蘇云金芽胞桿菌LTS290菌株抑制鐮孢菌的作用

周國(guó)旺 李玉紅 張圓 李海濤 劉榮梅 高繼國(guó)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱　150030）

蘇云金芽胞桿菌LTS290菌株抑制鐮孢菌的作用

周國(guó)旺 李玉紅 張圓 李海濤 劉榮梅 高繼國(guó)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

旨在擴(kuò)大蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）的生防范圍，通過對(duì)BtLTS290菌株的對(duì)峙培養(yǎng)和菌株無菌發(fā)酵液對(duì)鐮孢菌的抑制作用進(jìn)行研究。結(jié)果表明，BtLTS290菌株可抑制6種馬鈴薯致病鐮孢菌的生長(zhǎng)，并且BtLTS290無菌發(fā)酵液的抑菌效果顯著。抑菌物質(zhì)對(duì)溫度不敏感，經(jīng)過121℃處理 20 min后仍然具有抑菌活性。在pH3-11范圍內(nèi)存放12 h 后，抑菌活性變幅不大，并且用蛋白酶K處理后其抑菌活性依然存在。實(shí)驗(yàn)證明蘇云金芽胞桿菌BtLTS290是一株可以高效抑制馬鈴薯致病鐮孢菌的生防菌株。

蘇云金芽胞桿菌；馬鈴薯干腐??；鐮孢菌；抑菌活性；生防菌株

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種能產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs）的革蘭氏陽性細(xì)菌［1，2］，ICPs主要由cry基因和cyt基因編碼，并具有廣譜的殺蟲活性［3］，且一種晶體蛋白可以對(duì)一種或多種害蟲具有殺蟲活性［4］。Bt殺蟲劑有毒力高、對(duì)人畜與天敵安全、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)［5，6］。目前，全世界幾十個(gè)國(guó)家已廣泛使用Bt 制劑，用于農(nóng)業(yè)害蟲的生物防治［7］。

長(zhǎng)期以來由真菌引起的植物病害十分普遍且日趨嚴(yán)重，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的損失。其中由鐮孢菌屬（Fusarium）真菌引起的馬鈴薯干腐病尤為常見，已嚴(yán)重影響馬鈴薯的生產(chǎn)。馬鈴薯干腐病是馬鈴薯儲(chǔ)藏期的主要病害之一［8］，據(jù)報(bào)道，每年因馬鈴薯鐮孢菌干腐病導(dǎo)致的產(chǎn)量損失可達(dá)6%-25%，窖貯損失率高達(dá)60%，該病害已成為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸問題［9］。為了拓展Bt在生防領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，國(guó)內(nèi)外早已開始對(duì)Bt抑制Fusarium進(jìn)行研究。2008年韓苗苗等［10］發(fā)現(xiàn)Bt519-1菌株對(duì)禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）和尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）具有抑制作用。2013年Akram等［11］發(fā)現(xiàn)Bt199菌株可以誘導(dǎo)多種方式抵御尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）。2014年Rocha等［12］證明蘇云金芽胞桿菌庫斯塔克亞種（B. thuringiensis subsp. kurstaki）菌株對(duì)輪狀鐮孢菌（Fusarium verticillioides）具有很好的抑制作用。

針對(duì)大多數(shù)蘇云金芽胞桿菌對(duì)真菌抑制作用不高的弱勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)篩選獲得一株可以高效抑制鐮孢菌的菌株BtLTS290，本研究首次對(duì)該菌株在抑制鐮孢菌生長(zhǎng)及抑菌物質(zhì)理化性質(zhì)等方面進(jìn)行測(cè)試分析，旨在為Bt在抑制鐮孢菌作用上的進(jìn)一步研究及應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 蘇云金芽胞桿菌BtLTS290菌株，由本實(shí)驗(yàn)室分離自從吉林采集的土壤樣品。供試病原真菌：從黑龍江各地區(qū)分離的馬鈴薯干腐病的6種致病菌，腐皮鐮孢菌［Fusarium solani（Mart.）］、擬絲孢鐮孢菌（Fusarium trichothecioides Wollenw）、燕麥鐮孢菌［Fusarium avenaceum（Corda & Fr.）Sacc］、接骨木鐮孢菌（Fusarium sambucinum Fuckel）、茄病鐮孢菌（Fusarium solani）和擬枝孢鐮孢菌（Fusarium sporotrioides Sherb），由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物教研室李鳳蘭老師饋贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 液體LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 L，pH7.0。

固體LB培養(yǎng)基：在液體LB培養(yǎng)基中加13 g/L的瓊脂。固體1/2LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、瓊脂13 g、蒸餾水1 L，pH7.0。

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 L，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 L，pH7.2。

1.2 方法

1.2.1 BtLTS290菌株晶體形態(tài)觀察 方法及具體步驟參照文獻(xiàn)［13］。

1.2.2 菌落對(duì)峙法測(cè)定抑真菌生物活性 在內(nèi)徑9 cm的PDA培養(yǎng)皿距中心2.5 cm的4個(gè)對(duì)稱點(diǎn)接種活化的Bt菌株，培養(yǎng)24 h后，分別在培養(yǎng)皿中央接種直徑8 mm的馬鈴薯干腐病菌菌餅，重復(fù)3次，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4 d 后，觀察并測(cè)量抑菌效果，計(jì)算R值，即抑菌圈直徑與菌落直徑之比。同時(shí)用解剖針分別挑取正常生長(zhǎng)的真菌菌絲和被抑制的真菌菌絲于載玻片上，載玻片上預(yù)先滴一滴無菌蒸餾水，然后輕輕蓋好蓋玻片，盡量控制氣泡產(chǎn)生，把制好的玻璃片放在高倍顯微鏡下觀察。

1.2.3 Bt菌株無菌發(fā)酵液的制備 將凍存管中儲(chǔ)存的BtLTS290在LB平板上劃線活化［14］，30℃培養(yǎng)12 h后，挑取單菌落接入裝有5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，30℃、180 r/min下培養(yǎng)12 h。取1 mL活化菌液接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d。同時(shí)取1 mL液體LB培養(yǎng)基接入裝有100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中作為對(duì)照，30℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d。之后，將發(fā)酵菌液在4℃、8 000 r/min下離心20 min，收集上清液經(jīng)細(xì)菌濾器（濾膜孔徑0.25 μm）過濾除菌，即得到無菌發(fā)酵液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Bt菌株無菌發(fā)酵液抑菌活性的測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法［15］，以供試的6種馬鈴薯干腐病致病菌為檢測(cè)菌，測(cè)定Bt 菌株發(fā)酵液中活性代謝產(chǎn)物的抑菌活性。將BtLTS290菌株的無菌發(fā)酵液1 mL與9 mL冷卻到45℃左右的PDA培養(yǎng)液混勻，倒入無菌的培養(yǎng)皿中制成培養(yǎng)基平板。待凝固后將供試病原真菌菌餅（8 mm）倒置放在平板中央，每處理3次重復(fù)，以9 mL PDA 培養(yǎng)液和1 mL未接菌的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照。將上述處理在25℃下培養(yǎng)4 d后，用十字交叉法測(cè)量供試菌菌落生長(zhǎng)直徑（mm），計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。計(jì)算公式：菌絲生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理后菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑- 8 mm）×100%。

1.2.5 Bt菌株抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生時(shí)間及穩(wěn)定性測(cè)定

1.2.5.1 Bt菌發(fā)酵時(shí)間 分別設(shè)1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0 d，共9個(gè)采樣點(diǎn)，測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液的抑菌活性。

1.2.5.2 熱穩(wěn)定性 取無菌發(fā)酵液分裝離心管中，分別置于水浴40℃、60℃、80℃、100℃、121℃加熱20 min，待自然冷卻后，測(cè)定各處理液的抑菌活性。

1.2.5.3 pH 穩(wěn)定性 取無菌發(fā)酵液50 mL，分別用1 mol/L的HCl 和1 mol/L 的NaOH 處理將其pH 值分別調(diào)至3、5、7、9、10和11，并于4℃冰箱中過夜，然后調(diào)回原pH約7.0左右，測(cè)定各處理液的抑菌活性。

1.2.5.4 抗蛋白酶K穩(wěn)定性 取離心管3 支，編號(hào)為1、2、3，1號(hào)和2號(hào)管中各裝入無菌發(fā)酵液10 mL，3號(hào)管中加入未接菌的發(fā)酵液10 mL，1號(hào)和3號(hào)管中分別加入蛋白酶K溶液（20 mg/mL）50 μL，充分混勻后，置于37℃下1 h，然后分別測(cè)定各處理液的抑菌活性。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，以燕麥鐮孢菌作為指示菌，以未接菌的發(fā)酵液作對(duì)照，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定各處理液的抑菌活性。

2 結(jié)果

2.1 晶體形態(tài)觀察

Bt菌株LTS290產(chǎn)生的晶體形態(tài)，光學(xué)顯微鏡（圖1-A）下箭頭所示，從左到右依次為球形晶體和芽胞；電鏡（圖1-B）中箭頭所指，從左到右依次為球形晶體和芽胞。

圖1 Bt野生菌株LTS290的光學(xué)顯微鏡圖（A）和電鏡晶體圖（B）

2.2 菌落對(duì)峙法測(cè)定抑真菌生物活性

Bt LTS290菌株對(duì)6種鐮孢菌都有抑制作用，僅以經(jīng)燕麥鐮孢菌為例，如圖2-A所示，計(jì)算BtLTS290菌株對(duì)燕麥鐮孢菌的抑制率R值，約為0.3。通過對(duì)燕麥鐮孢菌菌絲顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果（圖2-B，C）顯示，正常生長(zhǎng)的菌絲長(zhǎng)，且呈直線型生長(zhǎng)，而被抑制的菌絲短，并且變得彎曲，菌絲被抑制效果顯著。

2.3 Bt菌株無菌發(fā)酵液抑菌活性的測(cè)定

Bt LTS290無菌發(fā)酵液對(duì)6種鐮刀菌菌絲的生長(zhǎng)抑制如圖3所示，通過計(jì)算，結(jié)果表明Bt LTS290無菌發(fā)酵液對(duì)燕麥鐮孢菌和接骨木鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為91.38%和91.76%，而對(duì)其他供試鐮孢菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率在73%-87%之間。

圖2 BtLTS290菌株對(duì)黃色鐮刀菌的抑制作用

2.4 抑菌時(shí)間及穩(wěn)定性分析

2.4.1 發(fā)酵液中抑菌活性代謝產(chǎn)物產(chǎn)生時(shí)間 圖4表明，菌株Bt LTS290發(fā)酵1 d時(shí)未產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，在發(fā)酵3 d時(shí)抑菌物質(zhì)積累最多，對(duì)燕麥鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)抑制率最高，發(fā)酵時(shí)間3-4 d內(nèi)對(duì)燕麥鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)抑制率未見明顯變化，但4.5 d后發(fā)酵液的抑菌活性開始下降。

2.4.2 熱穩(wěn)定性 對(duì)菌株Bt LTS290無菌發(fā)酵液的熱耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵液的處理溫度為40-100℃時(shí)處理20 min時(shí)，發(fā)酵液上清仍然具有抑菌活性，并且抑菌活性基本不變，仍維持在90%左右。經(jīng)過121℃處理20 min后仍然具有抑菌活性，但抑菌活性明顯降低。

圖3 Bt LTS290無菌發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯干腐病6種致病鐮孢菌的抑菌作用

圖4 BtLTS290不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)燕麥鐮刀菌的抑菌活性

2.4.3 pH穩(wěn)定性 Bt LTS290無菌發(fā)酵液經(jīng)不同pH處理后，其穩(wěn)定性結(jié)果（圖5）表明，BtLTS290發(fā)酵液在pH3-11范圍內(nèi)均有抑菌活性，并且變化幅度不大，pH為7時(shí)抑菌活性最高。

圖5 Bt LTS290產(chǎn)抑菌物質(zhì)在不同pH值下的穩(wěn)定性

2.4.4 抗蛋白酶K的穩(wěn)定性 1號(hào)和2號(hào)處理的無菌發(fā)酵液對(duì)燕麥鐮孢菌都具有抑菌活性，并且測(cè)定數(shù)值非常接近。而3號(hào)未接菌的發(fā)酵液對(duì)燕麥鐮孢菌沒有抑制作用，說明BtLTS290菌株發(fā)酵液中的活性代謝產(chǎn)物對(duì)蛋白酶K具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

3 討論

蘇云金芽胞桿菌作為一種重要的生防細(xì)菌，主要用于農(nóng)業(yè)蟲害的防治。但隨著農(nóng)業(yè)和環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的需要，篩選出多功能 Bt 菌株變得尤為重要。

關(guān)于蘇云金芽胞桿菌抑真菌的報(bào)道非常多，但對(duì)于其抑真菌機(jī)制尚無明確報(bào)道［16］。本研究證明BtLTS290菌株對(duì)馬鈴薯干腐病鐮孢菌具有一定的抑制作用，由于PDA培養(yǎng)基以及培養(yǎng)的溫度不利于BtLTS290的生長(zhǎng)，抑菌圈不是十分明顯，但通過顯微鏡可以明顯觀察到鐮孢菌菌絲的生長(zhǎng)被嚴(yán)重抑制。由于未進(jìn)行更微觀的顯微結(jié)構(gòu)觀察，如孢子的萌發(fā)是否被抑制，因此有必要參照一些文獻(xiàn)［10，11］，對(duì)孢子的萌發(fā)程度進(jìn)行檢測(cè)。但BtLTS290的無菌發(fā)酵液對(duì)鐮孢菌菌絲的抑制率明顯，說明無菌發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)對(duì)鐮孢菌有很強(qiáng)的抑制作用。已報(bào)道的芽胞桿菌抑菌物質(zhì)種類很多，有細(xì)菌素、脂肽、小分子蛋白及幾丁質(zhì)酶等。目前關(guān)于幾丁質(zhì)酶的報(bào)道較多，幾丁質(zhì)酶不但對(duì)真菌的生長(zhǎng)有抑制作用，而且可以協(xié)同Cry毒素進(jìn)行殺蟲［17-19］。而對(duì)于BtLTS290無菌發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)是什么，我們并不十分清楚，但可以肯定的是此物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。因此，對(duì)于抑菌作用來源于何種物質(zhì)仍需進(jìn)一步深入研究。除此之外，對(duì)于BtLTS290菌株中何種cry基因編碼了晶體蛋白，可參考一些新基因的克隆方法進(jìn)行鑒定［20，21］。

4 結(jié)論

由本實(shí)驗(yàn)室分離得到的野生菌株BtLTS290對(duì)馬鈴薯干腐病致病鐮孢菌具有較好的抑制作用，尤其對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用明顯。以腐皮鐮孢菌、擬絲孢鐮孢菌、燕麥鐮孢菌、接骨木鐮孢菌、茄病鐮孢菌和擬枝孢鐮孢菌作為指示菌，測(cè)得BtLTS290菌株的無菌發(fā)酵液對(duì)這6種馬鈴薯干腐病致病鐮孢菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率均在73%-91%之間。對(duì)菌株BtLTS290所產(chǎn)的抑菌活性物質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其抑菌活性物質(zhì)對(duì)溫度不敏感，在pH3-11內(nèi)抑菌活性變化不大，并且對(duì)蛋白酶K不敏感，說明抑菌活性物質(zhì)具有良好的穩(wěn)定性。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

A Study of Bacillus thuringiensis Strain LTS290 Inhibiting Fusarium

Zhou Guowang Li Yuhong Zhang Yuan Li Haitao Liu Rongmei Gao Jiguo
（College of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin150030）

In oder to expand the biocontrol scope of Bacillus thuringiensis（Bt）， the inhibiting effects of confront culture and sterile fermented liquid of strain BtLTS290 on the growth of Fusarium were investigated. Results showed that BtLTS290 inhibited the growth of 6 strains of Fusarium， and the sterile fermented liquid of Bt had solid antibacterial effect. The fungistatic substances were not sensitive to temperature， and it still had the bacteriostatic activity for 20 min under 121℃. After storing 12 h while pH varied from 3 to 11， the range of antibacterial activity was not significantly changed. The bacteriostatic activity still existed after being treated with proteinase K. Conclusively， the work convinced that the BtLTS290 was a biocontrol strain that had efficient antagonistic activity against Fusarium of causing dry rot of potato.

Bacillus thuringiensis；dry rot of potato；Fusarium；bacteriostatic activity；biocontrol strain

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.022

2014-12-15

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)（2014ZX0800913B-002），國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金資助項(xiàng)目（J1210069），國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃課題（2011AA10A203），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31401812），黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（12521021）

周國(guó)旺，男，碩士，研究方向：生物防治微生物功能基因的發(fā)掘、研究和利用；E-mail：1449717662@163.com

高繼國(guó)，男，博士生導(dǎo)師，研究方向：生物大分子的分離純化，蘇云金芽胞桿菌抗性機(jī)理、生物安全性；E-mail：gaojiguo1961@hotmail.com