黑曲霉檸檬酸工業(yè)菌株原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化

張曉立鄭小梅滿云羅虎于建東鄭平劉浩孫際賓

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308；3.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308；4.中糧生物化學(xué)（安徽）股份有限公司，蚌埠 233010）

黑曲霉檸檬酸工業(yè)菌株原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化

張曉立1，3鄭小梅2，3滿云4羅虎4于建東2，3鄭平2，3劉浩1孫際賓2，3

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308；3.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308；4.中糧生物化學(xué)（安徽）股份有限公司，蚌埠 233010）

黑曲霉是檸檬酸工業(yè)化生產(chǎn)的主要發(fā)酵菌株。盡管現(xiàn)代遺傳操作技術(shù)在黑曲霉的實(shí)驗(yàn)室菌株、蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌株等的應(yīng)用中獲得了成功，但是檸檬酸工業(yè)菌株遺傳轉(zhuǎn)化異常困難，成為檸檬酸工業(yè)持續(xù)升級(jí)的重要限制因素。以檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用的黑曲霉菌株為研究對(duì)象，對(duì)其原生質(zhì)體的制備與再生以及PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化等條件進(jìn)行了細(xì)致優(yōu)化。結(jié)果表明，檸檬酸高產(chǎn)工業(yè)菌株原生質(zhì)體的制備需選取豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h的年輕菌絲體，在1.5%裂解酶-0.5%蝸牛酶-0.2%溶菌酶的復(fù)合酶解體系下裂解2.5 h，原生質(zhì)體的制備濃度可達(dá)106個(gè)/mL以上，原生質(zhì)體再生效率可達(dá)90%以上。原生質(zhì)體的濃度是原生質(zhì)體-PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法的關(guān)鍵，當(dāng)原生質(zhì)體濃度達(dá)到106個(gè)/mL以上時(shí)，高產(chǎn)檸檬酸菌株的轉(zhuǎn)化效率大幅提高。成功建立了由原生質(zhì)體-PEG所介導(dǎo)的高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌株的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

黑曲霉；檸檬酸；遺傳操作系統(tǒng)；原生質(zhì)體；DNA轉(zhuǎn)化

檸檬酸是生物體代謝活動(dòng)中重要的中間產(chǎn)物［1］，也是在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的有機(jī)酸之一［2，3］。全球每年生產(chǎn)和消耗檸檬酸1.5×106t以上，黑曲霉是檸檬酸生產(chǎn)的主力菌種。但高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌株由于經(jīng)歷了長(zhǎng)期的誘變篩選過程，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和遺傳可能發(fā)生了未知的變化，遺傳轉(zhuǎn)化困難。至今為止，黑曲霉高產(chǎn)檸檬酸工業(yè)菌株的分子遺傳操作尚無文獻(xiàn)報(bào)道。為提升檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)的競(jìng)爭(zhēng)力，急需建立黑曲霉工業(yè)菌株的遺傳轉(zhuǎn)化和操作體系。

黑曲霉常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法與其他絲狀真菌一樣，包括孢子電轉(zhuǎn)化法［8］、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法［9］、原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法等。Meyer 等［10］對(duì)這些轉(zhuǎn)化方法的利弊進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，認(rèn)為孢子電轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率低。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化雖具有轉(zhuǎn)化受體形式多樣、轉(zhuǎn)化效率較高、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定、可轉(zhuǎn)移大片段、單拷貝比例高等優(yōu)點(diǎn)，但其操作復(fù)雜，周期長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化過程受多種因素影響［9］。 Michielse等［11］也明確指出農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法在黑曲霉中的轉(zhuǎn)化效率較低。原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法包括原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)化法與原生質(zhì)體-PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法。姚婷婷等［12］在產(chǎn)酶的黑曲霉菌株中原生質(zhì)體-PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率更高。原生質(zhì)體-PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法也在不同野生型菌株或淀粉酶等黑曲霉生產(chǎn)菌株中得到成功實(shí)踐，如野生菌株A. niger NCIM565［13］與A. niger N402［14］、淀粉酶生產(chǎn)菌株A. niger CICIM F0410［12］與A. niger T21［15］等。由此可見，原生質(zhì)體-PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法對(duì)黑曲霉菌株而言是較為有效的遺傳操作方法。

本研究以高產(chǎn)檸檬酸的工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際使用的黑曲霉菌株為研究對(duì)象，通過優(yōu)化培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式、菌齡、酶解體系與酶解時(shí)間等研究其原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件，建立檸檬酸高產(chǎn)菌株原生質(zhì)體-PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，旨在為高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及黑曲霉工業(yè)菌株改造奠定基礎(chǔ)。同時(shí)本研究對(duì)其他遺傳操作困難的絲狀真菌的分子改造具有一定借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)使用的黑曲霉菌株：由中糧生物化學(xué)（安徽）股份有限公司提供，經(jīng)過基因組測(cè)序分析鑒定，為由野生黑曲霉菌株Aspergillus niger D多輪誘變的A. niger Co827的衍生菌株。

用于遺傳轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒pGm：來源于文獻(xiàn)［16］，攜帶有amdS的篩選標(biāo)記，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 工具酶和試劑 工具酶：α-淀粉酶（30 U/μL）購(gòu)自諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；來源于木霉的細(xì)胞裂解酶購(gòu)自Sigma；溶菌酶購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蝸牛酶購(gòu)自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司。試劑：培養(yǎng)基配制及原生質(zhì)體制備所需試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）產(chǎn)孢培養(yǎng)基：黑曲霉專用固體培養(yǎng)基90 g/L；

（2）合成培養(yǎng)基Czapek-Dox（CD）：參照文獻(xiàn)［14］配置；

（3）豐富培養(yǎng)基（CMA）：葡萄糖20 g/L，麥芽糖浸提物20 g/L，蛋白胨1 g/L；

（4）檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基（FC）：玉米粉200 g/L，α-淀粉酶（30 U/μL）300 μL/L，CaCl21 g/L；

（5）篩選培養(yǎng)基：上層培養(yǎng)基MMSA：乙酰胺0.59 g/L，CsCl 3.4 g/L，KCl 0.52 g/L，KH2PO41.52 g/L，山梨醇1.2 mol/L，微量元素1 mL/L，葡萄糖 10 g/L，MgSO40.5g/L，1%低熔點(diǎn)瓊脂糖；下層培養(yǎng)基MMS：成分與MMSA相同，1%瓊脂糖。

微量元素：FeSO4·7H2O 1 g/L，ZnSO4·7H2O 8.8 g/L，CuSO4·5H2O 0.4 g/L，MnSO4·H2O 0.1 g/L，Na2B4O7·10H2O 0.1 g/L，（NH4）6Mo7O24·4H2O 0.05 g/L。

（6）原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基：上層培養(yǎng)基MMSA+NaNO3：NaNO30.6 g/L，CsCl 3.4 g/L，KCl 0.52 g/L，KH2PO41.52 g/L，山梨醇1.2 mol/L，微量元素1 mL/L（如篩選培養(yǎng)基MMS所列，不再贅述），葡萄糖 10 g/L，MgSO40.5g/L，1%低熔點(diǎn)瓊脂糖。

下層培養(yǎng)基MMS+NaNO3：成分與MMSA+NaNO3相同，1%瓊脂糖。

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體制備 檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)菌株在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上34℃培養(yǎng)6 d收集孢子并用含0.05%（V/V）Tween-80的生理鹽水［0.9%（W/V）NaCl］制備孢子懸液（107個(gè)/mL）。取適量的孢子懸液接種到200 mL豐富培養(yǎng)基CMA或合成培養(yǎng)基Czapek-Dox或檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基FC中，孢子接種的終濃度為105個(gè)/mL，在旋轉(zhuǎn)式搖床34℃，250 r/min的條件下?lián)u瓶液體振蕩培養(yǎng)不同時(shí)間。培養(yǎng)方式還采用液體靜止培養(yǎng)，或在液體搖瓶振蕩培養(yǎng)基中加入適量0.5 mm的玻璃珠。

采用八層紗布過濾收集菌絲球，然后用200 mL無菌蒸餾水清洗菌絲球，再用50 mL 溶液I（5 mmol/L K2HPO4、5 mmol/L KH2PO4、0.8 mol/L MgSO4，pH5.5）除去殘留的培養(yǎng)基，并使菌絲球處于溶液I的狀態(tài)下。將1 g菌絲球 加入到20 mL采用不同細(xì)胞裂解酶配比的細(xì)胞壁裂解液（以溶液I為基底緩沖液）中，在旋轉(zhuǎn)式搖床30℃，200 r/min的條件下分別對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行不同時(shí)間的裂解處理。用3層無菌高級(jí)擦鏡紙過濾菌絲球裂解液收集原生質(zhì)體，加入20 mL的溶液II（10 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L CaCl2、1.2 mol/L山梨醇，pH7.5）輕輕混勻后，3 000×g離心5 min，棄上清液，再用30 mL溶液II洗滌原生質(zhì)體沉淀2次。最后將原生質(zhì)體沉淀重懸于500 μL溶液II中，即為黑曲霉的原生質(zhì)體懸液，可用于原生質(zhì)體的再生與轉(zhuǎn)化。

1.2.2 原生質(zhì)體再生 原生質(zhì)體再生采用雙層平板法，首先在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板對(duì)原生質(zhì)體懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，取100 μL原生質(zhì)體懸液用溶液II進(jìn)行適當(dāng)稀釋。以MMS+NaNO3作底層培養(yǎng)基，以含1%低熔點(diǎn)瓊脂糖的MMSA+NaNO3與0.1 mL 原生質(zhì)體稀釋液混合作上層培養(yǎng)基，置30℃ 培養(yǎng)3-4 d，對(duì)形成的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)（A）。為消除由未除盡的菌絲片段再生出的菌落所造成的誤差，同時(shí)采用雙層平板法將原生質(zhì)體置于未添加滲透壓穩(wěn)定劑MgSO4的MMS+NaNO3培養(yǎng)基，其再生菌落數(shù)作為對(duì)照（B）。顯微鏡下觀察的原生質(zhì)體數(shù)計(jì)為（C）。再生率用下式計(jì)算：原生質(zhì)體再生率=［（A-B）/C］×100%。

1.2.3 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 取100 μL原生質(zhì)體懸液，加入10 μg的高純度質(zhì)粒（質(zhì)粒濃度應(yīng)在1 μg/μL以上），再加入25 μL現(xiàn)用現(xiàn)配的溶液III（50%（W/V）PEG-4000、1 mmol/L CaCl2、10 mmol/L Tris-HCl，pH7.5），輕輕顛倒混勻，冰浴20 min，取出后緩緩加入1 mL 溶液III，2 mL 溶液II，輕輕顛倒混勻，將其與42℃孵育后以乙酰胺為唯一氮源的MMSA上層篩選培養(yǎng)基（1%低熔點(diǎn)瓊脂糖）混勻后，平鋪于下層MMS篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5-7 d。

2 結(jié)果

2.1 原生質(zhì)體制備與再生

2.1.1 培養(yǎng)基對(duì)原生質(zhì)體形成與再生的影響 在接種量與培養(yǎng)條件相同的條件下，將檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)菌株在CMA培養(yǎng)基、FC培養(yǎng)基與CD培養(yǎng)基上培養(yǎng)，采用相同方法制備原生質(zhì)體，考察培養(yǎng)基種類對(duì)原生質(zhì)體形成和再生的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD培養(yǎng)基中菌絲球生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)48 h后菌絲長(zhǎng)度僅有10-20 μm左右，總菌體生物量較低，難以進(jìn)行原生質(zhì)體的制備；在CMA培養(yǎng)基及FC培養(yǎng)基中，菌絲球生長(zhǎng)迅速，菌絲細(xì)而長(zhǎng)，培養(yǎng)48 h后菌絲長(zhǎng)度可達(dá)80-120 μm左右，總菌體生物量較大；CMA培養(yǎng)基中菌絲球較密實(shí)，F(xiàn)C培養(yǎng)基中菌絲球較疏松（圖1）。使用FC培養(yǎng)基的情況下獲得的原生質(zhì)體數(shù)量達(dá)5.5×106個(gè)/mL，再生率為74.5%；使用CMA培養(yǎng)基形成的原生質(zhì)體數(shù)量為2.5×106個(gè)/mL，其再生率高達(dá)92%。結(jié)果表明，使用不同的培養(yǎng)基對(duì)菌絲球形態(tài)、原生質(zhì)體的形成數(shù)量與再生率具有顯著影響。綜合考慮，CMA培養(yǎng)基為原生質(zhì)體制備與再生的最佳培養(yǎng)基。

2.1.2 菌絲體培養(yǎng)方式對(duì)原生質(zhì)體形成的影響 菌絲體培養(yǎng)方式影響黑曲霉菌球形態(tài)，分別考察了液體靜止培養(yǎng)、液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶加玻璃珠培養(yǎng)對(duì)原生質(zhì)體形成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，液體靜止培養(yǎng)時(shí)菌體漂浮在液體表面，菌體呈球狀聚集，菌體量較少；液體搖瓶加玻璃珠培養(yǎng)菌絲體呈球狀，菌絲斷裂，玻璃珠不僅沒有把較大的菌絲球分解，反而對(duì)菌體有一定的損傷，制備的原生質(zhì)體數(shù)目與再生率較低，分別為0.28×106個(gè)/mL、82.1%；液體搖瓶培養(yǎng)菌絲體呈球狀，菌體量較大，菌絲細(xì)長(zhǎng)，菌球相對(duì)疏松，原生質(zhì)的數(shù)目為1.95×106個(gè)/mL，再生率較高為92.3%。因此，液體搖瓶培養(yǎng)是原生質(zhì)體制備的最佳菌體培養(yǎng)方式。

2.1.3 菌齡對(duì)原生質(zhì)體形成與再生的影響 為考察不同菌齡的菌絲球?qū)υ|(zhì)體制備與再生的影響，本試驗(yàn)選取菌齡為36 h、48 h、60 h、72 h的菌絲球進(jìn)行原生質(zhì)體的制備。如圖2-A所示，不同生長(zhǎng)時(shí)期的菌絲球?qū)υ|(zhì)體數(shù)量影響較大。菌齡為48 h的菌絲球酶解2.5 h獲得的原生質(zhì)體數(shù)最高，達(dá)到6.5×106個(gè)/mL，而培養(yǎng)時(shí)間更短或更長(zhǎng)的菌絲球獲得的原生質(zhì)體數(shù)量都有幾倍的降低，表明適度培養(yǎng)時(shí)間的幼嫩菌絲的細(xì)胞壁更易被酶解釋放出原生質(zhì)體。同樣原生質(zhì)體的再生率在菌齡48 h時(shí)達(dá)到最高（圖2-B），為98%；隨著菌齡的增長(zhǎng)，原生質(zhì)體再生率沒有明顯變化，均超過90%。

圖1 檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)黑曲霉菌株在不同培養(yǎng)基中菌絲球形態(tài)

圖2 培養(yǎng)時(shí)間-菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備（A）與再生（B）的影響

2.1.4 酶解體系與濃度對(duì)原生質(zhì)體形成的影響 為研究檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)黑曲霉菌株的最佳酶解體系，采用不同的酶解體系對(duì)CMA培養(yǎng)基液體搖瓶培養(yǎng)48 h的菌絲球進(jìn)行原生質(zhì)體的制備。結(jié)果（表1）表明，用不同配比的酶解液來酶解菌絲球均可獲得原生質(zhì)體，但是效果不同。當(dāng)裂解酶、蝸牛酶與溶菌酶以不同的方式組合時(shí)，其裂解效果均比裂解酶單酶裂解效果好。其中裂解酶的濃度是關(guān)鍵，1.5%（W/V）高濃度的裂解酶比1%（W/V）濃度的裂解酶裂解效果好?？傮w來看，1.5%裂解酶、0.5%蝸牛酶與0.2%溶菌酶的酶解體系原生質(zhì)體的制備效果最好，達(dá)3.2×106個(gè)/mL。

表1 不同酶解體系對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

2.1.5 酶作用時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成與再生的影響 為研究檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)黑曲霉菌株的最佳酶解時(shí)間，采用1.5%裂解酶、0.5%蝸牛酶、0.2%溶菌酶的酶解體系對(duì)CMA培養(yǎng)基液體搖瓶培養(yǎng) 48 h的菌絲球進(jìn)行原生質(zhì)體的制備與再生檢測(cè)。結(jié)果（圖3）表明，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體數(shù)逐漸增加，2.5 h 達(dá)到最高為1.84×106個(gè)/mL。同時(shí)2.5 h時(shí)原生質(zhì)體的再生率也達(dá)到最高為96.7%。酶解時(shí)間超過2.5 h后，原生質(zhì)體的制備效率與再生率出現(xiàn)明顯的下降。因此，高產(chǎn)檸檬酸生產(chǎn)菌株的原生質(zhì)體制備與再生的最佳酶解時(shí)間為2.5 h，并且酶解后應(yīng)盡快除去酶解液，以防止過度裂解，降低原生質(zhì)體的制備與再生效率。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備（A）與再生效率（B）的影響

2.1.6 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 采用PEG-4000-CaCl2介導(dǎo)的化學(xué)轉(zhuǎn)化法將帶有amdS篩選標(biāo)記的質(zhì)粒pGm轉(zhuǎn)化至檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)黑曲霉菌株的原生質(zhì)體中。結(jié)果表明，隨著原生質(zhì)體數(shù)量的增加，轉(zhuǎn)化率也相應(yīng)的增加，當(dāng)原生質(zhì)體數(shù)目達(dá)106個(gè)/mL時(shí)，轉(zhuǎn)化率為3-4個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg DNA。

3 討論

近年來隨著傳統(tǒng)誘變技術(shù)對(duì)高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉工業(yè)菌株的生產(chǎn)性能提升效果越來越有限，建立有效的遺傳操作系統(tǒng)，通過分子改造提升菌株生產(chǎn)性能引起了人們的重視。本研究從培養(yǎng)基、菌絲培養(yǎng)方式、菌齡、酶解體系與酶解時(shí)間等不同方面對(duì)高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌株的原生質(zhì)體-PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了系統(tǒng)探索，建立了高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系。

菌球形態(tài)是影響高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌株原生質(zhì)體制備的一個(gè)重要因素。前期研究發(fā)現(xiàn)具有不同菌體形態(tài)的產(chǎn)檸檬酸的不同黑曲霉菌株，其原生質(zhì)體制備的效果差異較大。例如，黑曲霉野生型菌株菌球疏松，菌絲細(xì)長(zhǎng)，形成的原生質(zhì)體數(shù)量多；相反檸檬酸高產(chǎn)菌株菌球密實(shí)，菌絲短粗，形成的原生質(zhì)體數(shù)量較少，不易于原生質(zhì)體的制備，這可能是由于菌絲體與酶解體系接觸表面積小造成的。

因此提出在保證一定菌體量的前提下，影響菌絲形態(tài)的因素，如培養(yǎng)基與培養(yǎng)方式，都會(huì)顯著影響原生質(zhì)體的形成與再生。本研究發(fā)現(xiàn)，CMA與FC培養(yǎng)基盡管都能夠使菌體大量快速生長(zhǎng)以保證原生質(zhì)體制備所需的菌體量，但是培養(yǎng)的菌體形態(tài)存在較大不同。在FC培養(yǎng)基中菌絲細(xì)長(zhǎng)，菌球疏松，獲得的原生質(zhì)體數(shù)多，可達(dá)到5.5×106個(gè)/mL；而在CMA培養(yǎng)基中菌球較密實(shí)，形成的原生質(zhì)體數(shù)量較少為2.5×106個(gè)/mL，該結(jié)果從原生質(zhì)體制備的結(jié)果來看，菌絲細(xì)長(zhǎng)，菌球疏松比較利于原生質(zhì)體的制備，與朱萍等［17］報(bào)道一致。而合成培養(yǎng)基CD因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)成分不足導(dǎo)致菌絲量較少，顯然不滿足原生質(zhì)體制備需要。

液體靜置培養(yǎng)方式盡管因?yàn)楣┭跸鄬?duì)不足導(dǎo)致黑曲霉菌球相對(duì)松散，但由于生長(zhǎng)過于緩慢，達(dá)不到原生質(zhì)體制備所需的生長(zhǎng)量，因而不適合；在液體搖瓶中加玻璃珠有助于菌體分散，然而我們發(fā)現(xiàn)玻璃珠將細(xì)長(zhǎng)菌絲打斷，反而降低了原生質(zhì)體制備與再生效率。在本試驗(yàn)體系中液體搖瓶培養(yǎng)的效果更好。

本研究認(rèn)為影響原生質(zhì)體形成與再生的另一個(gè)主要因素是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與組成成分。其中一個(gè)表現(xiàn)是菌齡對(duì)原生質(zhì)體的制備與再生影響顯著。我們發(fā)現(xiàn)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)48 h菌體的原生質(zhì)體制備和再生效果最好，培養(yǎng)36 h的菌體在原生質(zhì)體形成和再生方面都是最差的，而超過60 h的菌體盡管形成原生質(zhì)體的數(shù)量低，但對(duì)再生效率影響小。這可能是由于不同生長(zhǎng)階段的菌絲的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與組成成分不同［12］，對(duì)裂解酶系的敏感性不同，形成的原生質(zhì)體數(shù)目及原生質(zhì)體再生能力也就不同。過于幼嫩的菌絲雖然細(xì)胞壁容易被酶解，但是相對(duì)細(xì)胞膜也容易破裂，因而得到原生質(zhì)體的產(chǎn)量低；即使能形成原生質(zhì)體，但也可能由于細(xì)胞膜不夠完整或者細(xì)胞活力不強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞再生難度大。而菌齡過長(zhǎng)的菌體細(xì)胞壁會(huì)沉積不宜被酶降解的物質(zhì)，不利于原生質(zhì)體的形成與釋放［18］，原生質(zhì)體的形成數(shù)量減少，但其細(xì)胞結(jié)構(gòu)可能相對(duì)完整且細(xì)胞活力強(qiáng)，因而對(duì)原生質(zhì)體再生影響小。

有研究表明黑曲霉原生質(zhì)體得率與酶解體系組成及配比關(guān)系密切。 Hamlyn等［19］就曾報(bào)道使用微生物產(chǎn)生的酶復(fù)合體或者商品酶的混合液制備原生質(zhì)體比單獨(dú)使用一種酶的效果好。本試驗(yàn)采用的混合酶系形成的原生質(zhì)體數(shù)量是文獻(xiàn)報(bào)道［12］的2倍。各種酶的濃度配比和酶解時(shí)間需要根據(jù)特定菌株的細(xì)胞特性進(jìn)行優(yōu)化，原則是既有利于原生質(zhì)體的釋放，又不要過度酶解降低原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。原生質(zhì)體的濃度和再生率對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響較大［20，21］。周禮紅等［21］發(fā)現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)化效率需要合適的原生質(zhì)體濃度，本研究中高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌株原生質(zhì)體的濃度只有達(dá)到106個(gè)/mL以上，轉(zhuǎn)化效率才顯著提高，低于此濃度則難以獲得轉(zhuǎn)化子。由此可見，由于高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌株經(jīng)過復(fù)雜誘變，細(xì)胞壁組成與結(jié)構(gòu)復(fù)雜，制備高濃度可再生的原生質(zhì)體是能夠成功完成DNA轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。

4 結(jié)論

首次成功建立了以原生質(zhì)體-PEG法介導(dǎo)的檸檬酸生產(chǎn)菌株黑曲霉的遺傳轉(zhuǎn)化體系。以豐富培養(yǎng)基（CMA）液體搖瓶培養(yǎng)48 h的菌絲體，采用1.5%裂解酶-0.5%蝸牛酶-0.2%溶菌酶的復(fù)合酶解體系酶解2.5 h后，可獲得高質(zhì)量原生質(zhì)體并可成功進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化，為檸檬酸工業(yè)黑曲霉菌株的分子改造奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Preparation of Protoplast for Efficient DNA Transformation of Citric Acid Hyper-producing Aspergillus niger Industrial Strain

Zhang Xiaoli1，3Zheng Xiaomei2，3Man Yun4Luo Hu4Yu Jiandong2，3Zheng Ping2，3Liu Hao1Sun Jibin2，3
（1. School of Biological Engineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308；3. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）；4. COFCO Biochemical（Anhui）Co.，Ltd.，Bengbu 233010）

Aspergillus niger is the major industrial strain for citric acid production. In spite of many successes of modern molecular biology approaches in engineering laboratory or protein-producing strains of A. niger， there is few positive report on its application for citric acid industrial strains mainly due to the hard-to-transform nature of these strains. In this study， the protoplast-PEG mediated genetic transformation system for citric acid industrial strain was extensively studied， suggesting an optimized protocol for protoplast preparation， regeneration and DNA transformation. The concentration of protoplasts reached up to 106/mL by lysing younger mycelia for 2.5 h after 48 h incubation of a proper amount of conidia spores in enrichment medium. The optimal lysing enzyme mixtures comprised of 1.5% lysing enzyme， 0.5% snail enzyme and 0.2% lysozyme. Concentration of protoplast influenced the protoplast-PEG mediated transformation efficiency， which reached the maximal when the concentration of protoplast was higher than 106/mL. The genetic transformation system established in this study should pave the way to molecular biology study of the citric acid hyper-producing strains， for further understanding its acid-tolerant physiology and for rational design of the industrial strain for further improvement of the citric acid production process as well as creation of new organic acid-producing cell factories.

Aspergillus niger；citric acid； genetic manipulation system；protoplast；DNA transformation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.025

2014-09-23

國(guó)家“863”計(jì)劃（2013AA020302），國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31370113）

張曉立，女，碩士研究生，研究方向：輕工技術(shù)與工程；E-mail：xiaolizhang0607@sina.com；鄭小梅為本文并列第一作者，E-mail：zheng_xm@tib.cas.cn

孫際賓，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：微生物代謝工程與系統(tǒng)生物技術(shù)；E-mail：sun_jb@tib.cas.cn