HIV-1相關(guān)蛋白與細(xì)胞自噬在HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知障礙中的研究進(jìn)展

董 軍， 劉思思

(暨南大學(xué)1.醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系;2.省中醫(yī)藥管理局重點實驗室;3.粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院，廣東廣州510632)

細(xì)胞自噬是一種真核細(xì)胞更新細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的維持平衡的機(jī)制，其過程主要包括三個階段，①在饑餓狀態(tài)、細(xì)菌病毒等入侵細(xì)胞時，細(xì)胞膜、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的非核糖體區(qū)域、高爾基體等來源的自噬體膜脫落形成杯狀分隔膜，將需要降解的物質(zhì)(如:胞漿，細(xì)胞器，細(xì)菌，病毒等)包繞在其中，形成自噬泡;②膜延伸將被降解物完全包繞，形成自噬小體;③自噬小體通過細(xì)胞內(nèi)微管運(yùn)輸系統(tǒng)被運(yùn)至溶酶體，其膜與溶酶體融合，此時自噬過程趨于成熟，內(nèi)容物被降解，形成的小分子物質(zhì)重新運(yùn)回細(xì)胞質(zhì)，參與物質(zhì)合成及能量代謝，而自噬體膜脫落被重新利用.CNS(central nervous system)中的細(xì)胞如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等，都是高度分化的專能細(xì)胞，其中神經(jīng)元的生長和成熟，軸突遷移，突觸的形成與消除等都需要細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)及細(xì)胞器保持動態(tài)平衡狀態(tài)，因此細(xì)胞自噬在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理和病理過程中起十分重要的作用.本文主要闡述HIV-1相關(guān)蛋白中Env、Gag、Nef、Tat、Vif參與細(xì)胞自噬形成的方式，及其改變細(xì)胞自噬功能后在HAND進(jìn)程中的作用.

1 細(xì)胞自噬的主要分子機(jī)制

目前研究發(fā)現(xiàn)酵母中存在50多種與細(xì)胞自噬相關(guān)的基因，在哺乳動物中找到相關(guān)同源物統(tǒng)一命名為 atg(autophagy associated gene)，包括 atg1、atg6、atg8、atg11、atg13、atg17、atg20、atg24 等，如其中酵母的Atg8在哺乳動物中稱為微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)，Atg6則被稱為Beclin-1.哺乳動物系統(tǒng)中，吞噬泡形成和細(xì)胞自噬過程中磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Class III PI3K)特別是Vps34(vesicular protein sorting 34)及Atg6/Beclin-1起重要作用.自噬小體形成過程中有兩個重要的泛素—蛋白酶系統(tǒng)參與，包括Atg5-Atg12系統(tǒng)和LC3系統(tǒng)［1］，Atg5-Atg12系統(tǒng)中，Atg7激活A(yù)tg12，將其轉(zhuǎn)移到Atg10，從而促進(jìn)Atg12與Atg5結(jié)合，其中Atg7、Atg10分別發(fā)揮著類似E1、E2泛素激活酶的作用.Atg5-Atg12復(fù)合物與Atg16L形成Atg5-Atg12-Atg16L，這種復(fù)合體與吞噬泡伸展相關(guān)［2］.在LC3系統(tǒng)中，它被Atg4激活產(chǎn)生LC3-I.Atg4表達(dá)的甘氨酸被Atg7激活.當(dāng)磷脂酞乙醇與甘氨酸竣基結(jié)合后，活化的LC3-I被轉(zhuǎn)移到Atg3，產(chǎn)生膜結(jié)合型LC3-II，并定位于自噬體上，當(dāng)自噬體與溶酶體融合后，LC3-II則被溶酶體酶降解［3］.自噬溶酶體的形成及內(nèi)容物的降解至自噬體形成后便趨向成熟，即自噬體與溶酶體膜融合形成自噬溶酶體［4］.過程依賴于溶酶體內(nèi)的酸化、蛋白酶B及Atg15編碼蛋白.

2 HIV-1相關(guān)蛋白

HIV-1是慢病毒 Retroviridae家族的成員，HIV-1基因組的結(jié)構(gòu)和組合形式與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相同，從其5’末端到3’末端依次排列為 LTR((long terminal repeat，LTR)、gag、pro、pol、env 和 LTR，但HIV較其他逆轉(zhuǎn)錄病毒有較多的調(diào)節(jié)基因(tat，rev)以及輔助基因(nef、vif、vpr、vpu)，是一種復(fù)雜逆轉(zhuǎn)錄病毒.下面簡單介紹HIV相關(guān)蛋白質(zhì).

2.1 Gag

Gag由gag基因編碼，由約500個氨基酸組成的聚合前體蛋白，主要由四個結(jié)構(gòu)域組成，經(jīng)蛋白酶水解形成 P17，P24等，P17(基質(zhì)蛋白，matrix protein，MA)，P24(衣殼蛋白，capsid protein，CA)，P7(核殼體蛋白，nucleocapsid protein，NC)和 P6蛋白，它們是核心蛋白的主要組成成分.Gag的主要功能是RNA不受外界核酸酶破壞.

2.2 Pol

pol基因編碼病毒復(fù)制所需的酶類，其中P66蛋白為逆轉(zhuǎn)錄酶，P31蛋白為整合酶(integrase，IN).從pol和gag基因重疊區(qū)內(nèi)起始的一段序列為pro基因，它編碼蛋白酶P22，P22在裂解上述HIV前體形成終末成熟蛋白的過程起著重要作用.

2.3 Env

env基因編碼約863個氨基酸的前體蛋白并糖基化成HIV包膜糖蛋白前體gp160.該前體蛋白在蛋白酶作用下被切割成gp120和gp41，gp120暴露于病毒包膜之外稱為外膜蛋白，感染細(xì)胞時可與細(xì)胞的CD4受體蛋白結(jié)合，gp41稱為跨膜蛋白，是嵌入病毒包膜脂質(zhì)中的部分.當(dāng)gp120與CD4受體結(jié)合后，其構(gòu)象改變導(dǎo)致與gp41分離，暴露出的gp41可插入細(xì)胞膜，造成膜融合，導(dǎo)致病毒核心被導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi).

2.4 Tat

由tat基因編碼蛋白反式激活因子Tat，可與LTR結(jié)合，以增加病毒所有基因轉(zhuǎn)錄率，也能在轉(zhuǎn)錄后促進(jìn)病毒mRNA的翻譯.Tat作為反式激活因子還能調(diào)控感染及非感染細(xì)胞基因的表達(dá)，CNS中，能增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞 K+外流［5］、Ca2+內(nèi)流［6］.

2.5 Vif、Vpr、Vpu

病毒蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)因子(regulator of expression of viron proteins，Rev)能增加 gag和 env基因的表達(dá).4個附屬基因表達(dá)產(chǎn)物中病毒感染因子(virion infectivity factor，Vif)能在一些細(xì)胞因子協(xié)同下促進(jìn)HIV-1在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，病毒蛋白 R(viral protein R，Vpr)能使HIV-1在巨噬細(xì)胞中增殖，病毒蛋白 U(viral protein U，Vpu)僅存在于 HIV-1中，能促進(jìn)HIV-1從細(xì)胞膜上釋放.

2.6 Nef

負(fù)性因子(negative factor，Nef)在早期研究中被認(rèn)為可抑制HIV-1的復(fù)制.然而越來越多的證據(jù)表明Nef對 HIV-1的復(fù)制起了極其重要的正面作用［7］.

3 HIV-1進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)

尸檢報告中，大腦是人體中HIV-1感染率高居第二的器官［8］，在HIV-1感染的早期階段，病毒就進(jìn)入了中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起神經(jīng)系統(tǒng)病變，是艾滋病患者中常見的并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為記憶力、注意力與精細(xì)運(yùn)動功能障礙等，根據(jù)嚴(yán)重程度可分為無癥狀的神經(jīng)認(rèn)知損傷(asymptomatic neurocognitive impairment，ANI)、輕度神經(jīng)認(rèn)知障礙(mild neurocognitive disorder，MND)、HIV 相關(guān)性癡呆(HIV-associated dementia，HAD).病毒進(jìn)入CNS的方式主要包括1.轉(zhuǎn)胞吞作用;2.內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化后通過CSF(腦脊液)進(jìn)入 CNS［9－10］;3.特洛伊木馬假說(the Trojan horse model)，通過轉(zhuǎn)胞吞進(jìn)入CNS的病毒數(shù)量不到總數(shù)的1%，同樣，通過第二種方式的病毒也十分稀少［11－12］.目前普遍接受的是特洛伊木馬假說，即病毒通過感染外周血液的單核/巨噬細(xì)胞，通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周血液各種交流機(jī)制，通過血腦屏障(Blood-Brain Barrier，BBB)進(jìn)入腦組織，HIV-1不直接感染神經(jīng)元，其主要靶細(xì)胞是MPs(Mononuclear Phagocytes，MPs)，即包括腦巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和血管旁細(xì)胞.

4 HIV-1相關(guān)蛋白參與細(xì)胞自噬的機(jī)制及其對HAND的影響

4.1 Env

細(xì)胞表面表達(dá)的 HIV-1表面糖蛋白 Env，由gp120和gp41組成，在感染細(xì)胞表面表達(dá)，能通過與細(xì)胞上的CD4和CXCR4受體引發(fā)非感染細(xì)胞的自噬［13－14］.細(xì)胞表達(dá)縮短的 CD4(能與 gp120 結(jié)合但不能轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號)但不表達(dá)CXCR4則不發(fā)生細(xì)胞自噬.且Env介導(dǎo)的細(xì)胞自噬能被AMD3100(一種CXCR4阻滯劑)阻斷，說明這一過程需要CXCR4的參與.但CXCR4信號不直接參與自噬激發(fā)細(xì)胞死亡，當(dāng)靶細(xì)胞表達(dá)變異型CXCR4(不能轉(zhuǎn)導(dǎo)各種Gi蛋白依賴或非Gi蛋白依賴的信號、與CXCL12結(jié)合后仍發(fā)生內(nèi)化)與表達(dá)Env的細(xì)胞共培養(yǎng)后仍發(fā)生自噬［13］.

HIV-1進(jìn)入CNS后，gp120能從病毒體脫落下來，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞等產(chǎn)生細(xì)胞因子和促炎因子等，它對神經(jīng)元細(xì)胞自噬的影響較復(fù)雜.在體外實驗中，gp120能誘導(dǎo)神經(jīng)元的細(xì)胞自噬［15］，一種能連接到gp120 V3環(huán)上的藥物蘇拉明有阻斷Env介導(dǎo)細(xì)胞自噬的作用，表明gp120連接到CXCR4是這種細(xì)胞自噬現(xiàn)象的必要條件［13］.然而 gp120與 CXCR4結(jié)合以后的信號激活機(jī)制并不清楚，可能引起ROS的形成或造成氧化應(yīng)激狀態(tài)［16］，溶解的gp120能使T細(xì)胞激活且發(fā)生細(xì)胞自噬，在CNS中，可溶的gp120結(jié)合CXCR4后激活神經(jīng)細(xì)胞的凋亡程序，導(dǎo)致HIV誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性.

gp41在Env介導(dǎo)的細(xì)胞自噬中起重要作用，其融合肽直接激發(fā)Env介導(dǎo)的細(xì)胞自噬，研究發(fā)現(xiàn)gp41FP段第二個氨基酸發(fā)生Val→Glu替代后與CD4+T共培養(yǎng)后細(xì)胞不發(fā)生細(xì)胞自噬現(xiàn)象.另外，刪除gp41的C末端能增強(qiáng)Env介導(dǎo)的細(xì)胞自噬，將野生型的Env(由gp120和gp41組成)及Env△t(gp41C末端最后144個氨基酸被刪除)在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并與CD4+T共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)Env組的細(xì)胞融合現(xiàn)象明顯強(qiáng)于 Env△t［13］.

由此可以看出，這一機(jī)制使得HIV通過Env與其受體CD4/CXCR4結(jié)合后進(jìn)入非感染細(xì)胞，從而引起非感染的旁觀細(xì)胞的自噬［13］，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，HIV-1不直接感染神經(jīng)元，其神經(jīng)毒性很可能是通過Env與神經(jīng)元表面表達(dá)的趨化因子受體CXCR4結(jié)合引起的細(xì)胞自噬而發(fā)揮作用.這給HAND的治療和預(yù)防提供了一個重要的依據(jù).

4.2 Gag

Gag為HIV的核心蛋白，由gag基因編碼，經(jīng)蛋白酶水解形成P17(基質(zhì)蛋白)，P24(衣殼蛋白)P7(核殼體蛋白)和P6蛋白，總的來說，核心蛋白能將病毒RNA及各種酶類包裹起來，使其不受外界核酸酶破壞.研究表明P24和P17與細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3存在共定位，其中，P24在神經(jīng)退行性病變病人中水平上升［10］.Gag與 Nef共同參與 LC3-Beclin 1復(fù)合物，提示Gag與細(xì)胞自噬通路的交叉作用可能與Nef有關(guān).另外，細(xì)胞自噬溶酶體的降解產(chǎn)物通過MHC-II的處理，能被 CD4+T 細(xì)胞識別［16］，研究發(fā)現(xiàn)通過將Gag靶向融合至細(xì)胞自噬小體上，發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞的反應(yīng)性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致更多的免疫細(xì)胞死亡，這一過程在AIDS的進(jìn)展中十分關(guān)鍵，提示Gag可能利用細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞自噬，改變CD4+T識別信號機(jī)制［19］.而外周免疫細(xì)胞的激活產(chǎn)生的細(xì)胞因子免疫信息(IL，TNF-α，IFN-β 等)可通過迷走神經(jīng)及體液性“流動腦”途徑(包括可飽和運(yùn)輸途徑及通過腦室周圍器和通過介質(zhì)如前列腺素)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行交流，這些免疫信息在HAND的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用.

4.3 Nef

Nef在HIV-1引起的細(xì)胞自噬中至關(guān)重要，Nef不與mTOR共定位，所以不太可能通過直接影響mTOR通路而改變細(xì)胞的自噬功能.Nef阻止細(xì)胞自噬成熟階段，引起早期細(xì)胞自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-II和LC3累積.在HIV-1感染過程中有Nef-Beclin1復(fù)合體形成，或Nef與Beclin1直接/通過中間物連接，而Nef能影響hVPS34分布，由于 Nef與 Beclin1的聯(lián)系，導(dǎo)致了hVPS34在膜上表達(dá)增加［16］.哺乳動物中Beclin 1-hVPS3復(fù)合體(與酵母中Atg14等價)，在細(xì)胞自噬起始中起特殊作用［20］.變異型Nef(174DD175→174AA175)失去與Beclin1及LC3-II的相互作用能力，因此，這一片段對Nef控制細(xì)胞自噬流的功能十分關(guān)鍵［21］.

因此，Nef可能保護(hù)感染的巨噬細(xì)胞，使其免受死亡，從而使病毒顆粒免受細(xì)胞自噬作用的消除［22］.進(jìn)一步使 HIV產(chǎn)量增高，而 HIV產(chǎn)量對HAND 的進(jìn)程十分關(guān)鍵［23－24］，因此，利用藥物等干涉HIV感染的巨噬細(xì)胞的自噬，可能延遲或防止HAND的臨床進(jìn)展.

4.4 Tat

在HIV-1相關(guān)的所有蛋白質(zhì)中，Tat是病毒復(fù)制最關(guān)鍵的蛋白質(zhì)［25］.HIV-1進(jìn)入CNS后，感染的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞能分泌 Tat，在離體實驗內(nèi)［26－27］和小鼠模型［28］中已證實，Tat能引起神經(jīng)退行性變及神經(jīng)炎癥.進(jìn)一步實驗表明，Tat引起的神經(jīng)退行性變及神經(jīng)炎癥定位在小鼠海馬內(nèi)，這些作用可能通過改變細(xì)胞自噬過程而實現(xiàn).細(xì)胞自噬抑制劑BafA1能阻斷自噬小體與溶酶體的融合過程，引起上游產(chǎn)物L(fēng)C3、LC3II和SQSTM1的累積，在神經(jīng)元內(nèi)同時加入 Tat和 BafA1后，LC3、LC3II和SQSTM1水平降低，因此，Tat可能加強(qiáng)細(xì)胞自噬小體與溶酶體的融合，進(jìn)一步研究表明，Tat能與溶酶體相關(guān)膜蛋白2(receptor lysosome-associated membrane protein，LAMP2a)結(jié)合，而細(xì)胞自噬體與溶酶體的融合是通過 LAMP2a 完成的［29－30］，Tat與之的結(jié)合改變了下游信號.超微結(jié)構(gòu)分析顯示，Tat改變了神經(jīng)元內(nèi)絕大部分自噬小體的形態(tài)，這些自噬小體多為高電子密度畸形狀態(tài).因此，Tat可能通過改變細(xì)胞自噬，過早或選擇性地降解神經(jīng)元活動必須的細(xì)胞器，從而導(dǎo)致神經(jīng)退行性變和神經(jīng)炎癥，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而體內(nèi)實驗已經(jīng)證實，Tat這種通過改變細(xì)胞自噬致細(xì)胞死亡的作用能被細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑 Rapam(雷帕霉素)逆轉(zhuǎn)［31］.此外，Tat還能通過在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)BAG3(Bcl-2相關(guān)抗凋亡基因3)從而誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的自噬，在感染HIV-1的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞內(nèi)BAG3的表達(dá)增強(qiáng)［32］，最近的研究表明，BAG3參與啟動細(xì)胞自噬小體的形成［33－36］.因此，通過進(jìn)一步研究 Tat與 LAMP2a 及BAG3的作用機(jī)制，將有可能合理利用細(xì)胞自噬，從而預(yù)防或緩解神經(jīng)退行性變及神經(jīng)炎癥，減少神經(jīng)元的死亡，修復(fù)損傷神經(jīng)元，預(yù)防或治療HAND.

4.5 Vif

HIV-1利用宿主蛋白降解系統(tǒng)消除宿主內(nèi)限制其復(fù)制的因子，研究表明HIV-1病毒感染因子(virion infectivity factor，Vif)參與這一機(jī)制，在病毒體的產(chǎn)生和體內(nèi)傳播起重要作用［37－38］.Vif在 HIV-1 感染過程中可抑制細(xì)胞自噬，并且這種抑制作用不依賴于A3G(apolipoprotin B mRNA-editing catalytic polypeptide 3 protein G，一種天然抗病毒活性的胞嘧啶脫氨基酶，具有廣譜的抗病毒作用，人體固有的免疫蛋白分子).進(jìn)一步研究表明，Vif通過C末端片段直接與LC3連接，這一片段起始與鋅指延續(xù)到SOCS模體，其中SOCS模體及LC3的第120位氨基酸甘氨酸在連接中起重要作用，由此抑制細(xì)胞自噬小體的形成，促進(jìn)病毒復(fù)制［39］.其對HAND的促進(jìn)作用可能和Nef一致，都是通過增加病毒復(fù)制產(chǎn)量，從而使各類病毒蛋白產(chǎn)量增加，病毒在人體內(nèi)的循環(huán)周期延長，影響范圍更廣.

5 結(jié)語

HIV-1相關(guān)蛋白在與細(xì)胞自噬的相互作用中，并不是完全抑制也不是完全促進(jìn)細(xì)胞自噬，HIV-1相關(guān)蛋白能通過不同的靶點改變細(xì)胞自噬過程從而改變其原有的功能，最終效應(yīng)都能加速HAND的發(fā)生和發(fā)展.因此，對HIV-1相關(guān)蛋白與細(xì)胞自噬間相互作用的進(jìn)一步研究，以及如何干預(yù)細(xì)胞自噬對HAND的影響，將可能為今后防治HAND提供重要靶點及新的策略.

圖1 HIV相關(guān)蛋白與細(xì)胞自噬的相互作用Fig.1 The interaction between HIV-1 proteins and the pathway of autophagy

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