豬胰臟羧肽酶轉(zhuǎn)酯功能和耐酸抗蛋白酶特性研究

馮士元 孫同韋 牟慧艷 張會(huì)圖 路福平

（天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津　300457）

豬胰臟羧肽酶轉(zhuǎn)酯功能和耐酸抗蛋白酶特性研究

馮士元 孫同韋 牟慧艷 張會(huì)圖 路福平

（天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

羧肽酶（carboxypeptidase）是一類(lèi)可水解肽鏈C末端氨基酸殘基的蛋白酶，可用作飼料添加劑，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)。豬胰臟中含有一種羧肽酶A1（CPA1），該酶除能水解蛋白質(zhì)外，還能分解油脂。CPA1在以酪蛋白和橄欖油為底物時(shí)，比活力分別為53.14 U/mg和22.4 U/mg；經(jīng)過(guò)pH2.0酸性環(huán)境和胰蛋白酶處理后，其酶活殘留率分別為95.65%和78.14%。結(jié)果表明，CPA1具有轉(zhuǎn)酯功能和耐酸抗蛋白酶特性。

羧肽酶A1；轉(zhuǎn)酯功能；耐酸抗蛋白酶

因生理發(fā)育尚未成熟，幼齡畜禽消化能力弱，消化吸收飼料中營(yíng)養(yǎng)成分能力低，從而影響生長(zhǎng)［1］。飼料中添加外源酶可有效解決該問(wèn)題。水解酶是催化水解反應(yīng)酶的總稱，是提高飼料消化率和利用率的重要酶之一［2］。如飼料中添加脂肪酶可促進(jìn)脂肪的消化，釋放出更多中鏈脂肪酸，還可促進(jìn)脂溶性維生素等的吸收，提高飼料轉(zhuǎn)化率［3］。除脂肪酶外，蛋白水解酶也可用作飼料添加劑，可催化多肽或蛋白質(zhì)的水解，釋放氨基酸，提高飼料中蛋白的消化吸收率，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)［4］。羧肽酶（Carboxypeptidases，CPs）是蛋白水解酶類(lèi)，能從肽鏈的C端逐個(gè)降解、釋放游離氨基酸［5］。將其添加在飼料中，能提高牲畜消化能力。但因CPs在動(dòng)物胃中的酸性環(huán)境及內(nèi)源消化酶（胃蛋白酶和胰蛋白酶）環(huán)境中存留時(shí)間較長(zhǎng)，其穩(wěn)定性受到較大影響［6，7］。雖可使用適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑降低這種影響，但有時(shí)因加工時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高仍會(huì)嚴(yán)重破壞其催化活性［8］。

為了滿足CPs不斷發(fā)展的應(yīng)用需求，對(duì)于CPs特性提出更高的要求，尤其是耐酸性、抗蛋白酶特性。此特性可使CPs在無(wú)穩(wěn)定劑保護(hù)下順利通過(guò)胃

收到日期：2014-12-17

有報(bào)道稱，羧肽酶A1（CPA1）具備耐酸抗蛋白酶特性。此外，該酶除能夠水解蛋白質(zhì)外，還能水解油脂，具備轉(zhuǎn)酯功能。在以橄欖油為底物時(shí)，CPA1能催化油脂分解成游離脂肪酸。此功能使其催化底物范圍明顯大于只有單一催化活性的CPs。作為一種高效生物催化劑，酶具有專(zhuān)一性，不同的底物需要不同的酶催化分解。因飼料中含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，使用單一酶制劑難以達(dá)到理想的效果［16］。解決該問(wèn)題方法較多，其中一種是獲得具有多功能催化特性的酶制劑。在酸性環(huán)境下，絲氨酸羧肽酶具有末端蛋白水解酶、酯酶和脫酰胺酶的活性［19］。CPA1屬于金屬羧肽酶家族，CPA1具有多功能催化活性，且還具有耐酸抗蛋白酶特性，添加在飼料中能加快營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收利用，降低飼養(yǎng)成本。并有報(bào)道稱豬CPA1基因已能在畢赤酵母表達(dá)，這為豬CPA1的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)［14］。針對(duì)此特點(diǎn)，結(jié)合模擬胃腸道模型的方法，本實(shí)驗(yàn)采用pH2.0緩沖液模擬畜禽胃酸環(huán)境，40 U/mL胰蛋白酶模擬腸道內(nèi)源消化酶環(huán)境［13］，分別檢測(cè)CPs的耐酸、抗蛋白酶特性。并對(duì)該酶水解蛋白特性和轉(zhuǎn)酯功能特性進(jìn)行較為細(xì)致的研究，對(duì)其耐酸抗蛋白酶特性進(jìn)行研究，以期為今后該酶進(jìn)一步研究和使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 羧肽酶粗酶液的制備 取成年家豬新鮮胰臟500 g，攪肉機(jī)攪碎，與2-3倍體積pH7.0、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液混合，高速組織搗碎機(jī)中打碎，離心去殘?jiān)?，取上清粗酶?℃保存。

1.1.2 試劑與儀器 實(shí)驗(yàn)中所用p-Nitrophenyl acetate、p-Nitrophenyl butyrate、p-Nitrophenyl decanoate、p-Nitrophenyl myristate、p-Nitrophenyl palmitate購(gòu)自Sigma-Aldrich。豬胰蛋白酶購(gòu)自生物工程（上海）股份有限公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。AKTA purifier購(gòu)自通用電氣醫(yī)療集團(tuán)。HiTrap Q HP，5í5 mL購(gòu)自GE Healthcare Life Sciences。

1.1.3 溶液 0.2 mol/L Na2HPO4（甲液）：稱取Na2HPO428.4 g，用蒸餾水溶解并定容至1 000 mL。

0.2 mol/L NaH2PO4（乙液）：稱取NaH2PO424 g，用蒸餾水溶解并定容至1 000 mL。

50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）：吸取甲液81 mL，乙液19 mL，即成為0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液。使用時(shí)用ddH2O稀釋4倍，即成為50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，校正pH值為7.0。

20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）：吸取甲液81 mL，乙液19 mL，即成為0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液。使用時(shí)用ddH2O稀釋10倍，即成為20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，校正pH值為7.0。

1 mol/L NaCl溶液：稱取58.5 g NaCl，加水800 mL，至全部溶解，定容至1 000 mL。

底物p NPB溶液：取p NPB溶解于10 mL異丙醇中，配置成3 mg/mL底物溶液。4℃保存。

2%聚乙烯醇溶液：稱取20 g聚乙烯醇，加水900 mL，沸水中加熱攪拌，直至全部溶解，冷卻后定容至1 000 mL。

橄欖油乳化液：取橄欖油與2%聚乙烯醇溶液以1∶3的比例混合，高速組織勻漿機(jī)10 000 r/min乳化6 min，分3次進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 羧肽酶活性的測(cè)定

1.2.1.1 Folin顯色法 取1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，37℃水浴預(yù)熱1 min，加入1 mL 1%酪蛋白溶液，37℃水浴保溫10 min，迅速加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸終止反應(yīng)，室溫靜置15 min，10 000 r/min離心10 min，取上清1 mL，置于試管中，加入5 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液及1 mL福林酚工作液，測(cè)定680 nm吸光度。對(duì)照在加入酪蛋白溶液前先加入三氯乙酸，其余條件相同。將每分鐘水解酪蛋白釋放1 μg酪氨酸的酶量定義為一個(gè)蛋白酶活力單位［17］。

1.2.1.2 橄欖油滴定法 取4 mL橄欖油乳化液加入到5 mL 50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中（pH7.0），并加入1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，在37℃，100 r/min震蕩條件下反應(yīng)15 min，加入10 mL 95%乙醇終止反應(yīng)。用0.05 mol/L NaOH滴定樣品生成的脂肪酸，計(jì)算消耗NaOH的量。酶活單位的定義：在37℃，pH7.0的條件下，樣品水解油脂每分鐘釋放1 μmol游離脂肪酸所需的酶量為一個(gè)活力單位（U）。

1.2.1.3 分光光度法 將p NPB溶液與50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）以1∶9混合，吸取2.7 mL上述混合液，加入300 μL適當(dāng)稀釋過(guò)的酶液，37℃反應(yīng)15 min，用3 mL 95%乙醇終止反應(yīng)，在410 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品溶液的吸光值。酶活單位的定義：在37℃，pH7.0的條件下，樣品水解4-硝基苯丁酸酯（p NPB）每分鐘釋放1 μmol對(duì)硝基苯酚（p NP）所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.2 蛋白濃度測(cè)定 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定采用Bradford法［18］，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.3 離子交換層析 使用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）平衡HiTrap Q柱，排除氣泡，在恒定低溫操作下，適當(dāng)稀釋的粗酶液以恒定流速通過(guò)蠕動(dòng)泵流過(guò)層析柱，后利用1 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫樣品，測(cè)定酶活和蛋白質(zhì)濃度。

1.2.4 羧肽酶水解蛋白特性的檢測(cè)

1.2.4.1 最適反應(yīng)pH 使用pH6.0-12.0 50 mmol/L的緩沖液（pH6.0-8.0 NaH2PO4/Na2HPO4緩沖液、pH9.0-12.0 硼酸-硼酸鈉緩沖液）配置1%酪蛋白溶液，按照Folin顯色法測(cè)定CPA1的殘余活力。以殘余酶活最大值pH下的酶活力為100%，計(jì)算其他pH條件下的相對(duì)活力。

1.2.4.2 pH穩(wěn)定性 利用pH2.0-8.0的緩沖液（pH2.0-3.0 甘氨酸-HCl緩沖液、pH4.0-5.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液、pH6.0-8.0 NaH2PO4/Na2HPO4緩沖液）0℃下處理酶液1 h，在最適溫度和pH下，按照Folin顯色法測(cè)定酶活，以殘余酶活最大值pH下的酶活力為100%，計(jì)算其他pH值下的相對(duì)活力。

1.2.4.3 最適反應(yīng)溫度 將CPA1酶液在最適pH、不同溫度下（10℃-70℃）反應(yīng)，采用Folin顯色法測(cè)定其最適反應(yīng)溫度。將酶活最高值溫度下的酶活力為100%，計(jì)算其他溫度下酶的相對(duì)活力。

1.2.4.4 熱穩(wěn)定性 將CPA1酶液分別在30℃-80℃保溫1 h，在最適溫度和pH條件下，F(xiàn)olin顯色法測(cè)定殘余酶活力以分析其溫度穩(wěn)定性。以0℃保溫的CPA1酶活力為100%，計(jì)算不同溫度下的相對(duì)活力。

1.2.5 羧肽酶轉(zhuǎn)酯功能特性的檢測(cè)

1.2.5.1 底物特異性的測(cè)定 分別將不同碳鏈的脂肪酸酯（p-Nitrophenyl acetate、p-Nitrophenyl butyrate、p-Nitrophenyl decanoate、p-Nitrophenyl myristate、p-Nitrophenyl palmitate）溶解于異丙醇，均配制成3 mg/mL底物溶液。在37℃，pH7.0，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中分別測(cè)定CPA1在這5種底物下的活性。以測(cè)定活性最大值底物下的酶活力為100%，計(jì)算其他底物下酶的相對(duì)活力。

1.2.5.2 最適反應(yīng)pH 在pH2.0-8.0 50 mmol/L的緩沖液（配置同“1.2.4.2”）中，利用分光光度法測(cè)定CPA1的殘余活力。以殘余酶活最大值pH下的酶活力為100%，計(jì)算其他pH條件下的相對(duì)活力。

1.2.5.3 pH穩(wěn)定性 利用pH2.0-8.0的緩沖液0℃處理酶液1 h，在最適溫度和pH下，利用分光光度法測(cè)定酶活，以殘余酶活最大值pH下的酶活力為100%，計(jì)算其他pH值下的相對(duì)活力。

1.2.5.4 最適反應(yīng)溫度 將CPA1酶液在最適pH、不同溫度下（10℃-70℃）反應(yīng)，采用分光光度法測(cè)定其最適反應(yīng)溫度。將酶活最高值溫度下的酶活力為100%，計(jì)算其他溫度下酶的相對(duì)活力。

1.2.5.5 熱穩(wěn)定性 將CPA1酶液分別在30℃-80℃保溫1 h，最適溫度和pH條件下用分光光度法測(cè)定殘余酶活力分析其溫度穩(wěn)定性。以0℃保溫的CPA1酶活力為100%，計(jì)算不同溫度處理后的相對(duì)活力。

1.2.5.6 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 用不同濃度的p-Nitrophenyl butyrate（0.5-8 mmol/L）為底物，采用分光光度法測(cè)酶活性，根據(jù)米氏方程V=Vmax×［S］/（Km+［S］），用雙倒數(shù)法作圖。即以酶促反應(yīng)的倒數(shù)1/V對(duì)底物濃度的倒數(shù)1/［S］做一直線，根據(jù)其斜率及截距計(jì)算Km、Vmax和Vcat。

1.2.6 羧肽酶耐酸抗蛋白酶特性檢測(cè)

1.2.6.1 耐酸性檢測(cè) 將適當(dāng)稀釋的CPA1酶液在pH2.0甘氨酸-鹽酸緩沖液中，37℃保溫1 h，以1∶4的比例將混合液與pH7.0的磷酸鹽緩沖液混合，37℃保溫20 min，采用分光光度法測(cè)定其活性。對(duì)照以pH7.0的磷酸鹽緩沖液代替pH2.0甘氨酸-鹽酸緩沖液，其他條件相同，設(shè)定對(duì)照活性為100%，計(jì)算樣品相對(duì)活性。

1.2.6.2 抗蛋白酶特性檢測(cè) 將適當(dāng)稀釋CPA1酶液在pH7.0的磷酸鹽緩沖液中，37℃保溫1 h，以1∶4的比例將混合液與含胰蛋白酶40 U/mL，pH7.0的磷酸鹽緩沖液混合，37℃保溫20 min，采用分光光度法測(cè)定其活性。對(duì)照未經(jīng)胰蛋白酶處理，其他條件相同，設(shè)定對(duì)照活性為100%，計(jì)算樣品相對(duì)活性。同時(shí)另取適當(dāng)稀釋的CPA1酶液分別在含有0、10、20、30、40、50、60、70和80 U/mL的胰蛋白酶的pH7.0磷酸鹽緩沖液中，37℃熱處理60 min，將混合液進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析，觀察條帶的變化，以未經(jīng)胰蛋白酶處理的CPA1酶樣作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 豬胰腺羧肽酶A1的分離純化

經(jīng)過(guò)離子交換層析條件優(yōu)化，結(jié)合橄欖油滴定法確定30%鹽（1 mol/L NaCl溶液）梯度洗脫樣品具有活性（Peak2），直接經(jīng)過(guò)磷酸鹽緩沖液沖洗下來(lái)的蛋白雜峰（Peak1）和60%及100%高鹽梯度洗脫下來(lái)的蛋白雜峰（Peak3和Peak4）均不含活性（圖1）。收集Hitrap Q陰離子交換柱純化有活性樣品，經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果為單一蛋白條帶，其表觀分子量為（34±1）kD（圖2）。綜合其活性及蛋白濃度測(cè)定結(jié)果得知其比活力為22.4 U/mg。對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜分析，并與NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（圖3）顯示其與豬胰腺CPA1相似性最高。

2.2 CPA1催化特性

圖1 離子交換層析

圖2 粗酶液和純化后酶液的SDS-PAGE分析

圖3 質(zhì)譜分析比對(duì)結(jié)果

2.2.1 CPA1雙功能催化活性 CPA1除能夠水解酪蛋白外，還能水解橄欖油中的油脂。CPA1在以酪蛋白和橄欖油為底物時(shí)，比活力分別為53.14 U/mg和 22.4 U/mg。說(shuō)明CPA1除具有蛋白酶活性外，還具有轉(zhuǎn)酯功能。但橄欖油成分復(fù)雜，含有多種碳鏈脂肪酸甘油酯。脂肪酶和酯酶均可催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。酯酶催化水解短碳鏈的酯類(lèi)（C＜10）；脂肪酶能夠水解長(zhǎng)碳鏈的酯類(lèi)（C＞10）［19］。為探究CPA1轉(zhuǎn)酯活性底物特異性，本研究以含不同碳鏈脂肪酸酯為底物對(duì)其鑒定。結(jié)果（圖4）顯示，CPA1對(duì)碳鏈長(zhǎng)度小于10的脂肪酸酯的催化活性高于碳鏈長(zhǎng)度大于10的，且在以4-硝基苯丁酸酯（C4）為底物的情況下，CPA1的活性明顯高于其他碳鏈作為底物時(shí)CPA1的活性，表明CPA1轉(zhuǎn)酯活性催化底物種類(lèi)與酯酶相近。測(cè)定了CPA1以p-Nitrophenyl butyrate為底物時(shí)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明，K m=5.075 μmol/mL，V max=0.0134 μmol/mL·min，K cat=8.25 μmol/mg·min。

圖4 CPA1的底物特異性

2.2.2 最適反應(yīng)pH CPA1轉(zhuǎn)酯活性在pH2.0-6.0之間較低，處于緩慢上升趨勢(shì)，至pH6.0時(shí)，其活性僅為最大活性的20%。CPA1轉(zhuǎn)酯活性最適反應(yīng)pH為7.4，而其蛋白酶活性最適反應(yīng)pH為7.6。但pH為6.0時(shí)，CPA1蛋白酶活性維持在70%，結(jié)果高于其轉(zhuǎn)酯活性。pH繼續(xù)上升，CPA1的蛋白酶活性和轉(zhuǎn)酯活性均下降。但其蛋白酶活性下降緩慢，至pH10.0時(shí)，仍有60%的活性，而其轉(zhuǎn)酯活性在pH8.0時(shí)已降至50%（圖5）。結(jié)果表明，CPA1的蛋白酶活性和轉(zhuǎn)酯活性最適pH大致相同。

圖5 CPA1最適反應(yīng)pH

2.2.3 pH穩(wěn)定性 CPA1經(jīng)不同pH緩沖液預(yù)處理1 h，結(jié)果（圖6）表明，在pH3.0-7.0范圍內(nèi)穩(wěn)定，酶活力均保持在90%以上。pH2.0的條件下處理1 h，CPA1的酶活力仍大于75%；pH8.0的堿性條件下處理1 h，CPA1的轉(zhuǎn)酯活性和蛋白酶活性均下降，但其轉(zhuǎn)酯活性下降較快，活性降至75.7%。結(jié)果表明，CPA1的pH穩(wěn)定性寬泛，在酸性條件下可穩(wěn)定存在。

圖6 CPA1經(jīng)不同pH緩沖液處理1 h后的穩(wěn)定性

2.2.4 最適反應(yīng)溫度 CPA1的蛋白酶和轉(zhuǎn)酯活性的最適反應(yīng)溫度均為35℃，且二者10℃-40℃均具有較高活力（＞50%）。溫度高于50℃時(shí)，CPA1蛋白酶活性下降緩慢，至70℃時(shí)維持在60%以上；CPA1轉(zhuǎn)酯活性開(kāi)始迅速下降，50℃時(shí)降至14.23%，至70℃時(shí)僅有5%。結(jié)果（圖7）表明，CPA1的蛋白酶活性和轉(zhuǎn)酯活性最適反應(yīng)溫度相同。相比于蛋白酶活性，CPA1轉(zhuǎn)酯活性受溫度影響較大。

圖7 CPA1最適反應(yīng)溫度

2.2.5 熱穩(wěn)定性 CPA1經(jīng)不同溫度處理1 h后，其蛋白酶活性穩(wěn)定，即使是在80℃下溫浴1 h，其活性仍保持在80%以上。CPA1轉(zhuǎn)酯活性在30℃-50℃之間維持在80%以上，但當(dāng)溫度升至80℃時(shí)，酶活力降至64.4%。結(jié)果（圖8）表明，CPA1蛋白酶活性和轉(zhuǎn)酯活性均具有較高的熱穩(wěn)定性，但相比于蛋白酶活性，CPA1轉(zhuǎn)酯活性熱穩(wěn)定性較差。

圖8 CPA1在不同溫度下保溫1 h后的熱穩(wěn)定性

2.3 CPA1耐酸抗蛋白酶特性

模擬食糜在胃腸道消化，CPA1經(jīng)pH2.0酸性環(huán)境處理1 h（不添加胰蛋白酶），活性殘留95.65%；用pH7.0磷酸鹽緩沖液模擬腸道中性環(huán)境，添加胰蛋白酶40 U/mL處理20 min，CPA1活性降至78.14%。結(jié)果表明，CPA1的耐酸性較強(qiáng)，對(duì)胰蛋白酶存在抵抗能力。為檢驗(yàn)CPA1 的穩(wěn)定性，采用不同活性胰蛋白酶（0、10、20、30、40、50、60、70和80 U/mL），并對(duì)其進(jìn)行1 h處理。將處理后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，在（34±1）kD處均檢測(cè)到蛋白條帶，且條帶亮度基本一致（圖9），表明CPA1可抵抗較寬范圍活性的胰蛋白酶。此特性為CPA1在腸道內(nèi)發(fā)揮作用提供了保障。

圖9 CPA1經(jīng)不同活性胰蛋白酶處理后的SDS-PAGE分析

3 討論

CPs能分解蛋白質(zhì)，釋放游離氨基酸，因此在飼料中得到廣泛應(yīng)用，獲得性能優(yōu)良的CPs具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。目前，多數(shù)CPs對(duì)酸性環(huán)境和內(nèi)源消化酶敏感，而CPs發(fā)揮作用的前提是必須有一定活力的酶能夠達(dá)到其在消化道中的作用部位，在胃中強(qiáng)酸環(huán)境下保持活力且不被蛋白酶所破壞。因此CPs在酸性和內(nèi)源性消化酶環(huán)境中的穩(wěn)定性一直是影響其實(shí)際應(yīng)用的限制因素。哺乳動(dòng)物消化道內(nèi)CPs經(jīng)過(guò)酸性環(huán)境浸泡和消化酶降解，仍可幫助消化食物，具有催化活性［10］，是很好的耐酸抗蛋白酶CPs來(lái)源。研究表明，酶催化活性與其結(jié)構(gòu)和構(gòu)象相關(guān)，蛋白質(zhì)從無(wú)規(guī)則卷曲折疊成特定的功能型三維結(jié)構(gòu)［20］，獲得其催化活性。本實(shí)驗(yàn)從豬胰臟中分離得到了一種CPA1，耐酸特性檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)pH2.0酸性環(huán)境處理后，活性殘留95.65%；CPA1轉(zhuǎn)酯活性pH穩(wěn)定性結(jié)果顯示，CPA1經(jīng)pH2.0緩沖液處理1 h，酶活為78.7%。CPA1轉(zhuǎn)酯活性在30℃-40℃具有較高的熱穩(wěn)定性，酶活維持在95%以上，同時(shí)以未經(jīng)熱處理的CPA1的活性為100%（0℃保存），所以CPA1經(jīng)0℃和35℃處理后，其活性差別較小，可忽略。因此，CPA1經(jīng)強(qiáng)酸環(huán)境處理后結(jié)果的不同與中性環(huán)境保溫處理有關(guān)，CPA1活性經(jīng)強(qiáng)酸處理后造成的損失可在中性環(huán)境中重新獲得。因此推測(cè)pH的變化導(dǎo)致CPA1結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化，進(jìn)而導(dǎo)致其催化活性的變化。同時(shí)CPA1最適反應(yīng)pH結(jié)果顯示，其在pH2.0-6.0的酸性環(huán)境中基本無(wú)活性，直至pH7.0時(shí)，CPA1活性迅速由pH2.0的18.6%上升至93.73%。因此可進(jìn)一步推測(cè)CPA1經(jīng)酸性環(huán)境處理時(shí)，其三級(jí)結(jié)構(gòu)解體，導(dǎo)致該酶基本失去活性。該酶被轉(zhuǎn)移至中性環(huán)境后，CPA1迅速?gòu)臒o(wú)規(guī)則卷曲折疊轉(zhuǎn)換成原本功能性立體結(jié)構(gòu)，因此重新獲得其催化活性。要確定推測(cè)是否正確，下一步需對(duì)CPA1采用不同pH緩沖液處理，并借助熒光光譜法等技術(shù)檢測(cè)CPA1蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象［21］，驗(yàn)證此推斷是否正確。

該酶除具有耐酸抗蛋白酶特性外，還具備雙功能催化特性。CPA1除能夠水解蛋白質(zhì)外還能夠水解油脂，具備轉(zhuǎn)酯功能。CPA1屬于金屬羧肽酶家族，CPA1的催化需要Zn2+的參與。Zn2+被包圍在His69、His196、Glu72和水分子組成的四面體結(jié)構(gòu)中，形成CPA1催化活性中心。CPA水解肽鍵時(shí)，水分子被Zn2+極化，在與Glu270的共同作用下攻擊多肽鏈上易切開(kāi)的碳原子［22］。因CPA1同時(shí)具備蛋白酶活性和轉(zhuǎn)酯功能，所以推測(cè)該酶催化活性中心也可作用于酯鍵，催化酯類(lèi)物質(zhì)的水解。下一步實(shí)驗(yàn)應(yīng)驗(yàn)證CPA1轉(zhuǎn)酯能力催化原理推測(cè)結(jié)果。研究方法較多，如使用二胺四乙酸（EDTA）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、β-巰基乙醇等蛋白酶抑制劑對(duì)CPA1進(jìn)行處理，觀察其轉(zhuǎn)酯活性的變化，從而判斷CPA1催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的活性中心結(jié)構(gòu)。

本實(shí)驗(yàn)從家豬胰臟中獲得CPA1，該酶既具有多功能催化特性，還具有較強(qiáng)的耐酸抗蛋白酶特性。豬在中國(guó)分布較為廣泛，品種也多種多樣，如民豬、陸川豬和寧鄉(xiāng)豬等［23］。對(duì)動(dòng)物源CPs的研究，除豬外，還有牛和鼠等［9］。因哺乳動(dòng)物消化食物過(guò)程較為相似，推測(cè)其他來(lái)源CPs同樣具備耐酸抗蛋白酶等優(yōu)良特性，需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

CPA1既能水解蛋白質(zhì)，也可水解油脂；具有較高的耐酸抗蛋白酶特性和較高的熱穩(wěn)定性。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

A Study on Transesterification and Acid-resistant Antiprotease of Carboxypeptidase in Porcine Pancreas

Feng Shiyuan Sun Tongwei Mou Huiyan Zhang Huitu Lu Fuping
（Tianjinn Key Laboratory of Industrial Microbiology，Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin300457）

Carboxypeptidase is a kind of protease that cleaves the peptide bond of an amino acid residue at the C-terminal end. It can be used in feed additives， and promotes the growth of livestock and poultry. A carboxypeptidase A1（CPA1）was obtained from porcine pancreas，and it can hydrolyze proteins and decompose oils. It showed the specific activity as 53.14 U/mg and 22.4 U/mg when casein and olive oil used as substrate， respectively. The CPA1’s relative activity reached 95.65% and 78.14% respectively after the treatment of pH2.0 acidic and trypsin. The results indicate that the CPA1 has the function of transesterification and the feature of distinct acid-resistant antiprotease.

carboxypeptidase A1；function of transesterification；acid-resistant antiprotease

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.028

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2013AA102803）

馮士元，碩士研究生，研究方向：微生物與生化藥學(xué)；E-mail：tianjinfsy123@163.com

路福平，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：微生物與分子生物學(xué)；E-mail：lfp@tust.edu.cn部酸性環(huán)境，避免因加工對(duì)其活性的破壞。因此，獲得具有耐酸、抗蛋白酶特性的CPs是目前的研究熱點(diǎn)之一。CPs主要來(lái)源于微生物、植物和哺乳動(dòng)物［9］。哺乳動(dòng)物來(lái)源CPs由胰腺分泌至消化道后，經(jīng)酸性食糜浸泡和內(nèi)源消化酶降解后仍可幫助消化食物，具有催化活性［10］，所以推測(cè)其具有耐酸、抗蛋白酶特性。有關(guān)耐酸抗蛋白酶特性檢測(cè)的報(bào)道較多，如可利用模擬胃腸道模型［11］，篩選具備耐酸、抗蛋白酶特性的木聚糖產(chǎn)生菌；采用人體胃腸道模型檢測(cè)微生態(tài)菌株Lactobacillus acidophilus對(duì)胃酸和蛋白酶的抗逆能力［12］。哺乳幼崽消化器官不發(fā)達(dá)，消化機(jī)能不完善，如仔豬出生時(shí)胃內(nèi)僅有凝乳酶，胃蛋白酶很少，且因胃底腺部缺乏游離鹽酸，胃蛋白酶基本沒(méi)有活性，而腸腺和胰腺發(fā)育較完善，胰蛋白酶活性較高［1］。哺乳動(dòng)物胰臟中富含CPs，且有關(guān)來(lái)源于豬胰腺中CPs的報(bào)道較多。如趙瑩［14］從豬胰臟中獲得羧肽酶A，并將其基因在畢赤酵母中進(jìn)行了外源表達(dá)；王福清等［15］報(bào)道了豬胰羧肽酶B的提取工藝和該酶的穩(wěn)定性。