孕中期限飼法建立胎兒宮內生長受限小鼠模型

劉學旭， 楊　文， 丁運萍

（四川大學1. 實驗動物中心； 2.口腔疾病研究國家重點實驗室， 成都610041）

孕中期限飼法建立胎兒宮內生長受限小鼠模型

劉學旭1， 楊文1， 丁運萍2

（四川大學1. 實驗動物中心； 2.口腔疾病研究國家重點實驗室， 成都610041）

目的 研究孕中期限飼法建立胎兒宮內生長受限（FGR）模型的可行性。方法 將90只（雌性60只，雄性30只）3月齡KM小鼠隨機分為對照組，模型I、II、III和IV組，每組雌12只、雄6只，雌雄2∶1合籠。所有孕鼠在妊娠10 d前自由采食， 從妊娠10 d， 模型I、II、III和IV組分別給予對照組相對應孕期80%、70%、60%和50%的日糧， 對照組自由采食。結果 對照組、模型I、II、III和IV組： 妊娠15 d孕鼠體質量分別平均增長26.03 g、21.31 g、19.09 g、16.96 g 和13.19 g， 模型組孕鼠體質量增長均低于對照組（模型II組P＜0.05、模型III組和IV組P＜0.01）； 平均窩重分別是21.12 g、19.20 g、18.95 g、15.59 g和12.99 g， 模型組胎仔平均窩重低于對照組（模型III組P＜0.05、IV組P＜0.01）； 模型I、II、III和IV組FGR發(fā)生率分別為42.97%、66.17%、66.38% 和54.26%， 與對照組（4.76%）比較顯著增高（P＜0.01）； 模型組新生胎兒臟器平均質量除腦組織、模型IV組的心臟、肝臟外均明顯低于對照組（P＜0.05）。結論 孕中期限飼法建立胎兒宮內生長受限動物模型是可行的，其中給予正常孕鼠同期60%～70%的日糧建立FGR模型效果較佳。

胎兒宮內生長受限（FGR）； 限飼法； 動物模型； KM小鼠

胎兒宮內生長受限（fetal growth restriction， FGR）是常見的一種危害胎兒生存質量的妊娠并發(fā)癥， 其發(fā)病率為3%～10%，我國發(fā)病率平均為6%［1］。FGR的原因較復雜，胎兒染色體異常、妊娠婦女宮內感染、妊娠婦女營養(yǎng)不良和不良生活習慣等都有可能引起FGR［2］。并且對新生嬰兒及其以后的生長發(fā)育及免疫功能都均有影響［3］。有研究顯示，在FGR兒出生后，其激素水平與對照組有顯著差異［4］，然而FGR病因及發(fā)病機制至今尚未完全明了，病因多樣［5］，因此建立一種良好的FGR動物模型，對FGR的病因、病理、治療學方面的研究是非常必要的。常見的造模方法有： 外科手術法［6，7］、更生霉素注射法［8］、被動吸煙法［9］、母體營養(yǎng)不良法［10］、饑餓法［12，13］等。以上方法各有利弊，有的胎仔死亡率高，有的實驗操作繁瑣，有的毒性大，有的FGR發(fā)生率低。

總食物的限制是FGR造模的手段之一，但已有報道［8］顯示，其日糧控制的時間和量控制比較困難。且不同的低營養(yǎng)水平、不同的限飼時間對FGR的發(fā)生也有很大影響［13］。本文以正常孕鼠采食量為標準，模型組在孕中期按比例限制孕鼠的采食量，觀察胎兒的發(fā)育情況， 證明此方法建立FGR模型是可行的， 方法簡單、易于操作， 現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物

SPF級3月齡KM小鼠90只，雌性60只，雄性30只，由四川大學實驗動物中心提供［SCXK（川）2013-026］。飼養(yǎng)在四川大學實驗動物中心層流架中，飼養(yǎng)室溫度20±1℃，相對濕度50%±25% ［SYXK（川）2013-0185］。

1.2動物日糧

小鼠繁殖顆粒飼料由四川大學實驗動物中心提供［SCXK（川）2013-01］，高溫高壓消毒后使用。

1.3實驗方法

1.3.1妊娠及動物分組將3月齡KM小鼠稱重，隨機分為對照組，模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組，每組雌性12只、雄性6只，按雌雄2∶1合籠（對照組先于模型組合籠，待對照組動物全部檢出陰栓后將模型組動物合籠），次日檢查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓視為妊娠，單籠飼養(yǎng)并記為妊娠1 d。對照組在孕期全程自由采食，模型組妊娠10 d開始限飼，限飼標準分別為對照組同期日采食量的80%、70%、60%和50%， 至分娩。每日測定孕鼠體質量和采食量， 自由飲水。稱取胎兒的體質量， 測定胎兒的體長、尾長和臟器質量。

1.3.2模型判定采用標準差法，以對照組平均出生體質量減去該組標準差的2倍為標準［13］，模型組中出生體質量小于或等于此標準者為FGR，大于此標準者為正常。

1.4統(tǒng)計學處理

2　結果

2.1采食量

妊娠10～19 d，對照組采食量分別為6.27 g、6.87 g、6.88 g、7.44 g、7.53 g、8.23 g、8.59 g、9.50 g、10.13 g和7.51 g， 模型組采食相應比例飼料。

2.2母鼠體質量

妊娠0～10 d，各組孕鼠體質量增長緩慢，增長速率一致。妊娠10 d后， 各組小鼠體質量均呈現(xiàn)快速增長態(tài)勢， 但增長速率出現(xiàn)差異， 妊娠15 d模型Ⅰ、Ⅱ組、Ⅲ和Ⅳ組平均體質量分別增長21.31 g、19.09 g、16.96 g和13.19 g， 均低于對照組26.03 g，其中模型Ⅲ、Ⅳ組P＜0.01， 模型Ⅱ組P＜0.05， 模型Ⅰ組無顯著性差異（P＞0.05），產(chǎn)前（妊娠18 d）模型Ⅰ組、模型Ⅱ組、模型Ⅲ組和模型Ⅳ組平均體質量分別增長31.11 g、26.00 g、23.11 g、17.80 g，均低于對照組37.52 g（模型Ⅰ組P＜0.05，模型Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組P＜0.01）（圖1）。

2.3母鼠產(chǎn)仔數(shù)和窩重

妊娠母鼠平均窩重隨限飼水平升高逐漸降低，與對照組比較，模型Ⅰ組、Ⅱ組P＞0.05， 模型Ⅲ組胎窩重明顯低于對照組P＜0.05， 模型Ⅳ組胎窩重最低，與對照組比較P＜0.01。與模型Ⅰ組比較，模型Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組窩重均低于模型Ⅰ組，但模型Ⅱ組和模型Ⅲ組差異不顯著（P＞0.05），模型Ⅳ組窩重顯著低于模型Ⅰ組（P＜0.01）。與模型Ⅱ組比較，模型Ⅲ組（P＞0.05）和模型Ⅳ組（P＜0.01）窩重低于模型Ⅰ組（表1）。

圖1　不同限飼水平妊娠鼠體質量變化

表1　母鼠產(chǎn)仔數(shù)和窩重

2.4胎兒體尺

模型組的體長和尾長，除模型Ⅰ組體長外， 均明顯低于對照組（P＜0.01）。模型組之間體長和尾長無明顯差異（P＞0.05）（表2）。

2.5胎兒臟器質量

限飼組胎兒臟器質量均低于正常采食量組， 除模型組的腦、模型Ⅳ組的心臟、肝臟重量與對照組比較無顯著性差異外，其余各組的臟器重量均明顯低于正常對照組胎兒臟器的重量（P＜0.05）（表3）。

表2　各組胎仔體尺 cm

2.6FGR發(fā)生率

據(jù)FGR判定標準， 低于對照組2個標準差（1.57 g）以下者為FGR胎鼠。模型Ⅱ、Ⅲ組FGR發(fā)生率顯著高于模型Ⅰ組（P＜0.01）； 模型Ⅳ組高于模型Ⅰ組，模型Ⅱ、Ⅲ組略高于模型Ⅳ組， 但差異均無顯著性（P＞0.05）（表4）。

3　討論

FGR也稱為胎兒宮內生長遲緩（intra-uterine growth retardation，IUGR）。建立FGR動物模型對于深入研究FGR發(fā)生的機制，疾病發(fā)生過程及病理改變具有重要作用［13］。目前常見的造模方法中，子宮動脈結扎法雖然使用頻率較高，但手術對對照組母體和胎兒的影響大，對照組的出生體質量相對較輕； 更生霉素是一種細胞毒性藥物， 其毒副作用影響該種模型的廣泛應用［14］； 吸煙法操作較繁瑣，吸煙的量和時問不好掌握，而且流產(chǎn)率、畸形率和死胎率較高，香煙中的尼古丁等有害成分對FGR的發(fā)生是否有影響還不十分明確［8］； 母體營養(yǎng)不良法對飼料合成技術要求高。本研究采用孕中期限飼法復制FGR動物模型與臨床上營養(yǎng)不良型FGR相似，并對母體營養(yǎng)不良法建立FGR模型作了改進。

表3　各組胎兒臟器重量 mg

表4　小鼠FGR發(fā)生情況

3.1模型特點

本研究選用小鼠孕中期限飼法建立FGR模型，與傳統(tǒng)的建模方法比較有如下特點： 1）無需手術，避免外科手術對對照組胎兒的影響。2）不使用藥物， 避免藥物的毒副作用對模型的影響。3）克服了被動吸煙法產(chǎn)生多種毒性物質對模型的影響。4）對母體營養(yǎng)不良法特別是總食物的限制建立模型，提出了明確的限飼時間、限飼方法和限制量。限飼時間為小鼠妊娠中期，懷孕10 d開始到分娩； 限飼方法為每日以對照組正常采食量為標準，按比例提供模型組相應孕期的采食量； 限制量為正常孕鼠同期采食量的80%、70%、60%和50%。5）在FGR病因中，患兒按細胞水平可分為發(fā)育不全型和營養(yǎng)不良型。營養(yǎng)不良型多見于胎盤功能不全、多胎、過期妊娠、妊娠高血壓綜合征等［15］，本方法建立FGR模型符合臨床上營養(yǎng)不良型FGR的特點，可用于研究營養(yǎng)不良型病因引起的FGR發(fā)病機制，以及母體新陳代謝改變引起FGR的分子機制及FGR與新生兒肥胖癥的關系等。

3.2模型方法的改進

孕中期限飼法建立FGR模型，屬于母體營養(yǎng)不良法建立FGR模型范疇，傳統(tǒng)的母體營養(yǎng)不良法， 不管是采用低蛋白飲食法，還是采用低能量飲食都需要配制2種以上飼料［16，17］，對飼料合成技術要求高，本方法對照組和各模型組使用同一種飼料，不需要另外配制模型組飼料，簡便、易行。

本研究采用在妊娠中期限制模型組小鼠的采食量，分別給予對照組正常采食量的80%、70%、60%和50%的日糧一直維持到胎兒出生， 并獲得發(fā)生率為42.97%、66.17%、66.38%和54.26%的FGR模型，解決了傳統(tǒng)母體營養(yǎng)不良法在日糧控制時間和控制量上的困難，且模型發(fā)生率較高。

3.3模型制備注意事項

獲得模型組孕期飼料供給量，是本實驗成敗的關鍵。因此只要對照組動物的孕期提前模型組動物1d，就能提前獲得對照組孕期動物正常采食量，從而獲得模型組動物飼料供給量。研究表明：限飼水平下降到母鼠正常采食量的50%時， FGR發(fā)生率反而會降低，同時伴隨窩產(chǎn)仔數(shù)的降低，可能是母體以胎仔數(shù)減少來對抗營養(yǎng)供給不足的結果，提示采用此方法建模時，限飼量不宜太低。

綜上所述，從小鼠妊娠中期限制采食量建立FGR模型是可行的，給予同期正常孕鼠60%～70%的日糧至分娩，可獲得66.17%～66.38%的FGR模型，造模方法操作簡單易行。

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Mouse Model for Fetal Growth Restriction in Pregnant Metaphase by Limited Feeding

LIU Xue-xu1， YANG Wen1， DING Yun-ping2
（1. Laboratory Animal Center of Sichuan University， Chengdu 610041， China；2. State Key Laboratory of Oral Diseases， Chengdu 610041， China）

Objective To established the fetal growth restriction （FGR） mouse model in pregnant metaphase by limited feeding. Methods Ninety KM mice （60 females and 30 males， 3 months old） were divided randomly into 5 groups consisting of the control， model I， II， III and IV group. Mice in each group （12 female and 6 male） were placed in the mating cage with one male and 2 females. All the pregnant mice were fed ad libitum before day 10 of pregnancy. After that， model I， II， III and IV group were fed with 80%， 70%， 60% and 50% of daily ration respectively according to control group feeding ad libitum. Results The average weight increment in 15-day pregnancy mice was 26.03 g， 21.31 g，19.09 g， 16.96 g and 13.19 g in control， model I， II， III and IV group， respectively. The weight increment in model group was significantly higher than that of control group （model II group P＜0.05， III group and IV group P＜0.01）； The average litter weight was 21.12 g， 19.20 g， 18.95 g， 15.59 g and 12.99 g in control， model I， II， III and IV group， respectively. The litter weight in model group was significantly lower than that of control group （model III group P＜0.05， IV group P＜0.01）； The incidence of FGR in model I， II， III， IV and control group was 42.97%、66.17%、66.38%、54.26% and 4.76%，respectively. The incidence in all model groups was significantly higher than that in control group （P＜0.01）. Except for the brain tissue in all model groups as well as the heart and liver tissue in model IV group， all the fetal organ weight in model group was significantly lower than that in control group （P＜0.05）. Conclusion It is feasible to establish the FGR model in pregnant metaphase by limited feeding. The best FGR model may be obtained by feeding the pregnant mice at 70% to 60% of daily ration of normal pregnant mice.

Fetal growth restriction （FGR）； Limited feeding； Animal model； KM mice

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0453-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.005

2015-04-22

劉學旭（1964-）， 男， 高級實驗師， 研究方向： 動物實驗方法。E-mail： liu_xx@126.com

丁運萍（1965-）， 女， 高級實驗師， 研究方向： 動物實驗方法。E-mail： 1589492339@qq.com