蓮子低聚糖提取工藝優(yōu)化及其組分分析

盧旭 張帥 林姍 吳小婷 張怡 鄭寶東

摘 要 采用響應(yīng)面分析法對(duì)蓮子低聚糖熱水浸提工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，探討浸提時(shí)間（min）、浸提溫度（℃）和水料比（V/W）對(duì)熱水浸提蓮子低聚糖得率的影響，建立提取蓮子低聚糖的二次項(xiàng)數(shù)學(xué)模型并驗(yàn)證其可靠性，得到最優(yōu)提取工藝參數(shù)，并采用高效液相色譜法對(duì)蓮子低聚糖組分進(jìn)行初步分析。結(jié)果表明：熱水浸提蓮子低聚糖的最佳提取工藝條件是浸提時(shí)間為66 min，浸提溫度為81 ℃，水料比為80 ∶ 1，在此工藝條件下蓮子低聚糖得率為8.09%。影響低聚糖提取工藝的主次因素順序?yàn)椋核媳?浸提溫度>浸提時(shí)間。高效液相色譜法測(cè)定蓮子低聚糖，發(fā)現(xiàn)蓮子低聚糖由四聚糖、三聚糖和二聚糖組成。

關(guān)鍵詞 蓮子；低聚糖；提取工藝；響應(yīng)面法；高效液相色譜

中圖分類號(hào) R282.71 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

蓮子是中國(guó)重要的出口創(chuàng)匯特色農(nóng)副產(chǎn)品之一，除福建、江西兩省為主要產(chǎn)區(qū)外，在浙江、湖南、江蘇、湖北、河北、臺(tái)灣等省亦均有商業(yè)栽培。蓮子為藥食兩用食品，除含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、生物堿和類黃酮外，還含有超氧化物歧化酶、低聚糖、多糖等功效成分[1-2]。目前，低聚糖已被證實(shí)為有效的雙歧桿菌增殖因子之一[3-5]，攝入低聚糖可調(diào)節(jié)腸道菌群，從而起到增強(qiáng)機(jī)體免疫、降血脂、降血壓等功能[6]。低聚糖的聚合度對(duì)益生菌利用率具有重要的影響，其吸收能力一般隨分子量的減小而增大，同時(shí)對(duì)抗致病菌能力也有一定的影響，聚合度越低的低聚糖抗菌活性越強(qiáng)[7-9]。吳小南等[10]將發(fā)酵蓮子乳灌胃小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)灌胃后的小鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)加快，腸內(nèi)糞便滯留時(shí)間減少，推測(cè)可能與發(fā)酵蓮子乳中含有大量的棉子糖類似物有關(guān)。

低聚糖獲取方式主要包括化學(xué)合成法和以動(dòng)植物為原料來(lái)源的溶劑提取法[11]、酶解法[12]、生物法[13-14]等。響應(yīng)面設(shè)計(jì)法（Response Surface Method，RSM）能夠克服傳統(tǒng)數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法處理數(shù)據(jù)量大、不能分析因素之間交互影響和精度不高的缺點(diǎn)，隨著計(jì)算機(jī)應(yīng)用技術(shù)的發(fā)展，此法已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中的加工提取工藝及工藝配方設(shè)計(jì)的優(yōu)化[15]。

本研究以速凍鮮蓮為供試原料，研究浸提時(shí)間、浸提溫度和水料比等單因素對(duì)熱水浸提低聚糖得率的影響。采用苯酚-硫酸法測(cè)定低聚糖含量，使用中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析法優(yōu)化蓮子低聚糖熱水浸提工藝參數(shù)。同時(shí)通過(guò)高效液相色譜法對(duì)蓮子低聚糖的小分子糖類成分及各組分聚合度進(jìn)行測(cè)定，為充分開發(fā)利用蓮子低聚糖資源及工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 速凍鮮蓮：由綠田（福建）食品有限公司提供；95%乙醇，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蔗糖和棉籽糖：購(gòu)自美國(guó)sigma公司；水蘇糖：購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備 FW177中草藥粉碎機(jī)：購(gòu)自天津泰斯特儀器有限公司；DHG-9053A電熱鼓風(fēng)干燥箱：購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SH-Ⅱ循環(huán)水式多用真空泵：購(gòu)自鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RE-5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：購(gòu)自國(guó)華電器有限公司；FD-4C-80冷凍干燥機(jī)：購(gòu)自北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LC-20A高效液相色譜儀：購(gòu)自日本島津。

1.2 方法

1.2.1 蓮子低聚糖提取工藝流程 速凍鮮蓮取出后解凍1 h，篩選去芯后放入鼓風(fēng)干燥箱50 ℃烘干至恒重。干燥后的蓮子粉碎過(guò)100目篩，按一定水料比加入去離子水，以一定溫度加冷凝管回流提取一定時(shí)間后過(guò)濾，棄濾渣。濾液經(jīng)真空濃縮后加入3倍體積95%乙醇，于4 ℃靜置隔夜，離心得上清液。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 分別考察浸提時(shí)間、浸提溫度及水料比對(duì)蓮子低聚糖得率的影響，以苯酚-硫酸法[16]計(jì)算蓮子低聚糖得率。苯酚-硫酸法以葡萄糖作為標(biāo)定物換算低聚糖的濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.007 2 X-0.003 3（R2=0.998 4），式中：Y為溶液在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值；X為溶液中葡萄糖濃度（μg/mL）。

蓮子低聚糖得率=×100% （1）

式中：C為測(cè)定溶液中蓮子低聚糖濃度（mg/mL），V為測(cè)定溶液體積（mL），n為溶液稀釋倍數(shù)，m為蓮子干重質(zhì)量（mg）。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 參考單因素試驗(yàn)結(jié)果和試驗(yàn)誤差控制，選擇浸提時(shí)間、浸提溫度及水料比3個(gè)因素進(jìn)行3因素3水平優(yōu)化試驗(yàn)。采用中心組合設(shè)計(jì)（Central Composite Design），利用響應(yīng)面法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。以蓮子低聚糖得率（Y/%）為考察指標(biāo)，以浸提時(shí)間（A）、浸提溫度（B）及水料比（C）為自變量，因素水平編碼見表1。

1.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)所建立的二次項(xiàng)數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)蓮子低聚糖在最佳提取工藝參數(shù)下的得率，相同條件下測(cè)定蓮子低聚糖的實(shí)際得率，以驗(yàn)證響應(yīng)面預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

1.2.5 蓮子低聚糖組分分析 采用高效液相色譜法對(duì)蓮子低聚糖組分進(jìn)行初步分析。取1.2.1步驟所產(chǎn)生的蓮子低聚糖粉末，加去離子水定容至100 mL，取待測(cè)溶液1 mL經(jīng)0.22 μm微孔膜過(guò)濾后注入高效液相色譜分析。

色譜條件為上樣量：20 μL；色譜柱：安捷倫Hi-plex Na（Octo）柱（300 mm×7.7 mm，8 μm）；流動(dòng)相：蒸餾水；檢測(cè)器：RID-10A示差檢測(cè)器；流速：0.6 mL/min；柱溫：85 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 浸提時(shí)間對(duì)蓮子低聚糖得率的影響 由圖1可知，當(dāng)浸提溫度為70 ℃，水料比為40 ∶ 1時(shí)，蓮子低聚糖的得率隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)。當(dāng)浸提時(shí)間為60 min時(shí)，蓮子低聚糖的得率達(dá)到峰值。浸提時(shí)間太長(zhǎng)可能導(dǎo)致部分蓮子糖類物質(zhì)與游離氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)，使得溶液色澤加深，低聚糖得率降低[17]。由此確定最佳浸提時(shí)間為60 min。

3 討論與結(jié)論

多數(shù)植物的根莖、果實(shí)和種子均含有豐富的低聚糖，目前提取天然植物低聚糖的對(duì)象主要有大豆、火龍果、麥麩、大蒜、藻類、地黃等植物。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化熱水浸提蓮子低聚糖工藝并對(duì)各影響因素間的相互作用進(jìn)行研究，得到蓮子低聚糖得率影響因素的主次順序依次為：水料比>浸提溫度>浸提時(shí)間，各因素之間無(wú)交互作用。蓮子低聚糖提取最佳工藝條件：浸提時(shí)間為66 min，浸提溫度為81 ℃，水料比為80 ∶ 1；實(shí)際測(cè)得低聚糖得率為8.09%，與理論預(yù)測(cè)值8.08%基本一致，與山藥（7.21%）[22]、雪蓮果（6.32%）[23]和肉蓯蓉（3.72%）[24]等原料相比提取得率較高，說(shuō)明蓮子中低聚糖含量較高。已有研究結(jié)果表明，不同的提取方法對(duì)低聚糖得率有顯著影響，唐雪娟[25]以超聲波法輔助提取香蕉低聚糖，得率（17.89%）明顯高于溫水法提取香蕉低聚糖的得率。宋春麗等[26]的研究結(jié)果表明，以高溫變性豆粕為原料提取大豆低聚糖，微波輔助提取微波輔法提取低聚糖的效果優(yōu)于超聲波法。田玉庭等[27]采用超聲波法輔助提取蓮子低聚糖，蓮子低聚糖得率為1.13%。本研究經(jīng)熱水浸提的蓮子低聚糖得率高于超聲波輔助提取法，可能與前者提取過(guò)程中所采用的脫蛋白、酵母發(fā)酵等中間步驟過(guò)多有關(guān)，造成低聚糖在提取過(guò)程中大量損失，導(dǎo)致最終得率降低。

上述低聚糖提取研究中，并未對(duì)低聚糖組成成分做出具體說(shuō)明。本研究高效液相色譜結(jié)果表明，蓮子低聚糖含有3個(gè)組分，主要由二聚糖、三聚糖和四聚糖構(gòu)成，以三聚糖和四聚糖為主，這與花生粕低聚糖和大豆低聚糖的組成成分相似[28-29]，提示蓮子低聚糖可能具有良好的機(jī)體吸收利用能力，且可能具有與大豆低聚糖相似的生理活性功能。蓮子低聚糖在高效液相色譜的保留時(shí)間與水蘇糖、棉籽糖、蔗糖相近，為較低分子量的低聚糖；據(jù)孫麗萍等[30]報(bào)道不同分子量低聚糖的體外清除自由基的活性有差異，分子量小于1 000的褐藻膠寡糖比分子量更大的褐藻膠寡糖具有較優(yōu)的清除自由基能力，推測(cè)蓮子低聚糖相比聚合度較大的低聚糖，可能具有良好的生理活性。由于相同分子量的低聚糖可能還含有不同糖苷鍵異構(gòu)體，較難通過(guò)色譜柱將其完全分離，因此蓮子低聚糖各成分的具體結(jié)構(gòu)和生理活性還有待于進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 鄭寶東. 蓮子科學(xué)與工程[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2010.

[2] 鄭寶東， 鄭金貴，曾紹校. 我國(guó)主要蓮子品種營(yíng)養(yǎng)成分的分析[J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào). 2003， 25（2）： 153-156.

[3] Gopal P K， Prasad J， Gill H S. Effects of the consumption of Bifidobacterium lactis HN019（DR10TM）and galacto-oligosaccharides on the microflora of the gastrointestinal tract in human subjects[J]. Nutrition Research， 2003， 23（10）： 1 313-1 328.

[4] Yuan X， Wang J， Yao H. Feruloyl oligosaccharides stimulate the growth of Bifidobacterium bifidum[J]. Anaerobe， 2005， 11（4）： 225-229.

[5] 盧 旭. 蓮子低聚糖對(duì)雙歧桿菌增殖效應(yīng)的研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學(xué)， 2012.

[6] 王向紅， 吉爽爽， 桑亞新，等. 金絲小棗低聚糖的制備及其對(duì)雙歧桿菌體外促生長(zhǎng)的研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2012， 12（9）：28-33.

[7] 胡學(xué)智， 伍劍鋒. 低聚果糖的生理功能及生產(chǎn)、 應(yīng)用[J]. 中國(guó)食品添加劑， 2007， 6（1）： 148-157.

[8] 韋新葵， 雷朝亮. 蠅蛆幾丁低聚糖抑菌作用的初步研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2004， 37（4）： 552-557.

[9] 王 敏， 臧師竹， 辛 毅，等. 小鼠腸道對(duì)殼寡糖的吸收率及吸收成分的影響[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志， 2013， 25（10）： 1 143-1 144.

[10] 吳小南， 陳 潔， 汪家梨， 等. 發(fā)酵蓮子乳對(duì)小鼠胃腸道運(yùn)動(dòng)、吸收功能的調(diào)節(jié)作用[J]. 世界華人消化雜志， 2005， 13（21）： 2 535-2 539.

[11] 張立峰， 劉慶富，寧海鳳. 從豆清水中提取大豆低聚糖的工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技， 2013， 34（12）： 220-224.

[12] 黃汝清，歐仕益. 草酸蒸煮處理和表面活性劑對(duì)酶法制備低聚糖阿魏酸酯的影響[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2012， 12（5）： 71-75.

[13] 邵 曼， 倪 輝， 蔡慧農(nóng)， 等. 利用法夫酵母JMU-MVP14聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵蝦青素和功能性低聚糖的研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2012， 11（7）： 4-13.

[14] 王昌濤， 黃 鵬， 崔希慶. 從大豆糖蜜發(fā)酵液中提取、純化低聚糖[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2011， 11（5）： 24-31.

[15] 王永菲， 王成國(guó). 響應(yīng)面法的理論與應(yīng)用[J]. 中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版， 2005， 14（3）： 236-240.

[16] 張惟杰. 糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M]. 杭州：浙江大學(xué)出版社，1999： 11-12.

[17] 羅存回， 賀晉艷， 曾曉雄. 鷹嘴豆α-低聚半乳糖的穩(wěn)定性和美拉德反應(yīng)特性[J]. 食品科學(xué)， 2011， 32（23）： 91-95.

[18] 陳 嬋. 蓮子多糖提取及其結(jié)構(gòu)性質(zhì)的研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學(xué)， 2007.

[19] 吳 堯， 萬(wàn)端極， 吳正奇，等. 微波輔助提取棉籽糖及膜純化工藝研究[J]. 湖北工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，29（1）：108-120.

[20]洪 晶，陳濤濤，唐夢(mèng)茹，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化韭菜籽蛋白質(zhì)提取工藝[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2013， 13（12）： 89-96.

[21] 曾紹校， 彭 彬， 陳 潔，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化西番蓮果皮花色苷提取工藝[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2014， 14（1）： 104-113.

[22] 露 劉， 雁 張， 張名位，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取山藥低聚糖的工藝研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 41（11）：100-105.

[23] 王照波， 周文美， 徐子婷，等. 勻漿輔助水浴法提取雪蓮果低聚糖的工藝研究[J]. 貴州大學(xué)學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版， 2009， 26（4）： 100-103.

[24] 白 英. 肉蓯蓉低聚糖提取工藝的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2006， 27（10）： 118-119.

[25] 唐雪娟， 王 淼，王 娟. 超聲波法與溫水法提取香蕉低聚糖的比較[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 40（22）： 111-114.

[26] 宋春麗， 王文俠， 曾鳳彩，等. 超聲波和微波輔助提取大豆低聚糖的工藝比較[J]. 食品與機(jī)械， 2011， 23（2）： 47-50.

[27] 田玉庭， 盧 旭，鄭寶東. 響應(yīng)面法優(yōu)化蓮子低聚糖超聲波輔助提取工藝[J]. 北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版， 2012， 30（2）： 17-21.

[28] 韓 冰， 周 婷，李全宏. 脫脂花生粕中低聚糖的初步提取工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技， 2011， 27（7）： 285-288.

[29] 郭 建， 王夢(mèng)凡， 齊 崴，等. 響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取大豆異黃酮聯(lián)產(chǎn)分離蛋白和低聚糖[J]. 大豆科學(xué)， 2012， 31（4）：655-661.

[30] 孫麗萍， 薛長(zhǎng)湖， 許家超，等. 褐藻膠寡糖體外清除自由基活性的研究[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2005， 35（5）：811-814.