猴巨細胞病毒巢式PCR檢測方法的建立與初步應用

王莎莎， 賀爭鳴

（中國食品藥品檢定研究院重點實驗室， 北京 100050）

猴巨細胞病毒巢式PCR檢測方法的建立與初步應用

王莎莎， 賀爭鳴

（中國食品藥品檢定研究院重點實驗室， 北京 100050）

目的 建立猴巨細胞病毒（SCMV）特異的巢式PCR檢測方法并研究實驗猴群和猴源性生物制品中SCMV感染或污染情況。 方法 比對分析多株SCMV序列，設計SCMV特異引物，優(yōu)化巢式PCR實驗條件，建立的巢式PCR方法經(jīng)驗證后檢測實驗猴群和猴源性生物制品。 結(jié)果 經(jīng)特異度和靈敏度鑒定，在設計的4對引物中確定一對最佳引物，可以區(qū)分SCMV和人巨細胞病毒（HCMV）、小鼠巨細胞病毒（MCMV）、單純皰疹病毒（HSV）以及犬皰疹病毒（CHV），且可以檢測到的最小DNA量為18 pg/mL。PCR方法檢測實驗猴群和相關(guān)生物制品，發(fā)現(xiàn)SCMV在實驗猴群中廣泛存在，在相關(guān)生物制品中有感染的風險。結(jié)論 經(jīng)測序驗證，PCR檢測方法具有很好準確性，初步應用表明我國實驗猴群中SCMV高度流行，應加強實驗猴群及相關(guān)生物制品中SCMV的監(jiān)測，避免人類感染SCMV的潛在風險。

猴巨細胞病毒（SCMV）； 巢式 PCR； 實驗猴群； 猴相關(guān)生物制品

猴巨細胞病毒（SCMV）為線性雙鏈DNA病毒，為β亞型皰疹病毒，基因組全長為196～241 kbp，獼猴和食蟹猴SCMV的G+C含量為49%， 具有人巨細胞病毒（HCMV）的基因組結(jié)構(gòu)特征， 是HCMV致病性研究的良好模型［1］，也是猴獲得性免疫缺陷病毒（SIV）疫苗研究強有力的候選載體［2］。近年來SCMV還作為病毒疫苗載體構(gòu)建HIV疫苗，能夠給預接種疫苗動物一定程度的病毒清除［3］。PCR方法由于其安全、快速的特點在相關(guān)檢測中被廣泛應用。作者建立的巢式PCR方法能夠?qū)崿F(xiàn)快速批量檢測猴群中SCMV的感染情況，并且靈敏度和特異性比普通PCR高。該方法還可應用于猴源性生物制品SCMV污染的檢測，為保證生物制品應用的安全性提供依據(jù)，同時也為開展SCMV基因組的研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1樣品與毒株來源

方法的初步應用使用了猴全血樣品、猴口腔棉拭子樣品、猴組織樣品、猴源性細胞以及相關(guān)生物材料等。共檢測40份猴全血樣品（獼猴、食蟹猴各20份）； 猴口腔棉拭子40份（獼猴、食蟹猴各20份）； 3組猴組織樣品（獼猴2組， 食蟹猴1組）， 均采集于猴場。5株實驗室常用猴源傳代細胞包括猴腎細胞BSC-1， 非洲綠猴腎細胞Vero、Vero-E6， 羅猴胎腎細胞MA104， 獼猴腎細胞MK2， 均為本實驗室保存。3批猴源生物材料， 為本院疫苗三室贈送。

所使用的毒株包括HCMV（本院疫苗三室贈送），單純皰疹病毒（HSV）、小鼠巨細胞病毒（MCMV）、貓皰疹病毒（FHV）、犬皰疹病毒（CHV）以及猴腺病毒（SAdV），均為本實驗室保存。

1.2試劑及儀器

胎牛血清購自杭州四季青公司； PCR熱啟動反應體系、100 bp DNA Maker購自大連寶生物工程有限公司； PCR反應用引物均由北京擎科生物有限公司合成。 DNA快速提取試劑盒購自凱杰公司。

1.3實驗方法

1.3.1靶基因的選擇及引物設計巨細胞病毒屬于皰疹病毒β亞型，其保守基因包含皰疹病毒核心基因以及β亞型皰疹病毒特有基因，巨細胞病毒在宿主之間又高度特異，現(xiàn)選取宿主為獼猴、食蟹猴的巨細胞病毒基因組的皰疹病毒核心基因UL55、UL56和β亞型皰疹病毒特有基因UL33、UL84為靶基因進行比對選取保守序列，針對該區(qū)域用Primer Premier 5.0設計引物并合成，建立巢式PCR檢測方法。同時，與參照引物進行比較［4］。

4組引物（1，2，3，4）及參照引物（5）的序列見表1。

1.3.2基因組DNA提取病毒的細胞培養(yǎng)液經(jīng)反復凍融3次后4 ℃ 10 000 r/min離心30 min，收集上清。各種血液、組織、細胞以及生物制品樣品DNA提取按照基因組DNA提取試劑盒的說明書提取DNA， 200 μL樣品提取200 μL DNA， -20 ℃保存。

1.3.3巢式PCR反應經(jīng)過模板量，引物濃度，聚合酶量，循環(huán)數(shù)以及退火和延伸時間的探索，確定第一循環(huán)的體系和反應條件以及第二循環(huán)的體系和條件。

1.3.4巢式 PCR方法的特異度驗證

1.3.4.1瓊脂糖凝膠電泳鑒定取HCMV、MCMV、FHV、SAdV、HSV-1、HSV-2、CHV以及正常MRC-5細胞培養(yǎng)液。用前述SCMV病毒基因組提取方法提取DNA，以其為模板用設計的4組引物與參照引物在優(yōu)化后的條件下分別進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，分析所建立的巢式PCR方法的特異度，并與文獻報道的方法做比較。

1.3.4.2測序鑒定利用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物與pGEM-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，通過初步酶切鑒定，選擇陽性克隆送北京擎科公司測序。

1.3.5靈敏度測定將起始濃度為180 ng/mL的DNA樣本做倍比稀釋，分設10-1到10-7七個濃度梯度進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷所能擴增的最小DNA模板濃度。同時，用參照引物進行相同的操作，并將所建立的PCR方法與文獻報道的方法進行靈敏度比較。

1.3.6巢式PCR檢測方法的初步應用將建立的巢式 PCR方法應用于猴全血樣品、猴口腔棉拭子、猴組織樣品、猴源性傳代細胞樣品、以及猴源性生物制品樣品，檢測個樣品中SCMV的感染狀況。

2　結(jié)果

2.1巢式 PCR反應及條件優(yōu)化

巢式 PCR第1組引物，選取UL33作為靶基因， 外引物目的片段730 bp， 內(nèi)引物目的片段439 bp。第2組引物， 選擇UL84作為靶基因， 外引物目的片段463 bp， 內(nèi)引物目的片段310 bp。第3組引物，選擇UL55作為靶基因，外引物目的片段362 bp，內(nèi)引物目的片段197 bp。第4組引物， 選擇UL56作為靶基因，外引物目的片段1 206 bp，內(nèi)引物目的片段768 bp。經(jīng)過優(yōu)化各組引物均得到最適反應體系和條件。其中，優(yōu)化后引物2的內(nèi)外反應體系如表2。

外引物循環(huán)反應條件為： 95 ℃預變性4 min； 95 ℃30 s， 46 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，共20個循環(huán)； 72 ℃再延伸7 min。內(nèi)引物循環(huán)反應條件為： 95 ℃預變性4 min； 95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 共35個循環(huán)； 72 ℃再延伸7 min。

2.2巢式 PCR方法的特異度驗證

5組引物在以SCMV為模板時均有明顯的條帶出現(xiàn)，陰性對照MRC-5細胞均無目的條帶。引物1～4的特異度均很好，除了SCMV樣品中有條帶外，HCMV、MCMV、FHV、SAdV-1/SAdV-20、HSV-1/HSV-2、CHV中都未見有條帶出現(xiàn)。參照引物的特異度較差（圖2），在HCMV、FHV和CHV 的PCR反應中出現(xiàn)相同大小的目的條帶，在其他皰疹病毒中也出現(xiàn)了非特異性條帶。

表2　引物2優(yōu)化后的反應體系

圖1　引物1、引物2特異性驗證

2.3巢式 PCR產(chǎn)物核酸序列分析

將陽性擴增片斷進行克隆測序， 結(jié)果用BLAST 與NCBI中SCMV序列比對， 核苷酸符合率達99%， 證明是要擴增的SCMV目的片段， 說明該法特異性好。

2.4靈敏度鑒定

將提取核酸濃度為180 ng/mL的SCMV DNA樣本用TE緩沖液做10倍稀釋， 分設10-1到10-6六個稀釋度進行巢式PCR擴增。引物2在10-4稀釋度有較明顯條帶， 引物1、引物3和引物4在10-3稀釋度有明顯條帶。對于檢測樣品來說，注重于微量DNA的檢測，故引物2為最優(yōu)檢測巢式PCR引物，優(yōu)化的體系和反應條件為最優(yōu)方法。使用引物2對所建立的巢式PCR方法進行初步應用。

2.5檢測方法的初步應用

2.5.1猴全血樣品的檢測取獼猴、食蟹猴全血樣品各20份，進行巢式PCR方法檢測，結(jié)果顯示，獼猴全血樣品有5份擴增后出現(xiàn)310 bp大小的陽性條帶（圖3）， 將PCR產(chǎn)物送北京天一輝遠公司進行測序， 取5號樣品結(jié)果與NCBI進行比對， 與180.92株的同源性為98%，與Ottawa株的同源性為97%。食蟹猴全血樣品中未檢測出SCMV陽性（圖4）。

禮者，以財物為用，以貴賤為文，以多少為異，以隆殺為要。文理繁，情用省，是禮之隆也；文理省，情用繁，是禮之殺也；文理、情用相為內(nèi)外表里，并行而襍，是禮之中流也。故君子上致其隆，下盡其殺，而中處其中。

2.5.2猴口腔棉拭子的檢測獼猴、食蟹猴口腔棉拭子各20份提取DNA，進行巢式PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20只獼猴的口腔棉拭子全呈陽性結(jié)果， 18只食蟹猴口腔棉拭子陽性，2份陰性。

2.5.3猴組織樣品的檢測取2只獼猴（M1、M2），1只食蟹猴（S1）肝、脾、肺、腎、小腸組織各100 mg，研磨后提取組織細胞DNA，并對其進行SCMV 巢式 PCR檢測（圖5）。

2.5.4猴源性傳代細胞的檢測BSC-1、MA104、Vero-E6、MEK、Vero細胞均未檢出SCMV病毒核酸序列（圖6）。說明目前實驗室使用的猴源傳代細胞未受SCMV污染。

2.5.5猴源性生物制品的檢測對連續(xù)生產(chǎn)的3批猴源性生物制品進行檢測，顯示有SCMV核酸序列的存在（圖7）。將陽性樣品PCR產(chǎn)物進行克隆測序，測序結(jié)果與NCBI上公布的SCMV UL84基因進行同源性比對，同源性為98%。

3　討論

SCMV在猴群中多為隱性感染，國外報道SCMV在野外猴群的血清抗體陽性率達到90%以上，籠養(yǎng)的猴血清抗體陽性率則達到50%［5］。國內(nèi)對猴群中SCMV感染流行情況研究很少，猴源性生物制品中SCMV污染情況尚未見報道。有學者針對SCMV的皰疹病毒核心基因設計巢式引物，證明國內(nèi)籠養(yǎng)猴群中存在SCMV感染［4］。經(jīng)特異度驗證該方法特異度較差，不能區(qū)分SCMV與HCMV、FHV以及CHV。

圖3　獼猴全血樣品巢式 PCR結(jié)果

圖4　食蟹猴全血樣品巢式PCR結(jié)果

圖5　猴組織樣品巢式 PCR結(jié)果

圖6　傳代細胞DNA樣品巢式PCR結(jié)果

圖7　猴源性生物制品樣品巢式PCR結(jié)果

3.1方法建立

本實驗通過對引物濃度、Taq酶用量、退火溫度、模板量進行優(yōu)化并經(jīng)特異性和敏感性驗證，成功篩選出一對特異性好、靈敏度更高的引物，目的條帶大小為310 bp。特異性敏感性結(jié)果表明，本方法可以區(qū)分SCMV與HCMV、MCMV、HSV以及CHV，而且能夠在獼猴和食蟹猴群中檢出SCMV。敏感性驗證顯示其能檢測到的最小DNA模板濃度為18 pg/mL。

3.2猴全血、口腔棉拭子中SCMV的檢測

本實驗將猴全血樣品，口腔棉拭子進行比較，發(fā)現(xiàn)全血樣品中SCMV檢測陽性率較口腔棉拭子的陽性率低，說明口腔棉拭子可以作為較可靠的SCMV檢測樣品形式，這與Huff等［6］對猴的各種體液樣品進行的病毒SCMV核酸檢測，顯示口腔棉拭子的陽性率最高的結(jié)果一致。說明SCMV在感染個體中體液的分布有一定的偏好性。

SCMV的初次感染主要通過口腔黏膜接觸感染病毒的乳汁或唾液， 通過血液向全身擴散。感染早期， 即可在血漿中檢測出病毒DNA陽性。動物實驗性注射或者灌服獼猴巨細胞病毒7 d后血漿中檢測到病毒DNA達到峰值， 然后會慢慢減少， 但下降速度隨個體不同有差異［7］， 有的在注射病毒3周后血漿SCMV 核酸轉(zhuǎn)陰， 有的血漿中的病毒核酸則能一直持續(xù)到11周之后。初次感染猴血漿中的病毒清除后，血漿會保持長時間的SCMV核酸陰性狀態(tài)。接受病毒后2周， 猴組織各器官中可陸續(xù)檢測到SCMV， 通常被檢測到的組織包括脾、淋巴管、腎、骨髓、肝、腮腺、頜下腺［7，8］。

3.3猴組織樣品中SCMV的檢測

免疫功能健全猴個體中SCMV的自然感染病變主要見于唾液腺、淋巴結(jié)和腎［7］。在猴免疫缺陷病毒感染的個體中，常見SCMV機會感染，SCMV活化感染與腦膜炎、肺炎、淋巴結(jié)炎、脾炎、睪丸炎和神經(jīng)炎的發(fā)展有關(guān)，與大動脈以及消化道病變有關(guān)［9，10］。本文作者在組織細胞的檢測中，2只猴組織的脾和腎均發(fā)現(xiàn)SCMV DNA陽性，而肝、肺和小腸則未發(fā)現(xiàn)陽性，與上述論斷一致。獼猴M1的肝、脾、肺、腎出現(xiàn)SCMV陽性，而小腸未出現(xiàn)SCMV陰性，可能該獼猴免疫功能較低，使SCMV在體內(nèi)組織細胞出現(xiàn)大范圍感染。

3.4猴源性生物制品中SCMV的檢測

由于猴群中常存在SCMV隱性感染， 易導致用于口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗（OPV）生產(chǎn)用的原代猴腎細胞污染［11］。本實驗中實驗室猴源傳代細胞未發(fā)現(xiàn)SCMV污染，但猴源性生物制品的SCMV檢測顯示陽性，說明生產(chǎn)用猴腎細胞的SCMV污染嚴重。猴源性生物制品每批樣品中的陰、陽性不一致， 造成該結(jié)果的原因可能是多方面的， 如樣本本身的質(zhì)不均一性、污染來源以及核酸提取時質(zhì)不均一性等。如需確定猴源性生物制品中SCMV的污染情況，還需進一步擴大檢測樣本數(shù)量。雖然SCMV有嚴格的物種特異性， 自然情況下不存在交叉感染，但是不能排除人通過生物制品接觸病毒后無害。而2013年錄入NCBI Genbank的毒株strain Colburn記載其來源于患臨床腦病的男孩， 說明生物制品中SCMV的污染對人類健康存在潛在的威脅。

作者建立的SCMV核酸巢式 PCR檢測方法具有快速、簡便、準確等優(yōu)點，可實際應用于監(jiān)測猴群SCMV感染，也適用于猴源性生物制品SCMV污染的檢測，對于建立高質(zhì)量的實驗猴群和保證猴源性生物制品安全具有重大意義。

［1］Hansen SG， Strelow LI， Franchi DC， et al. Complete sequence and genomic analysis of rhesus cytomegalovirus［J］. J Virol，2003， 77（12）：6620-6636.

［2］Hansen SG， Piatak JrM， Ventura AB， et al. Immune clearance of highly pathogenic SIV infection［J］. Nature， 2013， 502 （7469）：100-104.

［3］Barouch DH， Picker LJ. Novel vaccine vectors for HIV-1［J］. Nat Rev Microbiol， 2014， 12（11）：765-771.

［4］黃璋瓊， 葉尤松， 江勤芳， 等. 獼猴巨細胞病毒（RhCMV）nested PCR檢測方法的建立與初步應用［J］. 四川動物，2007， 26（4）：78-81.

［5］Alcendor DJ， Zong J， Dolan A， et al. Patterns of divergence in the vCXCL and vGPCR gene clusters in primate cytomegalovirus genomes［J］. Virol， 2009， 395（1）：21-32.

［6］Huff JL， Eberle R. Differential detection of B virus and rhesus cytomegalovirus in rhesus macaques［J］. J Gene Virol， 2003，84（1）：83-92.

［7］Lockridge KM， Sequar G. Pathogenesis of experimental rhesus cytomegalovirus infection［J］. Virol， 1999， 73（11）：9576-9583.

［8］Sequar G， Britt WJ， Lakeman FD， et al. Experimental coinfection of rhesus macaques with rhesus cytomegalovirus and simian immunodeficiency virus： pathogenesis［J］. J Virol， 2002， 76（15）：7661-7671.

［9］Hutto EH， Anderson DC， Mansfield KG. Cytomegalovirusassociated discrete gastrointestinal masses in macaques infected with the simian immunodeficiency virus［J］. Vet Pathol， 2004 ，41（6）：691-695.

［10］ Macri SC， Knight HL， Miller AD. Mesenchymoproliferative enteropathy associated with dual simian polyomavirus and rhesus cytomegalovirus infection in a simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaque （Macaca mulatta）［J］. Vet Pathol， 2013， 50（4）：715-721.

［11］ Sierra-Honigmann AM， Krause PR. Live oral poliovirus vaccines and simian cytomegalovirus［J］. Biologicals， 2002， 30 （3）：167-174.

Establishment of Nested PCR Detection Method for Simian Cytomegalovirus and Preliminary Application

WANG Sha-sha， HE Zheng-ming
（National Institute for Food and Drug Control， Beijing 100050， China）

Objective To establish simian cytomegalovirus （SCMV） specific nested PCR detection method， and to investigate SCMV infectious status in monkeys and related biological products. Methods Designed primers based on SCMV sequences and different monkey species and biological products were used to optimize the experiment. Results The established nested PCR detection method for SCMV can distinct SCMV from HCMV， MCMV， HSV and CHV， the test sensitivity is to viral DNA 18 pg/mL. By this nested PCR method， SCMV positive results were detected in monkeys and biological products， which suggested the high infection rate existed in monkeys and its biological products. Conclusions Nested PCR detection method has a good accuracy and sensitivity. It is found that high prevalence in Chinese primate colony. It is necessary to enhance detection for SCMV in monkeys and relevant biological products and to avoid potential risk of infecting in human.

Simian cytomegalovirus （SCMV）； Nested PCR； Detection and application

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0467-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.008

2015-04-30

國家科技支撐計劃， 實驗動物質(zhì)量檢測關(guān)鍵技術(shù)研究（2013BAK11B01）

王莎莎（1989-）， 女， 碩士， 研究方向： 實驗動物病毒學。E-mail： wangsha0316@126.com

賀爭鳴（1957-）， 男， 博士， 研究員， 研究方向： 微生物學。E-mail： hezm@nicpbp.org.cn