聚丁二酸丁二醇酯薄膜的微生物降解與水溶性產(chǎn)物

許國光， 熊 雯， 林炎群， 屠 美，2， 曾 戎，2， 容建華，2， 趙劍豪，2

(1.暨南大學(xué)理工學(xué)院材料科學(xué)與工程系，廣東廣州510632;2.人工器官及材料教育部工程研究中心，廣東廣州510632)

聚烯烴等不可降解塑料的廣泛應(yīng)用已引起日益嚴(yán)重的“白色污染”問題［1－2］.填埋、焚燒和回收利用等傳統(tǒng)處理手段存在占用大量土地、釋放有毒氣體和高回收成本等缺點，使用可完全生物降解塑料才是解決“白色污染”的根本途徑.聚丁二酸丁二醇酯(poly butylene succinate，PBS)因其可生物降解性、低成本、力學(xué)性能好和易加工等優(yōu)點而成為最有發(fā)展前景的可生物降解塑料［3－4］.PBS在堆肥條件下的降解研究表明，PBS可被微生物降解成二氧化碳、水和生物質(zhì)，顯示出環(huán)境友好性［5－7］.但是，微生物降解的過程復(fù)雜，一般認(rèn)為，PBS先在微生物酶的催化作用下水解成水溶性的低分子量中間產(chǎn)物，然后再被微生物同化吸收生成二氧化碳和水.研究這些水溶性中間產(chǎn)物的組成及其對周圍環(huán)境和微生物的影響，對從本質(zhì)上揭示PBS在環(huán)境中的生物降解行為和環(huán)境友好性有重要意義，但目前國內(nèi)外對相關(guān)研究鮮有報道.

本實驗研究了PBS薄膜在堆肥微生物作用下的生物降解行為，對薄膜表面形貌、水溶性降解產(chǎn)物的組成及其對降解介質(zhì)pH值和微生物的影響進(jìn)行了分析.

1 實驗

1.1 試劑與儀器

PBS(Mn=7.4×104Da):上海昭和高分子有限公司;堆肥菌種(含有多種環(huán)境微生物群):廣州農(nóng)冠生物科技有限公司;基礎(chǔ)培養(yǎng)液(pH=7.2)［8］:1 L 無菌水中含有 1.0 g(NH4)2SO4，0.2 g KH2PO4，1.6 g K2HPO4，0.2 g MgSO4·7H2O，0.1 g NaCl，0.02 g CaCl2·2H2O，0.01 g FeSO4·7H2O，0.5 mg Na2MoO4·2H2O，0.5 mg Na2WO4·2H2O，0.5 mg MnSO4.其他試劑均為分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠.

場發(fā)射掃描電子顯微鏡(UltraTM55 FESEM，德國Zeiss公司);pH計(Mettler Toledo，中國);超高效液相色譜－質(zhì)譜儀(UPLC－MS)(Waters UPLC XEVO TQMS，美國).

1.2 實驗過程

PBS薄膜的制備:PBS薄膜由澆鑄成型法制備.用氯仿配制質(zhì)量濃度為0.03 g·mL－1的PBS溶液，澆鑄到培養(yǎng)皿中，室溫下使大部分溶劑緩慢揮發(fā)后，再真空干燥3 d以除盡殘余的氯仿，得到厚度約為200 μm的PBS薄膜，裁成1 cm×1 cm的小片待用.

PBS薄膜的生物降解:將一定量的堆肥微生物分散到10 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中得到2.8×107/mL的微生物懸浮液，然后加入30 mg經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為75%酒精消毒的PBS薄膜，在搖床中(130 r，30℃)培養(yǎng)10 W.相同條件下，無微生物作用下的PBS薄膜降解作為對照組.

1.3 測試與表征

PBS薄膜在生物降解前后的表面形貌用SEM觀察.加速電壓為5 kV，觀察前PBS薄膜進(jìn)行噴金處理.

PBS薄膜在降解過程中水溶性降解中間產(chǎn)物對介質(zhì)pH值的影響用pH計測定.

微生物生長評價:通過菌落生長法評價水溶性降解中間產(chǎn)物對微生物生長的影響［4］.將質(zhì)量為10 g蛋白胨，3 g濃縮牛肉汁，5 g NaCl和20 g瓊脂溶解于1 L去離子水中制成pH=7.0的營養(yǎng)瓊脂.經(jīng)高壓蒸汽滅菌(100 kPa，120℃，30 min)后，將營養(yǎng)瓊脂倒到培養(yǎng)皿中冷至室溫.然后，將100 μL經(jīng)過稀釋的含有微生物的降解液涂布到營養(yǎng)瓊脂表面，在30℃下培養(yǎng)72 h.最后計數(shù)營養(yǎng)瓊脂表面上的菌落數(shù).

水溶性產(chǎn)物分析:用超高效液相色譜－質(zhì)譜儀(UPLC－MS)(Waters UPLC XEVO TQMS，美國)分析水溶性降解中間產(chǎn)物的組成.色譜柱為Waters Spheisorb C18 column(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相為體積分?jǐn)?shù) 0.1%乙酸/乙腈(v乙酸∶v乙腈=70∶30)，流速為0.2 mL/min.使用電噴霧離子化源(ESI)和正離子(+H+)模式進(jìn)行質(zhì)譜分析:毛細(xì)管電壓2.5 kV，錐孔電壓20 kV，離子源溫度150℃，去溶劑化溫度350℃，N2流速650 L/h.采用選擇離子檢測技術(shù)(SIM)對質(zhì)荷比(m/z)為0～600的各種水溶性降解產(chǎn)物進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 表面形貌

PBS薄膜在降解前后的表面形貌如圖1所示.降解前，PBS薄膜表面光滑，但非生物降解10 W后，膜表面明顯變粗糙，這是由于PBS薄膜表面發(fā)生水解，生成的降解產(chǎn)物從表面剝離后形成的［9］.而在生物降解組，可看到許多桿狀微生物在PBS薄膜上黏附，并長出偽足;同時還可看到在微生物所在的位置下面出現(xiàn)孔洞.這可能是兩方面因素引起的:①降解產(chǎn)生的水溶性產(chǎn)物分散到了介質(zhì)中;②降解產(chǎn)生的水溶性產(chǎn)物被微生物同化吸收.根據(jù)形貌特征，這些桿狀微生物很可能是桿狀細(xì)菌［7］.

圖1 PBS薄膜在非生物降解與生物降解條件下的SEM圖(a)before degradation，(b)after abiotic degradation for 10 weeks，(c，d)after biotic degradation for 10 weeks.Fig.1 SEM images of PBS films for abiotic and biotic degradations

2.2 介質(zhì)pH值和微生物生長

降解產(chǎn)生的水溶性中間產(chǎn)物對介質(zhì)pH值的影響如圖2所示.在整個非微生物降解過程中，pH值都在7.0左右浮動，這說明此條件下降解產(chǎn)物對介質(zhì)pH值影響不大.相反，在微生物作用下，pH值在前兩周從7.2下迅速降至3.8，然后慢慢地回升至7.2左右.pH值的顯著下降應(yīng)該與降解產(chǎn)生大量酸性水溶性產(chǎn)物有關(guān)［10］.而隨后 pH值回彈，這可能是生成的酸性產(chǎn)物逐漸被微生物消化，導(dǎo)致酸性產(chǎn)物濃度下降的原因.因為在這個體系中，PBS是微生物的唯一碳源，微生物依靠對降解產(chǎn)物的同化吸收來獲得營養(yǎng)而生長.這說明在PBS膜發(fā)生降解的過程中也同時存在微生物對降解產(chǎn)物同化吸收的過程.圖3a是微生物隨降解時間的生長曲線，與pH值的變化趨勢相似，正好說明pH值的變化與微生物以酸性產(chǎn)物為碳源的生長有關(guān).另外，從圖3b還可看出，在pH值最低的第2周(pH=3.8)，有許多微生物死亡，這說明微生物的生長受到酸性環(huán)境的抑制.此后，pH值逐漸回升，微生物快速生長，這可能是隨著降解時間的延長，微生物的數(shù)量越來越多，對降解產(chǎn)物的消耗也越來越快，所以介質(zhì)的pH不斷回升，從而酸化的影響也逐漸消失了.可見，介質(zhì)pH值的變化和微生物的生長取決于酸性產(chǎn)物的生成速率和微生物對產(chǎn)物的同化速率的相對快慢.

圖2 在非生物降解與生物降解條件下介質(zhì)pH值隨降解時間的變化曲線圖Fig.2 Change in medium pH as a function of time during abiotic and biotic degradations

圖3 微生物活性隨降解時間的變化和PBS薄膜在生物降解2周后的SEM照片(a)Microorganism viability as a function of time in biotic degradation，(b)SEM image of PBS film surface after biotic degradation for 2 weeksFig.3 Microorganism viability as a function of time in biotic degradation and SEM image of PBS film surface after biotic degradation for 2 weeks

2.3 水溶性降解產(chǎn)物

圖4是PBS薄膜在降解2周時生成的水溶性降解產(chǎn)物的UPLC譜圖.在4.5 min處是溶劑峰，其他峰為各種降解產(chǎn)物的吸收峰.由圖可見，在微生物降解條件下，所有產(chǎn)物組分的峰強(qiáng)度都要高于非微生物降解，這說明微生物的作用會使PBS薄膜降解產(chǎn)生更多的水溶性產(chǎn)物.其實，微生物對PBS的降解除了生成水溶性的小分子產(chǎn)物外，也會生成非水溶性的大分子產(chǎn)物.但是只有當(dāng)分子量小于600的小分子產(chǎn)物才能夠被微生物吞噬吸收，分子量大的降解產(chǎn)物必須先降解成小分子產(chǎn)物，才能被微生物同化代謝.所以，本實驗只研究分子量在600以下的水溶性小分子產(chǎn)物.但是，由于水溶性產(chǎn)物多種多樣，因而缺少相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物便無法用UPLC來定性分析.為此，本實驗采用選擇離子檢測技術(shù)和正離子模式(+H+)來對m/z為0～600的這些水溶性降解產(chǎn)物進(jìn)行定性分析.圖5是各種水溶性降解產(chǎn)物的SIM質(zhì)譜圖，圖中 m/z為91，119，209，327，417，507和535的質(zhì)譜峰，依次歸屬于1，4丁二醇(B)、丁二酸(S)及其低聚物 BS，BSB，SBS，BSBS，BSBSB和SBSBS.很明顯，在微生物降解的條件下，各個離子碎片的峰強(qiáng)要高于非微生物降解，說明PBS薄膜在微生物作用下產(chǎn)生的水溶性降解產(chǎn)物要比沒有微生物時要多，盡管同時存在微生物對水溶性產(chǎn)物的同化作用.這進(jìn)一步說明微生物的存在可以加快PBS薄膜的降解速率.但是，隨著降解時間的延長，不同產(chǎn)物相應(yīng)的峰強(qiáng)卻呈現(xiàn)不規(guī)則的變化，這可能與產(chǎn)物生成和產(chǎn)物被微生物同化吸收的協(xié)同作用有關(guān).值得注意的是，微生物降解第2周時m/z=119(來自于丁二酸碎片)的峰強(qiáng)比非微生物降解高很多，這是導(dǎo)致圖2中介質(zhì)pH值在第2周迅速下降的原因.

圖4 PBS薄膜在非生物降解與生物降解兩周后生成水溶性中間產(chǎn)物的UPLC曲線圖Fig.4 UPLC patterns of water soluble products from PBS films after abiotic and biotic degradations for 2 weeks respectively

圖5 各種水溶性中間產(chǎn)物的SIM質(zhì)譜圖(m/z＜600，加H+)Fig.5 SIM mass spectra of water soluble products(m/z＜600，plus H+)

3 結(jié)論

本實驗研究了PBS薄膜在堆肥微生物作用下的生物降解行為，發(fā)現(xiàn)微生物的作用可以明顯加快PBS薄膜的降解，初期生成的水溶性酸性產(chǎn)物會使介質(zhì)酸化并對微生物的生長有一定的抑制作用，但隨著微生物對水溶性產(chǎn)物的不斷同化吸收，pH值逐漸回升，同時微生物的生長速率也不斷加快.這些水溶性降解產(chǎn)物主要是1，4－丁二醇、丁二酸單體和它們的低聚物.pH值和降解產(chǎn)物量的變化與產(chǎn)物生成和產(chǎn)物被微生物同化吸收的協(xié)同作用有關(guān).下一步工作主要是研究水溶性降解產(chǎn)物對生態(tài)系統(tǒng)(如植物生長)的影響.

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