不同時間的乳化氟碳保存液處理對供體肺抗炎抗氧化能力及組織結構的影響

易艷萍， 楊成林， 彭雪梅， 盧春英， 鄒啟榮， 謝娟華， 李佳陽

(1.暨南大學第一附屬醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510630;2.深圳龍華新區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，廣東深圳518109)

目前肺移植已成為治療終末期肺病的唯一有效的方法.UW(the University of Wisconsin solution，UWs)液是目前供器官灌注及冷保存的標準保存液，并已廣泛應用于臨床.乳化氟碳(作為一種新的器官保存液，它以快速而又充分的向組織供氧，加快血流速度，增加器官供血量，改善微循環(huán)逐步受到關注［1－3］.本研究比較乳化氟碳和 UW液在不同時段對保存肺抗炎、抗氧化能力和組織結構的影響，進一步探討乳化氟碳保存液對供體肺的保存效果.

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

(1)實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠48只，體質量350～400克，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供.

(2)實驗試劑 UW液(Bristol-Myers squibb，美國)，乳化氟碳保存液(FCE)(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司)，MDA(丙二醛，Malondialdehyde)和 SOD(超氧化物歧化酶，Superoxide Dismutase)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)，MPO(髓過氧化物酶，Myeloperoxidase)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，IL-1β(白細胞介素-1β，Interleukin-1β)、IL-6(白細胞介素-6，Interleukin-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司).

1.2 實驗方法

(1)實驗分組 將48只350～400克SD雄性大鼠隨機分為2組［FCE組(乳化氟碳保存液，Perfluorocarbon Emulsions)與UW組］，每組24只，其中FCE組又隨機分為FCE-6 h組與FCE-12 h組，UW液組隨機分為UW-6 h組與UW-12 h組，每組均為12只.FCE組均采用FCE保存液灌注與保存，分別置于溫度為0～4℃中保存6 h和12 h;UW組采用UW液灌注與保存，同樣分別置于溫度為0～4℃中保存6 h和12 h.在相應的保存時間段后取肺組織檢測SOD及MPO活性及MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，并取肺組織制成光鏡和電鏡切片觀察病理改變和超微結構的變化.

(2)離體肺模型的建立與處理 參照Fischer's［4］所述方法建立離體肺模型，大鼠麻醉前30 min用硫酸阿托品0.4 mg/kg行肌肉注射，用質量分數(shù)為1%戊巴比妥鈉50 mg/kg行腹腔注射進行麻醉，麻醉后行氣切置管，呼吸機維持通氣，設置潮氣量8 mL/kg，通氣頻率60次/min，正中開胸，游離上、下腔靜脈，經下腔靜脈500 U/kg肝素對大鼠進行全身肝素化.將灌注管(22號靜脈穿刺針)自右心室插入肺總動脈.結扎上下腔靜脈，用4℃ UW液(UW組)或乳化氟碳保存液(FCE組)對肺動脈順行灌注，速率為4 mL/min，并剪開左心耳減壓左心，灌注至雙肺組織成灰白色，灌注過程中肺持續(xù)通氣.灌注完畢后在肺中度膨脹時快速結扎氣管，切除整塊心肺置于4℃ UW液(UW組)或乳化氟碳保存液(FCE組)中分別保存6 h和12 h.

1.3 標本的取樣與檢測

(1)光鏡標本 在保存相應的時間段后取出供肺，取各組相同部位肺組織于體積分數(shù)為4%多聚甲醛溶液固定后，行HE染色后切片觀察肺組織病理學結果并行病理評分.由同一位實驗者在光鏡下觀察以下項目:肺泡壁完整性、間質充血、肺泡內出血、間質水腫、炎癥細胞;并進行病理評分:無病理改變評為1分，病理變化輕微且位置局限為2分，病理變化顯著但位置局限或病理變化輕微但病變廣泛為3分，廣泛顯著病理改變?yōu)?分.

(2)電鏡標本 取各組相同部位肺組織于戊二醛溶液固定后，制備電鏡超薄切片，觀察超微結構的變化.

(3)炎癥及氧化指標標本 取各組相同部位肺組織用無菌冷磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后加入生理鹽水，再經勻漿、離心后吸取上清液，采用ELISA法測定 MPO 活性和 IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量，TBA法測定MDA含量，WST法測定SOD活性，嚴格按照試劑盒說明書操作.

1.4 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理及分析，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，組間比較采用成組t檢驗，病理評分進行兩個獨立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗.P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 UW 組與 FCE 組供肺組織 IL-6、IL-1β、TNF-α的比較

兩組供肺組織 IL-6、IL-1β、TNF-α 在 6 h、12 h時間比較無差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1.

表1 UW組與FCE組在不同時間點的IL-6，IL-1β，TNF-α含量的比較Table 1 Comparison of the levels of IL-6，IL-1β，TNF-α at different time point in the two groups± s，n=12)

表1 UW組與FCE組在不同時間點的IL-6，IL-1β，TNF-α含量的比較Table 1 Comparison of the levels of IL-6，IL-1β，TNF-α at different time point in the two groups± s，n=12)

1)各時間，兩組各指標比較P＞0.05

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2.2UW組與FCE組供肺組織SOD與MPO活性、MDA含量比較

UW組與FCE組的供肺組織的SOD活性、MDA含量比較無差異(P＞0.05);6 h組SOD活性低于相應的12 h組，MDA含量和MPO活性高于相應的12 h組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);UW組兩時間點的MPO活性低于FCE組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見表2.

2.3 病理積分

病理積分UW液組病理積分高于FCE組(P＜0.05);兩組6 h病理積分低于12 h，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表3.

表2 UW組與FCE組在不同時間點的SOD和MPO活性、MDA含量的比較Table 2 Comparison of the activity of SOD、MPO and the content of MDA at different time point in the two groups(±s，n=12)

表2 UW組與FCE組在不同時間點的SOD和MPO活性、MDA含量的比較Table 2 Comparison of the activity of SOD、MPO and the content of MDA at different time point in the two groups(±s，n=12)

1)P＞0.05 vs.UW group，2)P ＜0.05 vs.6 h group，3)P ＜0.05 vs.UW group.

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表3 兩組兩時間點的供組織光鏡下病理積分比較Table 3 Comparison of the histopathological score at different time point in the two groups(±s，n=12)

表3 兩組兩時間點的供組織光鏡下病理積分比較Table 3 Comparison of the histopathological score at different time point in the two groups(±s，n=12)

1)P ＜0.05 vs.UW group，2)P ＜0.05 vs.6 h group.

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2.4 供肺組織光鏡下病理變化

FCG-6 h組、FCE-12 h組肺組織結構清晰較完整、無間質充血和水腫，無肺泡內出血，少量肺泡壁斷裂(黑色箭頭)，少量肺泡隔增厚(藍色箭頭)(見圖1 A、B)，少量肺泡隔增厚(藍色箭頭)少量炎癥細胞(紫色箭頭)(見圖1 E、F);UW-6 h組、UW-12 h組肺組織結構清晰完整性較差，肺泡壁斷裂(黑色箭頭)、肺間質及肺泡見少量紅細胞滲出(紅色箭頭)，肺泡上皮細胞及內皮細胞見空泡化(綠色箭頭)及大量炎癥細胞(紫色箭頭)(見圖1C、D、G、H).

2.5 供肺組織超微結構變化

電鏡下UW-6 h組肺泡上皮細胞及血管內皮細胞邊界較清楚，線粒體輕度腫脹，Ⅱ型肺泡上皮細胞板層小體模糊不清，F(xiàn)CE-6 h組肺泡上皮細胞及血管內皮細胞結構完整，邊界清楚;線粒體嵴較完整，輕度腫脹(圖2A、C紅色箭頭)，Ⅱ型肺泡上皮細胞板層小體清晰可見.電鏡下UW-12 h組肺泡上皮細胞及血管內皮細胞腫脹明顯(圖2B紅色箭頭)，線粒體嵴結構不清;基底膜可見中斷;Ⅱ型肺泡上皮細胞板層小體模糊，部分已經空泡化(圖2B).FCE-12 h組肺泡上皮細胞及血管內皮細胞有輕度腫脹(圖2D紅色箭頭)，線粒體嵴較完整;基底膜連續(xù);Ⅱ型肺泡上皮細胞板層小體消失，空泡形成(圖2D).

圖1 兩時間點光鏡下兩組供肺組織病理變化Fig.1 The pathological changes of lung tissue of the two groups at different times under the light microscopy

圖2 兩時間點電鏡下兩組供肺組織超微結構變化Fig.2 The ultrastructure changes of lung tissue of the two groups at different times under the electron microscopy

3 討論

乳化氟碳保存液因其顆粒小、攜氧高、氣體交換迅速，是良好人工氧載體，能快速充分向缺血組織供氧，抑制白細胞及血小板的聚集，改善微循環(huán)，有利于物質交換和代謝［5－6］.乳化氟碳作用于離體腎臟、心臟和肝臟已有大量研究［2，7－8］，但在離體肺中的作用研究較少.本研究通過與常用器官移植保存液UW液對比，探索FCE在供肺組織中的作用.肺不同于肝、腎等實體器官，它是一個空腔臟器，安全的冷缺血保存時限短，保存時間僅 4～6 h［9］，易發(fā)生嚴重的缺血再灌注損傷，導致早期移植肺水腫和肺功能喪失.一般來說肺發(fā)生缺血再灌注損傷的最直接原因是肺在保存過程中所經歷的缺血缺氧［10］.良好的器官保存液對延長肺的保存時間及提高供肺的質量意義重大.

本研究發(fā)現(xiàn)兩組保存液在兩個時段的抗炎作用無明顯差異，兩組供肺組織IL-6、IL-1β、TNF-α的比較差異無統(tǒng)計學意義，因IL-6、IL-1β、TNF-α均為早期肺損傷促炎因子，能反映早期肺組織炎癥損傷程度.表明FCE保存液能下調炎癥因子的表達，減輕促炎反應，與氟碳能在細胞表面形成一種密集但又具有擴散性能的物理屏障有關［11］，它屏蔽了各種炎性介質、炎性細胞對靶細胞的接觸，起到了對肺的抗炎保護作用;UW液含有的腺苷具有抗炎作用［12－13］.也因供肺缺少血液有形成分，不易啟動瀑布式炎癥級聯(lián)反應而產生大量炎性因子［14］.

MPO其水平及活性變化代表著多形核白細胞(PMN)的功能和活性狀態(tài)，反映中性粒細胞數(shù)量;MDA的含量反映脂質過氧化的程度，而SOD的高低則可以間接反映機體清除氧自由基的能力.FCE與UW液均可減輕供肺保存期氧化損傷并較好的維持供肺抗氧化損傷的能力，F(xiàn)CE與其高效攜氧性有關，UW液則與其中所含有的谷胱甘肽能中和氧自由機有關［15］.本研究發(fā)現(xiàn):UW液兩個時段組MPO活性均高于FCE兩組，說明FCE保存液可以更好的抑制中性粒細胞的活化與聚集，穩(wěn)定中性粒細胞，減少供肺的氧化損傷，F(xiàn)CE可通過減輕PMN的趨化反應進而減少PMN肺內聚集［16］.本研究還發(fā)現(xiàn)隨著保存時間的延長，兩組的SOD活性逐漸降低，MDA含量與MPO活性逐漸增高，可能因溶解在FCE中的氧逐漸耗盡，它造成了組織缺氧導致炎癥反應的發(fā)生，使得其穩(wěn)定中性粒細胞，抑制其活化與聚集的能力減弱，被激活的中性粒細胞產生大量氧自由基，加重肺損傷［17］;UW液可能因高K+使肺組織血管收縮，血液中有形成分不易沖走，導致炎癥細胞浸潤，產生大量氧自由基［13］.此外，本研究供肺組織的病理積分FCE組優(yōu)于UW組，6 h組優(yōu)于12 h組，表明FCE能更好的抑制炎癥細胞如中性粒細胞的活化，從而降低內皮細胞和上皮細胞及基底膜屏障的通透性，減輕肺間質和肺泡的水腫，達到肺保護的作用［18］.

綜上所述，乳化氟碳在供體肺中具有抗炎抗氧化能力，且乳化氟碳的抗氧化能力在兩個不同時段均強于UW液，對供肺的保存效果優(yōu)于UW液，而以保存6 h效果最佳.

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