無患子總皂苷體外抑制酪氨酸酶活性的研究

陳雷等

摘要

[目的]研究無患子總皂苷體外對酪氨酸酶的抑制率。[方法]超聲波提取法，溶劑用水、30%乙醇和60%乙醇對無患子總皂苷提取，用大孔樹脂（D101）富集水、30%乙醇和70%乙醇部分，紫外分光光度計法，測量酪氨酸酶抑制率。[結(jié)果]超聲波提取得率中，水提得率（18.56%）最高，60%乙醇提取得率為14.46%，而30%乙醇提取得率為17.85%，接近水提取得率；大孔樹脂富集后70%乙醇洗脫部分抑制率高于30%乙醇部分和水部分；與熊果酸比較，70%乙醇洗脫部分、30%乙醇洗脫部分和總皂苷對酪氨酸酶均具有明顯的抑制作用。[結(jié)論]無患子總皂苷及30%乙醇和70%乙醇大孔樹脂洗脫部位對酪氨酸酶抑制率較高，可以作為優(yōu)良的美白護膚品天然添加劑，應用于生產(chǎn)中。

關鍵詞 無患子；總皂苷；酪氨酸酶；體外；抑制率

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）21-056-03

基金項目 吉林農(nóng)業(yè)科技學院大學生科技創(chuàng)新科研項目（2014052）。

作者簡介

陳雷（1989-），男，吉林松原人，本科生，專業(yè)：中藥資源與開發(fā)。*通訊作者，講師，碩士，從事中藥新藥開發(fā)研究。

收稿日期20150526

無患子（Sapindus mukurossi Gaertn.）本草綱目中稱為木患子，我國產(chǎn)于長江流域以南。無患子具有很強藥用價值，其果皮、種子、種仁、根、皮、葉均可以用作醫(yī)藥原材料[1]， 現(xiàn)代藥理學研究證明無患子還具有抗菌作用、抗腫瘤、降壓和心臟保護作用、保肝作用、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用[2]。無患子總皂苷洗滌液對于汞、錳、福、砷、鉛等重金屬的洗滌效果明顯[3]。無患子總皂苷還是很好的農(nóng)藥乳化劑，對蝸牛、蒼蠅、蚊子、棉蚜蟲、紅蜘蛛等均有較好的殺滅效果[4]。無患子果皮皂苷含量豐富，含量約為5.33%[5]，主要為三萜皂苷類、倍半萜糖苷類，具有較強的表面活性作用[6-7]。明代李時珍在本草綱目中記載：無患子洗頭去風明目，洗面增白祛斑。筆者在此主要研究無患子抑制酪氨酸酶[8-9]的作用，篩選美白護膚化妝品天然添加劑。

1材料與方法

1.1試驗儀器

JYT2型藥物天平（上海醫(yī)用激光儀器廠）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多（上海）有限公司）；WMZK72型指針式電熱恒溫水浴鍋（上海躍進醫(yī)療器械廠）；DHG9035A型電熱鼓風干燥箱（上海源長實驗儀器設備廠）；SY360型超聲提取器（上海寧商超生儀器有限公司）；紫外可見分光光度計UV1700PharmaSpec（北京普析通儀器有限公司）。

1.2 試驗材料

無患子果皮（2012年9月購于海寧市鹽官苗木合作社，產(chǎn)于浙江）；D101型大孔樹脂（天津農(nóng)藥廠）；L酪氨酸（日本味之素公司）；酪氨酸酶（25 000單位/mg，sigma公司）；DOPA（購自sigma公司，用PBS緩沖液配制成所需濃度單位）；磷酸緩沖鹽（北京化工有限公司）；95%乙醇。

1.3試驗方法

1.3.1

無患子總皂苷的提取。

用藥物天平稱取約為10 g的干燥無患子果皮3份，提取以料液比1∶5分別加入蒸餾水、30%乙醇、60%乙醇各50 ml，提取溫度為35 ℃，超聲功率為360 W，超聲提取時間為30 min/次[10-13]，共3次，合并各組份提取物，烘干稱重。

1.3.2

無患子總皂苷大孔樹脂吸附富集[14-15]。

1.3.2.1

大孔樹脂預處理。取D101樹脂用95%乙醇浸泡24 h，濕法裝柱，用95%乙醇洗至流出液加5倍量無白色渾濁為止。用純水洗至中性，備用。

1.3.2.2

大孔樹脂吸附富集。

合并無患子總皂苷粗提物，將其按5 g/份取3份，分別放入標號為A、B、C的50 ml燒杯中。加10倍量的水溶解，靜置沉淀后過濾，定容至50 ml容量瓶中。準確量取已經(jīng)預處理的濕樹脂200 ml 3份，濕法上3個大孔樹脂柱（標號A、B、C），分別上樣5 g提取物，依次以蒸餾水、30%乙醇、70%乙醇各3倍體積量依次洗脫。收集A、B、C 3個大孔樹脂柱的水、30%乙醇和70%乙醇各個的洗脫部位置于電熱鼓風干燥箱中40 ℃烘干，記錄數(shù)據(jù)，計算平均值得率，合并備用。

1.3.3

酪氨酸酶活性抑制率試驗。

酪氨酸酶抑制率按文獻[16-17]方法，于475 nm處測吸光度，得出抑制率作比較。按表1準確吸取A、B、C、D 4組反應液，每組設平行3組試管，25 ℃溫育5 min立即轉(zhuǎn)移比色皿中于475 nm吸光值。B組空白組，記錄A、C、D吸光度值。依據(jù)公式計算酪氨酸酶的抑制百分率，即酪氨酸酶的抑制百分率=（A-B）-（C-D）A-B×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 無患子總皂苷提取

從表2可以看出，在超聲波提取無患子總皂苷提取液過程中，水提得率最高（18.56%），60%乙醇得率最低（14.46%），而30%乙醇提取含量接近水提取得率，為17.85%；色澤上，60%乙醇提取物色澤較深，為棕色，30%乙醇提取物顏色為黃色，而水提取物顏色最淺，為淺黃色。

2.2無患子提取物大孔樹脂不同洗脫部位得率

對于大孔樹脂富集情況（表3）來看，水洗脫部分占總提取物28.47%，其中主要部分為水溶性物質(zhì)，不是主要皂苷類成分，30%乙醇提取部分含有約19.84%，屬于含糖量大的皂苷類物質(zhì)，而70%乙醇洗脫部分得率為34.00%，為主要三萜皂苷類，根據(jù)文獻報道[14]，該部分為主要皂苷類活性成分。

2.3無患子皂苷酪氨酸酶活性抑制結(jié)果

通過測試各個不同洗脫部位所配置濃度（0.2 、0.5、1.0 mg/ml）供試品溶液吸光度值，然后計算其各組分對酪氨酸酶抑制率。

從圖1可以看出，無患子提取物對酪氨酸酶有很強的抑制作用，其中總提取物、30%乙醇和70%乙醇洗脫組分在1.0 mg/ml濃度上抑制率很強，與熊果酸抑制率相似，而大孔樹脂水洗脫組分抑制率較低。

不同濃度提取物對酪氨酸酶抑制作用顯著不同，在0.2～1.0 mg/ml范圍內(nèi)隨提取物濃度增加抑制率升高，提取物對酪氨酸酶活性抑制效率最高的質(zhì)量濃度為1.0 mg/ml。70%乙醇大孔樹脂洗脫組分抑制率高于30%乙醇組分，表明該部分為主要酪氨酸酶抑制成分，水洗部分抑制率低，該部分成分抑制酪氨酸酶活性不強。

3討論

通過對水和不同濃度乙醇溶液提取比較，水提得率較高，60%乙醇含量較少，主要原因是無患子果皮中含有較多糖類物質(zhì)，隨著乙醇濃度提高，糖類物質(zhì)浸出較少，反而以沉淀形式析出。在試驗過程中可觀察到醇的濃度越高，無患子粗提物的色澤更深，可能皂苷含量更多，或在提取中有部分色素易溶于有機溶劑的緣故。而在后續(xù)步驟采取洗脫后的無患子總皂苷進行抑制酪氨酸酶活性試驗，超聲提取法由于提取溫度低、提取時間短，更有利于保留無患子皂苷的生理活性。

在皮膚黑色素生成系列反應中，酪氨酸酶在生物體內(nèi)具有重要的生理功能，它與人體由于色素沉積而引起的雀斑、褐斑等有關。在酪氨酸酶的作用下，酪氨酸生成還原型多巴，進而氧化成醌式結(jié)構(gòu)，經(jīng)過系列代謝反應，多巴醌形成多巴色素和5，6二羥基吲哚，然后轉(zhuǎn)化為黑色素[16-17]。因此，抑制酪氨酸酶活性可以起到阻斷人體皮膚黑色素形成機制，進而起到皮膚美白的效果。

無患子在民間常用于美白祛斑藥物，在抑制酪氨酸-多巴試驗中，無患子水提取物經(jīng)過大孔樹脂吸附處理，得到30%乙醇和70%乙醇組分其抑制酪氨酸酶較強，分別為82.29%和84.21%，同時總提取物抑制率也較高（80.23%），以上3種組分具有較強的抑制效果，均與熊果酸抑制率接近，且成分的穩(wěn)定性好，可以用于美白護膚產(chǎn)品天然提取物添加劑，其主要原因可能是無患子中含有三萜皂苷類、倍半萜糖苷類，對酪氨酸酶有較強的抑制作用，同時也表明該成分是無患子主要成分[14]。無患子作為天然產(chǎn)物，符合當前人們消費理念，歐洲現(xiàn)在開發(fā)許多植物提取物作為化妝品添加成分，受到消費者的大力追捧，無患子也將成為不久的將來化妝品中最具有潛力的美白護膚添加劑。

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