3種鱧屬魚(yú)類ITS序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析

朱樹(shù)人 孟慶磊 朱永安等

摘要[目的]闡明烏鱧、斑鱧、月鱧核基因序列（ITS）的遺傳變異情況，并用ITS序列研究鱧屬系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。[方法]利用PCR擴(kuò)增3種鱧的ITS，經(jīng)克隆、拼接得到ITS全長(zhǎng)后進(jìn)行分析。[結(jié)果]烏鱧、斑鱧和月鱧ITS全序列長(zhǎng)度為902、 927、902或903 bp。3種鱧ITS的G+C含量較高，約占72%。3種鱧之間核苷酸差異明顯大于種內(nèi)，明顯的差異性ITS片段可以鑒別3種鱧。采用NJ和ML方法建立的進(jìn)化樹(shù)都表明烏鱧和斑鱧的遺傳距離最近，而烏鱧和月鱧遺傳距離最遠(yuǎn)。[結(jié)論]該研究為鱧屬的分類鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系以及種間雜交提供基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞烏鱧；斑鱧；月鱧；ITS序列；親緣關(guān)系

中圖分類號(hào)S961.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）31-047-03

Analysis on ITS Sequences and Phylogenetic Relationship of Three Kinds of Channa

ZHU Shuren1，2，3， MENG Qinglei1， ZHU Yongan1 et al

（1.Shandong Provincial Key Laboratory Freshwater Genetics and Breeding， Shandong Freshwater Fisheries Research Institute， Jinan，Shandong 250017； 2.Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources Gertificated by Ministry of Agriculture， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306； 3.Department of Biology， East China Normal University， Shanghai 200241）

Abstract [Objective] The aim was to examine sequence variation in the internal transcribed spacer （ITS） isolates from Channa argus， C. maculata and C. asiatica， and to reconstruct their phylogenetic relationship using ITS sequences. [Method]The ITS sequences were amplified from each sample and the amplicons were cloned and spliced the full length of ITS sequences.[Result] The full length of ITS sequences of C. argus， C. maculata and C. asiatica were 902， 927， 902 or 903 bp. The content of G+C （about 72%） was higher than A+T. For three species of snakehead， interspecific differences were significantly greater than the intraspecific differences. The obvious difference of ITS fragments could identify three species of snakehead. Based on NJ and ML method， phylogenetic analysis showed that C. argus and C. maculata had the lowest genetic distance， while C. argus and C. asiatica had the highest genetic distance. [Conclusion]The results of this study could be useful for classification， phylogenetic relationship and interspecific hybrids of Channa.

Key words Channa argus； C. maculata ； C. asiatica； ITS sequences； Phylogenetic relationship

真核生物的核糖體都有3種rRNA，即18S rRNA、5.8S rRNA 和28S rRNA。這3種rRNA 基因都是以串聯(lián)重復(fù)形式存在，編碼這些rRNA的基因都按一定順序排列在DNA上。ITS包括ITS1和ITS2，分別位于18S rRNA與5.8S rRNA，5.8S rRNA 和28S rRNA之間。由于ITS1和ITS2進(jìn)化速度較快，兩者廣泛應(yīng)用于魚(yú)類物種的鑒定，特別用于分類較相似的魚(yú)類之間[1-4]。可以根據(jù)ITS兩邊rRNA 具有很高的保守性，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ITS序列片段。

筆者對(duì)我國(guó)較為常見(jiàn)的烏鱧、斑鱧、月鱧種間的分子遺傳距離和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行研究，旨在促進(jìn)對(duì)其種內(nèi)遺傳多樣性的認(rèn)識(shí)，為分析鱧屬種間雜交提供借鑒。

1材料與方法

1.1材料

3種鱧屬魚(yú)類樣本于2013年5～10月份采集。烏鱧樣本采集于山東微山湖，斑鱧和月鱧都采自廣東。每種鱧采集5尾，樣本均采自水上作業(yè)的漁民或附近的水產(chǎn)品市場(chǎng)，剪取少量胸鰭，保存于無(wú)水乙醇中，貼好標(biāo)簽放置于4 ℃冰箱備用。

1.2DNA提取

將胸鰭組織從乙醇中取出，充分漂洗晾干并剪碎，采用標(biāo)準(zhǔn)的酚-氯仿法提取基因組DNA。取2 μl DNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并稀釋到合適濃度用于PCR擴(kuò)增。

1.3PCR擴(kuò)增及測(cè)序

PCR擴(kuò)增引物參照通用引物，均由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物NSF1787F（5′CCGTA GGTGA ACCTG CGG3′）和下游引物FishLSU5Rev（5′TTAAA TTCAG CGGGT TGTCT3′）[5]。

PCR反應(yīng)體系為20 μl，包含10×PCR buffer 2 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，25 mmol/L Mg2+ 2.4 μl，10 umol/L 引物NSF1787F 、FishLSU5′Rev各 1 μl，Taq（5 U/μl） 0.1 μl，DNA模板 2 μl，其他用 ddH2O 補(bǔ)充。PCR擴(kuò)增程序采用降落PCR，94 ℃預(yù)變性3 min，然后是35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性40 s，退火40 s（初始溫度為64 ℃，每次循環(huán)降0.5 ℃，降至61 ℃），72 ℃延伸1.5 min，最后72 ℃再延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)純化、回收、克隆后由上海邁浦生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4數(shù)據(jù)分析

利用Clustal X（1.83）[6]對(duì)序列進(jìn)行對(duì)位排列，并結(jié)合人工校正。通過(guò)MEGA5.0軟件[7-8]分析序列的堿基組成、變異位點(diǎn)，同時(shí)采用Kimura雙參數(shù)法計(jì)算種間的遺傳距離。在遺傳距離分析的基礎(chǔ)上，以鱸形目魚(yú)類圓花鰹（Auxis rochei，Genbank AB193743）為外群，采用Kimura 2parameter模型，Bootstrap估算重復(fù)次數(shù)1 000次，采用NJ法（Neighborjoining）和ML法（Maximum Likehood）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1陽(yáng)性克隆鑒定結(jié)果

ITS基因序列陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR鑒定（圖1），得到約1 200 bp的條帶，與基因組PCR結(jié)果完全一致，表明克隆已經(jīng)成功。

2.2序列測(cè)定結(jié)果

采用雙向測(cè)序，經(jīng)過(guò)拼接后得到了完整的核糖體ITS序列（包括部分18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA、ITS2和部分28 S rRNA序列）。經(jīng)過(guò)NCBI上的Blast程序在GenBank基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)測(cè)得的ITS序列與許多魚(yú)類的核糖體保守區(qū)域具有很高的同源性，其中與鱸形目魚(yú)類的同源性最高，證明測(cè)得序列的正確性（圖2）。烏鱧和斑鱧測(cè)得的ITS序列片段大小在1 200～1 300。把克隆測(cè)得ITS序列向Genbank進(jìn)行了提交。樣品ITS序列登錄號(hào)如下：WL1，KJ451597；WL2，KJ451598；WL3，KJ451599；WL4，KJ451600；WL5，KJ451601；BL1，KJ451602；BL2，KJ451603；BL3，KJ451604；BL4，KJ451605；BL5KJ451606；YL1，KJ451607；YL2，KJ451608；YL3，KJ451609；YL4，KJ451610；YL5，KJ451611。

2.4系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

根據(jù)烏鱧、斑鱧和月鱧ITS全序列，利用MEGA 5.05軟件計(jì)算它們之間的遺傳距離，采用Kimura2雙參數(shù)模型（假設(shè)堿基轉(zhuǎn)換為顛倒數(shù)的2倍）計(jì)算它們的遺傳距離（表2）。烏鱧、斑鱧、月鱧物種內(nèi)遺傳距離最大為0.003、0.007、0.004，物種間遺傳距離最大發(fā)生在烏鱧和月鱧之間（0.111）。

基于ITS基因序列分別用鄰位相連法（NJ）和最大似然法（ML）構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)。NJ和ML建立的進(jìn)化樹(shù)都顯示（圖3和4），烏鱧、斑鱧、月鱧都各自聚為一支，物種間烏鱧和斑鱧先聚在一起，其次與月鱧聚在一起，最后與圓花鰹聚在一起。進(jìn)化樹(shù)顯示烏鱧和斑鱧親緣關(guān)系最近，同時(shí)兩者與同屬的月鱧親緣關(guān)系也較近，而與鱸形目的其他屬魚(yú)類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與林奈氏命名法分類結(jié)果相一致。

3討論

ITS區(qū)域并不參與核糖體的形成，受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速率較快，并且兩側(cè)的18S rRNA、28S rRNA 和中間5.8S rRNA具有高度保守性，有利于設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增，所以廣泛應(yīng)用于種的分類鑒定、種及亞種的鑒別、分子系統(tǒng)進(jìn)化[9-11]。不同物種間18S、5.8S和28S rRNA 基因序列同源性較高，而ITS種間的同源性很低。種間ITS基因進(jìn)化速度不均勻，以此序列間的遺傳距離變化較大，所以ITS并不適合在高階元物種間進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育研究，適合在屬以下分類中進(jìn)行比較研究。

該研究中，用ITS分析烏鱧和斑鱧物種內(nèi)具有較大的相似度，同屬鱧科魚(yú)類的兩者在ITS有明顯的差異性片段（特別是在ITS2中斑鱧明顯多出30 bp大小的片段，即TACCC CCACA CTCTG GGGCC CGGGG CGGGT）。因此ITS不適合用于研究物種內(nèi)個(gè)體之間的差異性，這段明顯的差異性片段可以用于準(zhǔn)確判定形態(tài)學(xué)上較難辨別的烏鱧和斑鱧[12]，而兩者與月鱧無(wú)論在形態(tài)上還是ITS序列上差異較大（如月鱧在800 bp左右多出CTTCG CCGGG GCTA），很容易用于ITS序列鑒別。在果蠅ITS研究中表明高GC含量是一個(gè)比較原始的特征[13]，這種特征也存在于魚(yú)類[14]。該研究中，3種鱧G+C含量占72%左右，明顯高于A+T，表明鱧屬魚(yú)類比較原始，其起源和分化可能較早，故鱧屬魚(yú)類種間明顯的序列長(zhǎng)度多態(tài)性是在漫長(zhǎng)的進(jìn)化中積累形成的，同樣序列變異較小的種類可能分化較晚，進(jìn)化時(shí)間相對(duì)較短。

該研究采用NJ和ML方法建立了分子進(jìn)化樹(shù)，2種方法都表明烏鱧和斑鱧的遺傳距離較近（約0.020），親緣關(guān)系最近，而與同屬的月鱧遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，這為種間雜交提供了基礎(chǔ)資料。鱧科魚(yú)類與同目的圓花鰹遺傳距離較大，這與ITS序列不大適合在高階元物種間分子系統(tǒng)發(fā)育研究相符合。

綜上所述，鱧屬ITS序列較快的核苷酸進(jìn)化速率，適合用于該屬內(nèi)種間物種鑒別和系統(tǒng)進(jìn)化學(xué)研究。目前，發(fā)現(xiàn)的鱧屬魚(yú)類并不完整，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)鱧屬魚(yú)類ITS序列數(shù)據(jù)還較少，今后有必要對(duì)更多的鱧屬魚(yú)類進(jìn)行測(cè)定，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及其他分子標(biāo)記，這將有助于科研工作者對(duì)鱧屬新物種的發(fā)現(xiàn)和分類進(jìn)化系統(tǒng)有更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。

43卷31期朱樹(shù)人等3種鱧屬魚(yú)類ITS序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析

參考文獻(xiàn)

[1] PLEYTE K A，DUNCAN S D，PHILLIPS R B.Evolutionary relationships of the salmonid fish genus Salvelinus inferred from DNA sequences of the first internal transcribed spacer（ITS1）of ribosomal DNA[J].Molecular phylogenetics and evolution，1992，1（3）：223-230.

[2] MATEJUSOV I，GELNAR M，MCBEATH A J，et al.Molecular markers for gyrodactylids（Gyrodactylidae：Monogenea）from five fish families（Teleostei）[J].International journal for parasitology，2001，31（7）：738-745.

[3] CHOW S，NAKAGAWA T，SUZUKI N，et al.Phylogenetic relationships among Thunnus species inferred from rDNA ITS1 sequence[J].Journal of fish biology，2006，68：24-35.

[4] SAJDAK S L，PHILLIPS R B.Phylogenetic relationships among Coregonus species inferred from the DNA sequence of the first internal transcribed spacer（ITS1）of ribosomal DNA[J].Canadian journal of fisheries and aquatic sciences，1997，54（7）：1494-1503.

[5] SIYA L，MELISSA A W，DAVID M W，et al.Identification of larval sea basses（Centropristis spp.）using ribosomal DNA-specific molecular assays [J].Fishery bulletin，2008，106（2）：183-193.

[6] THOMPSON J D，GIBSON T J，PLEWNIAK F，et al.The CLUSTAL_X windowsinterface：Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Research，1997，5：4876-4882.

[7] KIMURA M.A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences [J].Journal of Molecular Evolution，1980，16：111-120.

[8] TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods [J].Molecular Biology and Evolution，2011，28：2731-2739.

[9] 王慶，傅洪拓.核rDNA ITS區(qū)序列在水產(chǎn)動(dòng)物研究中的應(yīng)用 [J].安徽農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2007，13（11）：99-101.

[10] 徐田軍，劉楚吾，劉麗，等.基因間隔序列（ITS）在水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性分析中的應(yīng)用 [J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，26（1）：84-88.

[11] 楊成龍，陳章蛾，吳小平，等.基因組ITS序列分析鑒定紅曲霉菌株 [J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2015，29（2）：252-259.

[12] ZHU S R，MA K Y，XING Z J，et al.The complete mitochondrial genome of Channa argus，C.maculata and hybrid snakehead fish [C.maculata（♀）× C.argus （♂）][J].Mitochondrial DNA，2013，24：217-218.

[13] RODR？GUEZ-TRELLES F，TARRO R，AYALA F J.Evidence for a high ancestral GC content in Drosophila[J].Molecular biology and evolution，2000，17（11）：1710-1717.

[14] BOOTON G C，KAUFMAN L，CHANDLER M，et al.Evolution of the ribosomal RNA internal transcribed spacer one（ITS-1）in cichlid fishes of the Lake Victoria region[J].Molecular phylogenetics and evolution，1999，11（2）：273-282.