不同產(chǎn)地博落回各部位血根堿與白屈菜紅堿含量分析

鄒惠亮， 何家希， 趙晶晶， 周光雄

(1.暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥及天然藥物研究所，中藥和天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與新藥研究廣東省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632;2.廣東省婦幼保健院藥學(xué)部，廣東廣州511400)

博落回［Macleaya cordata(Willd)R.B］系罌粟科博落回屬多年生植物，又名勃勒回、落回、號(hào)筒桿、三錢三等［1］，在我國分布廣泛，主要分布于安徽、廣東、浙江、福建等多個(gè)省［2－3］，具有殺蟲、止癢、清熱、解毒等功效.現(xiàn)代藥理和化學(xué)成分研究表明:博落回的主要活性成分為生物堿，具有殺蟲殺蛆、抗菌、消腫、抗腫瘤等作用［4－6］.其中血根堿和白屈菜紅堿是其兩個(gè)含量最高的生物堿類成分.已有文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC法測(cè)定博落回各器官中原阿片堿和別隱品堿的含量［7］，而對(duì)于不同產(chǎn)地博落回中各部位血根堿與白屈菜紅堿含量的研究卻鮮有報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地博落回根、莖、葉和果實(shí)4個(gè)不同部位中血根堿、白屈菜紅堿的含量，為更好地利用博落回植物資源獲得血根堿、白屈菜紅堿提供參考依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 供試藥材

博落回的根、莖、葉和果實(shí)4個(gè)不同部位采自安徽省績溪縣的6個(gè)不同地點(diǎn)，分別為莊年村、梅干嶺、楊村陽山、楊村陰山、石岑村、下屋山村.樣品采集以每個(gè)地點(diǎn)采集一株植株，其根、莖、葉和果來自同一植株.樣品經(jīng)暨南大學(xué)周光雄教授鑒定，均為博落回(Macleaya cordata)植株的不同部位.

1.2 儀器與試劑

Agilent 1200型液相分析色譜儀;Welch Material XB-C18 分析色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);乙腈為色譜純，其他試劑為分析純;血根堿和白屈菜紅堿(本實(shí)驗(yàn)室提供，純度在99%以上，結(jié)構(gòu)式見圖1).

圖1 血根堿和白屈菜紅堿的結(jié)構(gòu)1.sanguinarine，2.chelerythrineFig.1 The sructures of sanguinarine and chelerythrine

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Welch Material XB-C18分析色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:(A)0.1% 冰乙酸水溶液，(B)乙腈，梯度洗脫(0～24 min，體積分?jǐn)?shù)為10% ～46%的B);流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;柱溫:25 ℃;檢測(cè)波長:270 nm.見圖 2.

圖2 血根堿、白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品及博落回總生物堿的HPLC色譜圖A.sanguinnarine，B.chelerythrine，C.The mixture of two references，D.total alkaloidesFig.2 HPLC chromatograams of sanguinnarine，chelerythrine references，and The totaal alkaloides fraction from M.cordata

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

分別精密稱取鹽酸血根堿4.39 mg和鹽酸白屈菜紅堿5.00 mg，置10 mL量瓶中，加少量甲醇超聲溶解，冷卻后用甲醇定溶至10 mL，搖勻，即得.

2.3 樣品溶液制備

取博落回待測(cè)樣品1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入 50 mL v甲醇∶v1%鹽酸=1∶1，超聲提取 60 min，濾過，搖勻.精密量取9 mL濾液于10 mL容量瓶中，加入氨水堿化并補(bǔ)齊至刻度，搖勻，pH值為9～10.取3 mL堿化后濾液過SPE柱吸附樣品，用無水乙醇完全洗脫至5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，過微孔濾膜(0.45 μm)，即得.

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 10、50、100、200、400 μL，分別置于5個(gè)1 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣5 μL.按照2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.結(jié)果顯示在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)血根堿與白屈菜紅堿的線性關(guān)系良好(見圖3).

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每次進(jìn)樣5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，考察精密度.結(jié)果血根堿與白屈菜紅堿峰面積的RSD分別為1.7%和1.3%(n=6).

圖3 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品血根堿和白屈菜紅堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線left.sanguinnarine，right.ChelerythrineFig.3 Standard curves of sanguinnarine and chelerythrine feferences

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一個(gè)博落回樣品6份，每份1 g，按2.3項(xiàng)的制備方法制備樣品溶液，并按照2.1的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果樣品中血根堿與白屈菜紅堿含量的RSD分別為1.5%和1.3%(n=6).

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取博落回同一供試品溶液，分別于 0、2、4、8、10、12 h，按照2.1的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果血根堿與白屈菜紅堿峰面積的RSD分別為2.1%和1.2%(n=6)，表明溶液12 h內(nèi)基本穩(wěn)定.

2.8 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)定生物堿含量的博落回樣品3份，每份1 g，分別加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，按2.3項(xiàng)方法制備樣品溶液，并按照2.1的色譜條件進(jìn)行測(cè)定.結(jié)果血根堿與白屈菜紅堿的平均回收率分別為95.6%和96.9%，RSD分別為1.06%、0.6%(n=3).

2.9 樣品含量測(cè)定

按2.3項(xiàng)方法制備樣品溶液，分別進(jìn)樣5 μL，測(cè)定，每組重復(fù)3次.計(jì)算供試品溶液中血根堿與白屈菜紅堿量(以鹽酸鹽計(jì))，結(jié)果見表1.

表1 樣品中血根堿、白屈菜紅堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Percent contents of sanguinnarine and chelerythrine in samples from M.cordata (mg/g)

3 討論

通過對(duì)血根堿、白屈菜紅堿對(duì)照品溶液在200～400 nm波長掃描，結(jié)果顯示血根堿、白屈菜紅堿在270 nm波長處均有較大吸收，且基線較為平穩(wěn)，所以選擇270 nm為檢測(cè)波長.通過對(duì)比多種流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)用乙腈/0.1%冰乙酸做流動(dòng)相，基線穩(wěn)定，分離度好，峰形對(duì)稱，確定用該溶劑系統(tǒng)作為流動(dòng)相.本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定博落回不同部位中血根堿、白屈菜紅堿的定量檢測(cè)方法，該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高.從對(duì)博落回不同部位的血根堿與白屈菜紅堿含量的測(cè)定結(jié)果中可以看出，這兩種生物堿的含量在不同的部位之間存在明顯差異，在根、莖、葉和果實(shí)4個(gè)不同部位中呈現(xiàn)依次遞增的趨勢(shì).然而，從所采集藥材的不同地點(diǎn)之間進(jìn)行比較，這兩種生物堿的含量也存在一定的差異，如在根、莖和葉等同部位樣品中血根堿和白屈菜紅堿高含量樣品中含量可達(dá)低含量樣品的1.34～4.93倍.但在不同采集地點(diǎn)果實(shí)中血根堿和白屈菜紅堿含量則差異要小得多，分別為1.37和1.25倍，含量相對(duì)較穩(wěn)定一致.植物不同采集地點(diǎn)同部位樣品之間兩生物堿含量的顯著差異顯然與植物環(huán)境、生長狀態(tài)有密切關(guān)系.此外，植物根、莖和葉等營養(yǎng)器官中血根堿和白屈菜紅堿含量與果實(shí)中含量比較雖然相對(duì)較低，但其生物量較果實(shí)生物量大得多，故仍可作為提取血根堿和白屈菜紅堿的重要資源.

［1］王瑾瑜，任亞萍.博落回屬植物化學(xué)成分的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，15(17):41－42.

［2］鐘 明，曾建國，陳應(yīng)莊，等.博落回中微量生物堿的研究進(jìn)展［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27(1):387－388.

［3］江蘇省新醫(yī)學(xué)院編.中藥大辭典(下冊(cè))［M］.上海:科學(xué)技術(shù)出版社，1986，2386－2387.

［4］DENG A J，QIN H L.Cytotoxic dihydrobenzophenanthridine alkaloids from the roots of Macleaya microcarpa［J］.Phytochemistry，2010，71(7):816－822.

［5］楊 軍，王 靜，劉信順，等.博落回的藥效研究［J］.中藥材，1999，2(2):82－85.

［6］郭小清，康莉平，聶建超，等.博落回的藥理作用及其在動(dòng)物保健中的應(yīng)用［J］.中國動(dòng)物保健，2005，(4):24－25.

［7］黃 敬，曾建國，羅衛(wèi)梅，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定博落回不同部位原阿片堿、別隱品堿的含量［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30(1):41－43.