drug screening and drug development got widely attention recently， of which three function subunits α1， β2 and γ2 studied deeply. Furthermore， Carassais auratus gibebiol as its good growth and reproduction had been widely farmed in china. In the present study， we cloned and characterized GABA A receptor γ2 subunit full-length gene. The full-length Carassais auratus gibebiol GABA A receptor γ2 subunit cDNA was 2 763 bp in length， contained a 1437 bp open reading frame（ORF）， and encoded 477 amino acids which constituting a 55.3 kD protein molecule with an isoelectric point of 9.13. The γ2 subunit protein was hydrophilic. The protein sequence had one signal peptide， consisting of 35 amino acid residue. The sequence of amino acids contained four transmembrane regions， which length of 23，20，23 and 23 aa， involving in electronic transfer catalysis between the internal and external membrane. We found three N-glycosylation sites， two O- glycosylation sites and an extracellular domain which had obvious ligand-gated ion channels' characteristics. Sequence comparison revealed that the similarity of the γ2 subunit protein all above 89% with other aquatic animals showed that it belongs to GABA A receptor subunits' family. We conducted a phylogenetic analysis using the neighbor joining（NJ）method. The evolutionary tree showed that the γ2 subunit protein was clustered with the zebra fish which indicated that they are the two most closely related species.

Carassais auratus gibebiol；GABA-A receptor γ2 subunit；cloning；bioinformatics analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.028

2014-08-29

國家科學(xué)自然基金項(xiàng)目（31172430），“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2011AA10A216），公益性農(nóng)業(yè)行業(yè)專項(xiàng)項(xiàng)目（201203085）

趙依妮，女，碩士研究生，研究方向：魚類藥物受體，藥物代謝動力學(xué)；E-mail：zhaoyini21@126.com

楊先樂，男，教授，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病的防治；E-mail：xlyang@shou.edu.cn