冠心病慢性心力衰竭患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的研究

王歡 胡元會 魏藝 賈岱琳 杜柏

摘要：目的測定冠心病慢性心力衰竭患者的免疫功能及血漿N端腦鈉肽前體（NTproBNP）水平，評價冠心病慢性心力衰竭的免疫激活狀態(tài)。方法收集2013年8月—2014年2月，中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院心內(nèi)科的住院患者125例，其中慢性心力衰竭患者93例，非心力衰竭患者32例。采用化學發(fā)光免疫方法測定血漿NTproBNP水平，流式細胞技術測定外周血 CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例。結果冠心病慢性心力衰竭患者血漿NTproBNP高于冠心病非心衰組，而外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例低于非心力衰竭組。結論冠心病慢性心力衰竭患者存在免疫激活狀態(tài)，且血漿NTproBNP水平隨NYHA心功能分級增加而升高。

關鍵詞：冠心病;慢性心力衰竭;N端腦鈉肽前體;CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞

中圖分類號：R541R256.2文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.16721349.2015.01.012

文章編號：16721349（2015）01003304

Study of Peripheral Blood CD4+ CD25+Foxp3+Treg Cell in Patients with Coronary Heart Disease and Chronic Heart Failure

Wang Huan，Hu Yuanhui，Wei Yi，Jia Dailin，Du Bai

Guanganmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China

Corresponding Author：Hu Yuanhui

Abstract：ObjectiveTo observe the immune function and plasma Nterminal proBtype natriuretic peptide （NTproBNP） levels，and to evaluate the state of immune activation in in patients with coronary heart disease（CHD） and chronic heart failure（CHF）.MethodsFrom August 2013 to February 2014 in department of cardiology of Guanganmen hospital of traditional Chinese academy， a total of 125 inpatients， of whom 93 patients with CHF，32 patients with nonheart failure were chosen.The level of plasma NTproBNP was determined by chemiluminescence immunoassay method.The peripheral blood CD4+ CD25+Foxp3+Treg cell ratio was measured by flow cytometry.ResultsThe levels of plasma NTproBNP in patients with CHF were higher than that in patients with nonheart failure.The peripheral blood CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in patients with CHF was lower than that in patients with nonheart failure.ConclusionThere is the presence of immune activation state in patients with CHF and the levels of plasma NTproBNP increase with increasing New York Heart Association （NYHA） functional class.

Key words：coronary heart disease;chronic heart failure;Nterminal proBtype natriuretic peptide;CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg cells

心力衰竭是各種心臟疾病發(fā)展至終末階段的一種綜合征。心力衰竭的發(fā)病機制十分復雜，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在心力衰竭患者的外周血中存在大量活化的炎癥因子且存在免疫激活[1]。本課題欲通過研究外周血調(diào)節(jié)性T細胞，以闡述慢性心力衰竭過程中的免疫激活狀態(tài)。

1資料與方法

1.1研究資料

1.1.1研究對象收集2013年8月—2014年2月，中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院心內(nèi)科的住院患者125例，其中慢性心力衰竭患者（CHF組）93例，男性45例，女性48例，年齡（71.09±3.97）歲;紐約心臟病學會（NYHA）Ⅱ級25例（男性13例，女性12例），年齡（66.36±7.81）歲;Ⅲ級35例（男性15例，女性20例），年齡（72.03±2.13）歲;Ⅳ級33例（男性15例，女性18例），年齡（70.76±4.12）歲。非心力衰竭患者（非CHF組）32例，男性14例，女性18例，年齡（67.90±4.43）歲，NYHA心功能為Ⅰ級。

1.1.2診斷標準

1.1.2.1冠心病診斷參照1979年國際心臟病學會和協(xié)會及衛(wèi)生組織臨床命名標準化聯(lián)合專題組頒布的《缺血性心臟病的命名及診斷標準》[2，3]，并結合冠狀動脈造影結果，采用標準Judkins法，以一支或以上冠狀動脈直徑狹窄≥50%判斷為陽性者[4]，或既往有心肌梗死病史。

1.1.2.2慢性心力衰竭診斷采用Framingham心力衰竭診斷標準[5]，參考2009年美國心臟病學會（ACC）及美國心臟協(xié)會（AHA）關于《成人慢性收縮性心力衰竭治療指南》[6]，參考彩色多普勒超聲心動圖，左室射血分數(shù)（LVEF）<50%[7]。

1.1.2.3心功能分級診斷參照1994年NYHA分級標準[8]。

1.1.3納入標準

1.1.3.1冠心病慢性心力衰竭患者納入標準符合冠心病并符合慢性心力衰竭診斷標準;年齡50歲～75歲;自愿參加試驗并簽署知情同意書。完全符合上述三項條件選擇納入。

1.1.3.2冠心病非心力衰竭患者納入標準符合冠心病診斷標準，心功能Ⅰ級患者;年齡50歲～75歲;自愿參加試驗并簽署知情同意書。完全符合上述三項條件選擇納入。

1.1.4排除標準臨床相關資料不完整;瓣膜性心臟?。L濕性心臟病，老年退行性心臟瓣膜病，肺心病者）;嚴重心律失常（頻發(fā)室性早搏，Ⅱ度Ⅱ型房室傳導阻滯，Ⅲ度房室傳導阻滯）;近3個月內(nèi)發(fā)生過不穩(wěn)定心絞痛或急性心肌梗死;惡性腫瘤;自身免疫性疾病;嚴重肝腎功能不全者;合并重度高血壓（收縮壓≥160 mmHg和/或舒張壓≥100 mmHg）;糖尿病及內(nèi)分泌疾病;急性、慢性感染或發(fā)熱;近3個月服用過影響免疫反應的中西藥物;精神疾病或行為不能自負;妊娠或哺乳期者;不愿參加試驗的患者。

1.1.5剔除標準無法判斷療效或資料不全影響療效判斷者;中途自動退出者。

1.2研究方法

1.2.1血液采集患者于入院后第2天，清晨空腹臥位狀態(tài)下，禁食12 h后，采集靜脈血4 mL置于肝素抗凝管內(nèi)，同時采集靜脈血2 mL置于EDTA試管內(nèi)，肝素抗凝管及EDTA抗凝管內(nèi)血液均于采血后30 min內(nèi)進行樣本處理。

1.2.2檢測方法

1.2.2.1外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的檢測取兩支Falcon試管，分別標記對照管和測定管。在對照管中分別加入Mouse IgG 110 ?μL并輕輕混勻;在測定管中分別加入CD4 20 μL、CD25 5 μL并輕輕混勻。在對照管和試驗管中各加入全血100 μL，輕輕混勻，室溫暗處孵育30 min，使表面抗原與抗體結合。在對照管和試驗管中各加入2 mL溶血素，室溫避光孵育10 min后，離心2 000 r/min，5 min，棄上清;再各管中加入2 mLPBS，離心2 000 r/min，5 min，棄上清。對照管和試驗管中各加入1 mL 1×Foxp3破膜/固定液，室溫避光孵育60 min進行破膜后，離心2 000 r/min，5 min，棄上清。在對照管和試驗管中各加入50 μL ?1×破膜劑后，對照管中加入5 μL Rat IgG2ak Foxp3同型，試驗管中加入5 μL Foxp3抗體，室溫避光孵育30 min后，每管中加入2 mL破膜劑，離心2 000 r/min，5 min，棄上清。對照管和試驗管中各加入500 ?μL×破膜劑，重懸，即刻上機檢測，共檢測CD4+細胞10 000個，CXPCytometer軟件分析數(shù)據(jù)，獲得待測標本的CD4+CD25+Foxp3+的熒光散點圖，對其進行統(tǒng)計分析。

1.2.2.2血漿NTproBNP的檢測調(diào)試PATHFAST化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，輸入編號信息。使用PATHFAST NTproBNP試劑管條，并按要求方向裝好試劑條。在樣本孔放入血漿樣品100 μL。把試劑架放入試劑槽內(nèi)。把樣本頭置入吸頭槽。合上前蓋，按下Start鍵。從樣本信息界面讀取檢測結果。

1.2.3統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用盲法，由第三方人員統(tǒng)計，所有試驗數(shù)據(jù)錄入計算機，采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，分類變量以百分比表示。若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性檢驗和滿足方差齊性檢驗，使用t檢驗或單因素的方差分析;計數(shù)資料比較使用卡方檢驗;相關性分析使用Spearmen相關性檢驗。以P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1一般資料CHF 組與對照組，經(jīng)獨立樣本t檢驗，在年齡、性別比例方面差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。NYHA不同心功能分級組間，經(jīng)方差分析檢驗，在年齡、性別方面無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2血漿NTproBNP及 CD4+CD25+Foxp3+水平（見表1）

2.3NYHA不同心功能分級患者血漿NTproBNP水平（見表 2）

由NYHA心功能分級與血漿NTproBNP的相關性檢驗得，Spearman r=0.777，P<0.01，兩者呈正相關，提示血漿NTproBNP水平隨NYHA分級增高而升高。

2.4NYHA不同心功能分級患者外周血CD4+CD25+Foxp3+水平（見表3）

由NYHA心功能分級與血漿CD4+CD25+Foxp3+水平的相關性檢驗得，Spearman r=-0.127，P>0.05，尚不能提示血漿CD4+CD25+Foxp3+水平隨NYHA分級增高而降低。

3討論

B型腦鈉肽是由心肌細胞合成的具有生物學活性的天然激素，主要在心室表達，同時也存在于腦組織中。NTproBNP和BNP同屬利鈉肽家族，BNP基因經(jīng)轉錄后生成含134個氨基酸的preproBNP，然后迅速裂解脫去含26個氨基酸的N端信號肽生成含108個氨基酸的proBNP，隨后再在內(nèi)切酶的作用下裂解為具有32個氨基酸的生物學活性的BNP和76個氨基酸的無生物學活性的NT proBNP[9]。而NTproBNP半衰期較長，在血液中水平較穩(wěn)定。BNP是一種天然的神經(jīng)激素， 其主要生物學活性包括舒張血管，促進尿鈉排泄、利尿[10]。BNP可以作為診斷心力衰竭及判斷預后的血漿標志物[11]。劉洪巖等[12]研究CHF患者血漿BNP水平與心功能的關系，選取90例CHF男性患者與90名健康男性作為研究對象，采用ELISA法測定血漿BNP水平，結果顯示CHF患者的血漿BNP水平顯著高于健康人，且BNP水平隨心功能的惡化而顯著升高。

調(diào)節(jié)性T細胞是一類細胞膜上高表達IL2受體鏈（CD25）的CD4+T細胞亞群（即CD4+CD25+Treg細胞），可通過分泌IL10和TGFβ等抑制性細胞因子，發(fā)揮免疫抑制功能，在維持機體免疫應答穩(wěn)態(tài)和免疫耐受方面具有非常重要的作用[13]，臨床研究顯示[14]，心衰患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞水平降低，且與心衰的病因無關。

程翔等[15]采用流式細胞分析法比較42例CHF患者與16名健康人的外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例，結果顯示CHF患者的外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例顯著低于健康人，且心功能Ⅲ級～Ⅳ級患者Treg細胞的比例明顯低于Ⅱ級患者，從而得出CHF患者的調(diào)節(jié)性T細胞比例下降，且與心功能有關。姚紅等[16]研究大鼠外周血T細胞亞群變化與β3AR自身抗體產(chǎn)生的關系，采用腹主動脈縮窄法制備大鼠心衰模型，結果顯示β3AR自身抗體水平與CD4+T細胞含量呈正相關，而與CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞含量呈負相關，認為在心衰發(fā)展過程中存在明顯的T細胞亞群失衡，且伴隨有β3AR自身抗體產(chǎn)生，Treg細胞可能對此抗體的產(chǎn)生有重要作用。

在本研究中，冠心病慢性心力衰竭患者血漿NTproBNP明顯高于非心力衰竭患者，且與心功能分級呈正相關，提示慢性心力衰竭患者血漿NTproBNP水平可以作為CHF患者心功能的一個重要指標。同時，CHF患者與非CHF患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比較，隨著NYHA心功能分級的增加而外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞低于非CHF患者，表明冠心病慢性心力衰竭患者體內(nèi)存在免疫激活狀態(tài)。

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（收稿日期：20140818）

（本文編輯王雅潔）