不同種群比格犬單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞檢測(cè)

劉　宏， 王　冰， 黃　凱， 項(xiàng)路娟， 孫紅梅， 尹燕博，

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)， 青島 266109； 2. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 青島 266071；3. 青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司， 青島 266225）

不同種群比格犬單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞檢測(cè)

劉宏1， 王冰2， 黃凱3， 項(xiàng)路娟3， 孫紅梅3， 尹燕博1，3

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)， 青島 266109； 2. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 青島 266071；3. 青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司， 青島 266225）

目的 檢測(cè)3個(gè)種群健康成年比格犬外周血單核細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞免疫表型分布，建立相應(yīng)的正常參考范圍。方法 選擇三個(gè)種群健康成年比格犬： Charles River（大體型）、Covance（中體型）、自繁（小體型）各30只，血樣用三色特異性T淋巴細(xì)胞亞群及單色單核細(xì)胞熒光抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14、CD3、CD4、CD8標(biāo)記的樣品。結(jié)果 （1）外周血白細(xì)胞中單核細(xì)胞占比大體型比格犬明顯高于其他兩組（P＜0.05）； （2）CD4+淋巴細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞中占比大體型比格犬明顯高于其他兩組（P＜0.05）； CD8+淋巴細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞中的占比中體型比格犬明顯高于其他兩組（P＜0.05）； CD4+/CD8+小體型明顯高于其他兩組（P＜0.05）。結(jié)論 大體型比格犬自身免疫能力比較強(qiáng)，小體型比格犬具有數(shù)據(jù)比較穩(wěn)定、體型小、容易操作等優(yōu)點(diǎn)。建立了不同種群比格犬的淋巴細(xì)胞免疫表型及單核細(xì)胞的參考范圍。

比格犬； 單核細(xì)胞； T淋巴細(xì)胞； 流式細(xì)胞術(shù)； 免疫細(xì)胞

隨著艾滋病、自身免疫疾病及各種腫瘤的發(fā)病率上升，人們對(duì)這些疾病的發(fā)病機(jī)理、病程發(fā)展、治療效果的研究不斷深入，研究表明疾病的發(fā)生與機(jī)體免疫功能狀態(tài)密切相關(guān)［1，2］。

目前主要以小鼠模型來(lái)研究人類疾病，但小鼠生命周期短，不適合作為慢性疾病模型，利用犬作為動(dòng)物模型則克服了小鼠的上述缺點(diǎn)［3］。在國(guó)內(nèi)外的科研工作中，比格犬被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、病理學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、生物化學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域［4］。比格犬對(duì)于闡明人類相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制、篩選治療藥物并最終控制和治療人類疾病方面無(wú)疑是很好的動(dòng)物模型。

但在正常情況下，比格犬外周血淋巴細(xì)胞亞群及單核細(xì)胞的變化規(guī)律怎樣？特別是不同種群比格犬的相應(yīng)指標(biāo)是否一致，目前還沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本文目的是建立正常比格犬各個(gè)種群的外周血淋巴細(xì)胞免疫表型及單核細(xì)胞正常參考范圍，為動(dòng)物模型的建立奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12月齡以上Charles River（大體型）、Covance（中體型）、自繁（小體型）比格犬各30只， 雌雄各半，體質(zhì)量分別為17～23 kg、13～17 kg和9～12 kg，均由青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供［SCXK（魯）2012-0003］。

1.2儀器與試劑

水平離心機(jī)（TD5A， 湖南赫西儀器裝備有限公司）、渦旋振蕩器（SK-1， 上海梅香儀器有限公司）、流式細(xì)胞儀（Accuri C6，美國(guó)BD公司）； FITC標(biāo)記的CD14鼠抗犬單抗、APC標(biāo)記的CD3鼠抗犬單抗、PE標(biāo)記的CD4鼠抗犬單抗、FITC標(biāo)記的CD8鼠抗犬單抗、溶血素等均為美國(guó)BD公司的產(chǎn)品。

1.3方法

每只比格犬前肢內(nèi)側(cè)靜脈處采抗凝血2 mL，均在6 h內(nèi)處理樣品。 取100 μL抗凝全血加入每支試管中，注意不要碰到管壁。輕輕混勻，加入20 μL熒光抗體，室溫避光保存20 min。取出試管，每管加入10倍稀釋的溶血素2 mL， 渦旋混勻，避光10 min， 300×g離心5 min， 棄去上清液。每管加入2 mL PBS，渦旋混勻， 300×g離心5 min，棄去上清液。然后加入0.5 mL PBS混勻，4 ℃避光1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

將有效數(shù)據(jù)導(dǎo)入電腦， 采用SPSS 17.0 軟件包和Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間的比較用方差分析，兩兩比較用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1單核細(xì)胞

不同種群比格犬間單核細(xì)胞在白細(xì)胞中占比有顯著性差異（P＜0.05）（表1）。大體型比格犬單核細(xì)胞數(shù)量最多。

2.2T淋巴細(xì)胞

不同種群比格犬CD4+、CD8+細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞中占比有顯著性差異（P＜0.05），大體型與小體型及中體型與小體型比格犬間CD4+/CD8+有顯著性差異（P＜0.05）， 大體型與中體型間無(wú)顯著差異（P＞0.05）（表1）。

2.5非單核細(xì)胞系、非淋巴細(xì)胞系

不同種群比格犬非單核細(xì)胞系、非淋巴細(xì)胞系間無(wú)顯著差異（P＞0.05）（表1）。

表1　不同體型成年健康比格犬外周血CD14+單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等檢測(cè)結(jié)果 %

3　討論

健康比格犬外周血淋巴細(xì)胞亞群正常參考范圍建立，是監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)機(jī)體免疫功能的基礎(chǔ)，對(duì)疾病診斷分期、治療評(píng)價(jià)、預(yù)后判斷有重要指導(dǎo)意義。利用各種單克隆抗體與淋巴細(xì)胞表面的抗原結(jié)合， 再配合多色熒光染料， 通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析即可以把各種不同功能的淋巴亞群區(qū)分開(kāi)來(lái)，進(jìn)而得到各亞群的相對(duì)比例［5，6］。最常檢測(cè)的細(xì)胞包括T細(xì)胞（CD3）、單核細(xì)胞（CD14）、輔助性T細(xì)胞（CD3+、CD4+）和抑制性T細(xì)胞（CD3+、CD8+）等［7］。淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫細(xì)胞中構(gòu)成免疫系統(tǒng)和發(fā)揮適應(yīng)性免疫應(yīng)答，執(zhí)行免疫功能主要細(xì)胞群體［8］。對(duì)淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于腫瘤、艾滋病和自身免疫病的診斷、治療及預(yù)后［9］。此外，外周血單核細(xì)胞在機(jī)體免疫防御和固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。單核細(xì)胞除了抵御侵入體內(nèi)的病原體外，還能吞噬和清除機(jī)體代謝過(guò)程中不斷產(chǎn)生的衰老、死亡或惡變細(xì)胞以及頹變物質(zhì)等，從而維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定［11］。進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群及單核細(xì)胞的分析，對(duì)于了解機(jī)體免疫功能狀態(tài)有重要的臨床意義。單核細(xì)胞來(lái)源于骨髓細(xì)胞的多功能干細(xì)胞。單核細(xì)胞是機(jī)體重要的殺傷腫瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞，是樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的前體細(xì)胞。具有吞噬殺傷、呈遞抗原啟動(dòng)免疫應(yīng)答、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用［11］。單核細(xì)胞表達(dá)高水平的CD14分子，是較為特異的表面標(biāo)志［12］。目前有多種T細(xì)胞分類法，按T細(xì)胞表面是否存在CD4和CD8分子進(jìn)行分類，可將T細(xì)胞分為T(mén)4細(xì)胞和T8細(xì)胞。CD3是比較特異的T細(xì)胞抗體，表達(dá)于所有T細(xì)胞表面；CD4+T細(xì)胞具有輔助、誘導(dǎo)細(xì)胞及體液免疫的作用； CD8+細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)，也發(fā)揮抑制細(xì)胞及體液免疫的作用［13］。CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)能反映機(jī)體抗病毒能力。外周血中CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的比值可以評(píng)估淋巴細(xì)胞的功能，CD4總數(shù)升高提示淋巴細(xì)胞活性增加，因?yàn)檩o助性細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)， 而CD8總數(shù)升高則提示淋巴細(xì)胞活性降低［14］。

本研究選擇比格犬的三個(gè)種群分別為大體型、中體型和小體型。大、中、小體型比格犬的體質(zhì)量分別為： 17～23 kg、13～17 kg、9～12 kg。大體型、中體型比格犬有詳細(xì)的遺傳圖譜，小體型是在以上兩種體型的基礎(chǔ)上自繁自育形成體型較小的比格犬。單核細(xì)胞在機(jī)體免疫防御和固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用。不同體型間在外周血單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞在白細(xì)胞中占比的比較中，大體型單核細(xì)胞在白細(xì)胞中占比最高，小體型比格犬單核細(xì)胞在白細(xì)胞中占比僅次于大體型比格犬單核細(xì)胞在白細(xì)胞中的占比，中體型比格犬單核細(xì)胞在白細(xì)胞中的占比最低。

在日常飼養(yǎng)管理中， 大體型和小體型比格犬的成活率較高， 抵抗能力較強(qiáng)， 而中體型比格犬在相同的飼養(yǎng)條件下成活率最低， 抵抗力較弱， 此現(xiàn)象與研究結(jié)果相符合。淋巴細(xì)胞亞群分類占比中小體型成年健康比格犬?dāng)?shù)據(jù)比較穩(wěn)定更接近于人類的占比。

參考人類外周血細(xì)胞流式物理參數(shù)圖［15］并結(jié)合本研究得出非淋巴細(xì)胞系、非單核細(xì)胞系是粒細(xì)胞系并且比格犬的單核細(xì)胞要比淋巴細(xì)胞小。而夏兆飛等［16］在《犬貓血液學(xué)手冊(cè)》中提到犬單核細(xì)胞大小為15～20 μm，淋巴細(xì)胞為9～12 μm，即單核細(xì)胞要比淋巴細(xì)胞大，與本研究結(jié)果不一致。單核細(xì)胞比淋巴細(xì)胞小，是否為比格犬所特有，有待進(jìn)一步研究。張改平等［17］提到犬類T淋巴細(xì)胞在白細(xì)胞中占比為46%～72%； CD4+T細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中占比為27%～33%； CD8+T細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中占比為17%～18%； CD4+/CD8+比值為1.7，而本研究中CD4+T細(xì)胞在白細(xì)胞中占比及CD4+/CD8+比值均比上述中要高，具體原因有待進(jìn)一步研究。周祥吉等［18］提到24只南方雜種犬的數(shù)據(jù)與本研究小體型比格犬的數(shù)據(jù)相符。

總之，此次試驗(yàn)成功建立了健康比格犬不同種群外周血T淋巴細(xì)胞亞群及單核細(xì)胞的正常參考范圍，對(duì)相關(guān)應(yīng)用研究有一定參考意義。

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Q95-33

B

1674-5817（2015）06-0495-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.013

2015-05-16

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863）項(xiàng)目（2012AA101303）

劉宏（1988-）， 女， 碩士， 主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。 E-mail： liuhong_22188@163.com

尹燕博。E-mail： yanboyin2011@163.com；王冰。E-mail： wangbing@qdu.edu.cn