水稻窄葉突變體zy17的遺傳分析和候選基因鑒定

李雪倩，徐冉，段朋根，伍應(yīng)保，羅越華，李云海

1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228；

2.中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，植物細(xì)胞與染色體工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

水稻窄葉突變體zy17的遺傳分析和候選基因鑒定

李雪倩1,2，徐冉2，段朋根2，伍應(yīng)保2，羅越華1，李云海2

1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570228；

2.中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，植物細(xì)胞與染色體工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

器官大小調(diào)控是一個(gè)基本的發(fā)育生物學(xué)過(guò)程，受細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)展的影響。然而，植物器官大小調(diào)控的遺傳和分子機(jī)理仍不清楚。為了進(jìn)一步了解器官大小調(diào)控的分子機(jī)制，文章分離了一系列水稻葉子寬窄改變的突變體。其中，窄葉突變體zy17葉變窄，同時(shí)伴有植株矮化、穗子變小、枝梗數(shù)和穗粒數(shù)降低的表型。遺傳分析表明該窄葉性狀受1個(gè)隱性基因控制；細(xì)胞學(xué)分析表明該突變體葉子的細(xì)胞數(shù)目和維管束數(shù)目顯著降低，表明ZY17影響了細(xì)胞分裂。基因組重測(cè)序進(jìn)一步篩選出ZY17的3個(gè)候選基因：Os02g22390基因突變發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)，編碼蛋白為逆轉(zhuǎn)座蛋白；Os02g28280和Os02g29530基因突變都發(fā)生在外顯子區(qū)，其中Os02g28280編碼一個(gè)功能未知蛋白，該基因突變后，發(fā)生堿基置換，產(chǎn)生非同義突變；Os02g29530編碼一個(gè)含糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)的PFAM結(jié)構(gòu)域的蛋白，該基因突變后，出現(xiàn)兩個(gè)堿基的缺失，從而導(dǎo)致其蛋白翻譯提前終止。對(duì)候選基因的深入研究，將揭示水稻葉子大小調(diào)控的機(jī)制。

水稻(Oryza sativa L.)；窄葉突變體；細(xì)胞分裂；遺傳基礎(chǔ)

水稻(Oryza sativa L.)是人類主要的糧食作物。近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，通過(guò)培育高產(chǎn)品種，水稻產(chǎn)量有了成倍的增長(zhǎng)。然而，目前世界人口已超過(guò)70億，據(jù)估計(jì)2050年將增長(zhǎng)至90億，這就意味著在農(nóng)業(yè)用地不能同步增長(zhǎng)的情況下，水稻產(chǎn)量需要提高60%~70%[1,2]。葉片是水稻株型的重要組成部分，也是光合作用最主要的器官[3]。隨著水稻突變體庫(kù)的逐漸完善，相關(guān)資源愈加豐富，葉形相關(guān)基因的克隆及其功能研究逐步深入，這對(duì)水稻理想株型的塑造和高產(chǎn)品種培育具有重要意義[4]。

葉片形態(tài)建成是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，與很多基因相關(guān)。葉寬是水稻葉片形態(tài)性狀的重要組成部分，是多基因控制的數(shù)量性狀，且易受環(huán)境影響，其形態(tài)改良總體進(jìn)展不大[5]。目前，在水稻12條染色體上已檢測(cè)到100多個(gè)葉寬相關(guān)QTL位點(diǎn)[6]，且有一些窄葉相關(guān)的QTL被克隆并鑒定。因此，鑒定新的窄葉基因?qū)馕鋈~片發(fā)育、培育高產(chǎn)品種具有重要意義。隨著基因組學(xué)研究的深入，越來(lái)越多的水稻窄葉基因被克隆。位于3號(hào)染色體的COW1/NAL7基因和4號(hào)染色體的NAL1基因都已被克隆并進(jìn)行了功能鑒定，其編碼的蛋白都與生長(zhǎng)素合成、降解及其極性運(yùn)輸密切相關(guān)[7~9]。其中，NAL1基因編碼一生物學(xué)功能未知的特定蛋白，在微管組織中豐富表達(dá)，影響微管形成。研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，nal1維管束數(shù)目明顯減少，生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸出現(xiàn)障礙，從而產(chǎn)生窄葉表型[7]。qLSCHL4和qTSN4是窄葉相關(guān)的主要QTL位點(diǎn)，其中LSCHL4(qLSCHL4)被克隆并鑒定為NAL1的等位基因，其近等基因系的平均產(chǎn)量較野生型增加18.70%[10]。SPIKE(qTSN4)同樣被鑒定為NAL1的等位基因，在旱季和濕季其近等基因系的平均產(chǎn)量分別較野生型增加28%和24%[11]。另外1個(gè)與YUCCA基因序列同源的水稻窄葉基因NAL7編碼含黃素單氧化酶，可能在生長(zhǎng)素的生物合成過(guò)程中發(fā)揮作用[8,9]。同樣位于3號(hào)染色體的NAL9基因，研究預(yù)測(cè)其突變體葉片變窄可能也與生長(zhǎng)素相關(guān)[12]。NAL2和NAL3編碼的蛋白(OsWOX3A)與擬南芥中WUSCHEL蛋白具有同源性，通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素合成與運(yùn)輸影響葉片發(fā)育[13]。位于12號(hào)染色體的窄葉矮桿基因NRL1/ND1/DNL1編碼一種可以影響植物細(xì)胞壁形成的類纖維素合成酶D4，在種子、根尖以及莖頂端分生組織等分裂能力較強(qiáng)的部位集中表達(dá)，通過(guò)影響泡狀細(xì)胞發(fā)育和減少細(xì)胞數(shù)目導(dǎo)致水稻葉片出現(xiàn)變卷變窄的表型[14~17]。位于4號(hào)染色體的矮桿窄葉基因TDD1編碼鄰氨基苯甲酸合成酶b亞基的同源蛋白，其中鄰氨基苯甲酸合成酶b亞基作用于色氨酸依賴的生長(zhǎng)素合成酶上游[18]。此外，SLL1編碼KANADI家族的MYB轉(zhuǎn)綠因子，從而參與葉片發(fā)育[19,20]；HDA704編碼組蛋白去乙?；福浔磉_(dá)下調(diào)也將導(dǎo)致水稻葉片出現(xiàn)變窄、變卷的表型[21]。

本研究在寬葉粳(KYJ)背景下，通過(guò)甲基磺酸乙酯(Ethyl-methanesulphonate,EMS)誘變獲得一系列窄葉突變體(zhaiye,zy)。其中zy17突變體表現(xiàn)出較窄的葉和較小的穗子。細(xì)胞學(xué)分析表明ZY17影響了細(xì)胞數(shù)目，從而影響葉子寬度。通過(guò)構(gòu)建F2群體，結(jié)合重測(cè)序技術(shù)，鑒定了ZY17候選基因，為更好了解水稻葉片葉形發(fā)育的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

以寬葉材料KYJ為原始材料，經(jīng)EMS誘變獲得窄葉突變體zy17，本實(shí)驗(yàn)所用水稻材料都種植于北京昌平農(nóng)場(chǎng)和浙江省富陽(yáng)市中國(guó)水稻研究所實(shí)驗(yàn)基地。

1.2 方法

1.2.1 表型與農(nóng)藝性狀調(diào)查

在穗子完全抽出后選取野生型KYJ和突變體zy17各15株，選取每株主穗，對(duì)其劍葉葉寬進(jìn)行測(cè)量，葉片寬度為該葉長(zhǎng)1/2處。

在成熟期選野生型和突變體各15株測(cè)量株高，統(tǒng)計(jì)其主穗一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)和穗粒數(shù)，同時(shí)選取成熟期飽滿種子各60粒，使用萬(wàn)深SC-G型自動(dòng)考種分析及千粒重系統(tǒng)測(cè)量其長(zhǎng)和寬。上述數(shù)據(jù)都進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)。

1.2.2 掃描電鏡觀察

在穗子完全抽出后分別取野生型KYJ和突變體的單株主穗劍葉各10片，用刀片在其1/2處兩次橫切，獲得長(zhǎng)約2~3 mm的局部葉片樣本，將樣本置于體積比為甲醛:冰醋酸:乙醇:DEPC-H2O=1:0.5: 4.75:3.75的FAA固定液中，抽真空，固定48 h以上，室溫保存。將固定的材料依次轉(zhuǎn)入50%(40 min)、70%(40 min)、80%(40 min)、95%(60 min)的乙醇梯度逐級(jí)脫水，再經(jīng)過(guò)100%(60 min)的乙醇兩次、50%乙醇+50%乙酸異戊酯(60 min以上)及100%(60 min)的乙酸異戊酯2次浸泡。將材料置于液態(tài)二氧化碳中進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，之后進(jìn)行粘臺(tái)、鍍膜，在掃描電鏡下觀察并選取合適的角度和放大倍數(shù)進(jìn)行拍照，最后統(tǒng)計(jì)其葉片維管數(shù)目及下表皮細(xì)胞數(shù)目，并進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)分析。

1.2.3 遺傳分析

突變體zy17與野生型KYJ雜交獲得F1群體，考察F1植株葉片形態(tài)。F1自交構(gòu)建F2分離群體，在穗子完全抽出后考察F2分離群體單株葉片形態(tài)，統(tǒng)計(jì)野生型KYJ寬葉單株和突變體zy17窄葉單株并進(jìn)行卡方適合性測(cè)驗(yàn)。

1.2.4 重測(cè)序篩選候選基因

對(duì)窄葉突變體zy17與野生型KYJ雜交的F2分離群體，在穗子完全抽出后選取50株zy17表型的植株，分別進(jìn)行DNA提取，然后將50個(gè)樣品DNA等量混合，進(jìn)行全基因組重測(cè)序。具體如下：使用新型植物基因組DNA提取試劑盒(康為世紀(jì))提取其基因組DNA，制備混池，經(jīng)scandrop250超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)DNA濃度，OD260/280都在1.8~2.0之間。利用MutMap[22~24]技術(shù)篩選目的基因。

1.2.5 候選基因鑒定

利用在線分析(網(wǎng)址http://helix.wustl.edu/dcaps/ dcaps.html)，導(dǎo)入野生型與突變體序列，通過(guò)網(wǎng)站在線分析，找到合適的限制性內(nèi)切酶，然后設(shè)計(jì)上下游引物，PCR結(jié)合酶切即可成為合適的dCAPs標(biāo)記(表1)。其在兩親本間具有多態(tài)性，可用于突變位點(diǎn)驗(yàn)證以及目的基因的連鎖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體zy17的形態(tài)學(xué)分析

與野生型KYJ相比，突變體植株zy17的窄葉表型在苗期不是很明顯，但在抽穗后表現(xiàn)出明顯的窄葉(圖1D)。在性狀明顯的抽穗期統(tǒng)計(jì)葉寬，突變體劍葉平均葉寬1.49 cm，野生型平均葉寬1.76 cm，突變體平均葉寬極顯著低于野生型，是野生型的84.7%(圖1F)。

此外，突變體與野生型在其他農(nóng)藝性狀上也有很大差異。株高明顯矮化(圖1A)，突變體zy17平均株高75.10 cm，野生型KYJ平均株高95.88 cm，突變體株高極顯著低于野生型，僅為野生型的78.3%(圖1E)。突變體zy17的枝梗數(shù)和穗粒數(shù)顯著減少(圖1：B、C)，一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)和穗粒數(shù)分別為7、15、60，而野生型KYJ一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)和穗粒數(shù)分別為13、47、175，突變體zy17的一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)和穗粒數(shù)分別只有野生型KYJ的53.8%、31.9%和34.3%(圖1I)。然而，突變體zy17種子平均長(zhǎng)與寬分別為7.06 mm和3.09 mm，野生型KYJ種子平均長(zhǎng)與寬分別為7.12 mm和3.34 mm，與野生型KYJ相比，突變體zy17的種子略顯短、窄，但差異不顯著(圖1：G、H)。

2.2 zy17降低了葉細(xì)胞數(shù)目

通過(guò)電鏡掃描分析，突變體zy17葉片下表皮細(xì)胞大小與野生型KYJ葉片下表皮細(xì)胞大小沒(méi)有顯著性差異(圖2C)，但是其平均細(xì)胞數(shù)及維管束數(shù)與野生型相比有極顯著性差異：突變體zy17葉片下表皮平均細(xì)胞數(shù)和維管束數(shù)分別為1246個(gè)和57個(gè)，而野生型KYJ葉片下表皮平均細(xì)胞數(shù)和維管束數(shù)分別為1563個(gè)和68個(gè)，zy17葉片下表皮平均細(xì)胞數(shù)和維管束數(shù)僅為野生型KYJ的80%和84%，單個(gè)細(xì)胞的寬度在突變體和野生型間沒(méi)有顯著差異(圖2：A、B)。由此可見，細(xì)胞數(shù)和維管束數(shù)的減少與葉片變窄有直接關(guān)系，然而究竟是由于細(xì)胞數(shù)與維管束數(shù)減少導(dǎo)致zy17葉片變窄，還是由于葉片某個(gè)發(fā)育過(guò)程受阻導(dǎo)致葉片變窄進(jìn)而引起細(xì)胞數(shù)和維管束數(shù)減少有待進(jìn)一步研究。

表1 用于dCAPS分析的引物及酶

圖1 突變體表型及相關(guān)性狀分析A：野生型(KYJ)與突變體zy17植株形態(tài)(標(biāo)尺：10 cm)。B：野生型(KYJ)與突變體zy17植株主穗(標(biāo)尺：2 cm)。C：KYJ與zy17穗分枝比較(標(biāo)尺：2 cm)。D：KYJ與zy17劍葉比較(標(biāo)尺：1 cm)。E：株高統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。F：劍葉寬統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。G、H：粒長(zhǎng)、粒寬統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。I：zy17一次、二次枝梗數(shù)以及穗粒數(shù)占KYJ的百分比(PB：一次分枝；SB：二次分枝；GN：穗粒數(shù))。

2.3 突變體zy17的遺傳分析

突變體zy17與野生型KYJ雜交獲得F1群體，考察F1植株葉片形態(tài)，均表現(xiàn)為野生型。F1自交構(gòu)建F2分離群體，在穗子完全抽出后考察F2分離群體單株葉片形態(tài)，統(tǒng)計(jì)野生型KYJ寬葉單株和突變體zy17窄葉單株。F2群體共計(jì)180株，其中野生型KYJ寬葉141株，突變體zy17窄葉表型39株?？ǚ竭m合性測(cè)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)2的分離符合野生型KYJ寬葉：突變體zy17窄葉=3:1的分離規(guī)律(χ2=0.896<χ20.05,1= 3.84)，表明該窄葉性狀受一對(duì)隱性性狀基因控制。

2.4 候選基因的篩選與驗(yàn)證

在重測(cè)序數(shù)據(jù)中，去除測(cè)序覆蓋度低于5的SNP，共發(fā)現(xiàn)2096個(gè)SNP和108個(gè)InDel。其中連鎖指數(shù)大于80%的SNP有219個(gè)，InDel有6個(gè)。隨后對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，突變發(fā)生在外顯子或剪切位點(diǎn)的SNP有50個(gè)，InDel有1個(gè)，去除同義突變后剩余36個(gè)SNP，1個(gè)InDel，它們絕大部分位于轉(zhuǎn)座子或反轉(zhuǎn)座子區(qū)域。為了找到真正導(dǎo)致表型的突變，本文針對(duì)最有可能的SNP和InDel設(shè)計(jì)了CAPS或dCAPS引物，并利用分離群體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2號(hào)染色體上的1個(gè)SNP和1個(gè)InDel與表型共分離。因此，認(rèn)為突變發(fā)生在2號(hào)染色體的這個(gè)區(qū)域。

對(duì)位于2號(hào)染色體上突變位點(diǎn)的分析顯示(表2)，其中3個(gè)突變位點(diǎn)在基因間隔區(qū)，2個(gè)突變位點(diǎn)在基因外顯子區(qū)，1個(gè)突變位點(diǎn)在基因內(nèi)含子區(qū)。由此得到3個(gè)候選基因：Os02g28280、Os02g29530和Os02g22390。其中Os02g22390為目的基因的可能性相對(duì)較小，其測(cè)序覆蓋度極低且位點(diǎn)突變發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)，編碼蛋白為逆轉(zhuǎn)座蛋白。因此。剩余的1個(gè)SNP和1個(gè)InDel是可能性較大的候選突變位點(diǎn)。這兩個(gè)位點(diǎn)突變分別發(fā)生在Os02g28280和Os02g29530的外顯子區(qū)(圖3：A、B)。

圖2 細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果及分析A：野生型(KYJ)和突變體(zy17)劍葉1/2處下表皮橫向細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)，差異顯著。B：KYJ和zy17劍葉1/2處下表皮橫向維管束數(shù)目統(tǒng)計(jì)，差異顯著。C：KYJ與zy17劍葉1/2處下表皮橫向細(xì)胞平均寬度，兩者差異不顯著。

在zy17突變體中，候選基因Os02g28280在16 722 773 bp處發(fā)生堿基置換，產(chǎn)生非同義突變，C變?yōu)門，導(dǎo)致CDS翻譯過(guò)程中第42個(gè)密碼子GAT突變?yōu)锳AT，由天冬氨酸(Asp)變?yōu)樘於０?Asn)。Os02g28280編碼一個(gè)含258個(gè)氨基酸殘基的未知功能蛋白。在zy17突變體中，候選基因Os02g29530在17 560 608 bp處發(fā)生2個(gè)堿基TT缺失，導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止(圖3C)。Os02g29530編碼了一個(gè)包含PFAM結(jié)構(gòu)域糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白。與擬南芥中糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白(AT3G02350)的相似性為65%。

表2 突變位點(diǎn)分析

圖3 候選基因鑒定及相關(guān)分析A：候選基因1(C1)、Os02g28280的基因結(jié)構(gòu)圖；B：候選基因2(C2)、Os02g29530的基因結(jié)構(gòu)；C：Os02g29530基因在野生型KYJ(WT)和突變體zy17(M)中編碼蛋白的結(jié)構(gòu)比較；D、E：候選基因1和候選基因2的dCAPS驗(yàn)證；F、G：候選基因1和候選基因2的群體驗(yàn)證。

根據(jù)Os02g28280和Os02g29530基因上的突變位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)了 dCAPS1(Candi-1)和 dCAPS2 (Candi-2)兩個(gè)分子標(biāo)記(表1)。利用這兩個(gè)標(biāo)記對(duì)突變體與野生型KYJ分析的結(jié)果表明，突變體zy17中的這兩個(gè)候選基因確發(fā)生了突變(圖3：D、E)，對(duì)F2分離群體的檢測(cè)表明，這兩個(gè)突變都與F2群體中突變體表型共分離(圖3：F、G)。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了Os02g28280和Os02g29530為窄葉突變的候選基因。

3 討 論

水稻是雙子葉植物的模式生物。葉片整體結(jié)構(gòu)看似非常簡(jiǎn)單，但其發(fā)育卻是一個(gè)十分復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過(guò)程，涉及到基因與基因間的相互作用以及蛋白質(zhì)產(chǎn)物與體內(nèi)激素的平衡調(diào)節(jié)等。這些作用相互交織影響葉片發(fā)育進(jìn)程，從而導(dǎo)致葉形的變化[25]。

在水稻葉形相關(guān)報(bào)道中，一系列突變體都表現(xiàn)出窄葉表型，其中nal1、nal7、nal9、nrl1和tdd1都被證實(shí)是由于細(xì)胞分裂減少導(dǎo)致葉片變窄[7,8,12,15,18]。在本研究中，掃描電鏡檢測(cè)顯示，突變體zy17葉片細(xì)胞大小與野生型KYJ葉片細(xì)胞大小無(wú)顯著性差異，但其細(xì)胞數(shù)目和維管束數(shù)目相對(duì)野生型明顯減少，基因突變影響細(xì)胞分裂從而導(dǎo)致葉片變窄。為了進(jìn)一步了解其相關(guān)機(jī)理，本研究利用基因組重測(cè)序技術(shù)和連鎖分析對(duì)突變導(dǎo)致窄葉表型的基因進(jìn)行篩查，通過(guò)連鎖分析，確定位于2號(hào)染色體的Os02g28280和Os02g29530為候選基因。分析測(cè)序結(jié)果過(guò)程中，Os02g28280基因處突變隨機(jī)測(cè)序36次，35次為T(突變型)，1次為C(野生型)。然而我們對(duì)180的群體進(jìn)行測(cè)試表明，該突變位點(diǎn)與表型共分離。測(cè)定一次C(野生型)可能是由于測(cè)序的誤差所致。而候選基因Os02g29530處突變隨機(jī)測(cè)序21次，21次皆為TT缺失(突變型)，基因與表型完全連鎖。我們進(jìn)一步的群體分析也證實(shí)，候選基因Os02g29530中的缺失突變與表型共分離。對(duì)二者的相應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Os02g28280編碼一個(gè)功能未知的蛋白，突變導(dǎo)致天冬氨酸(Asp)變?yōu)樘於０?Asn)。Os02g29530編碼蛋白則與其在擬南芥中的同源蛋白(AT3G02350)含有一樣的結(jié)構(gòu)域，即與糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)的PFAM結(jié)構(gòu)域，基因突變后，蛋白翻譯提前終止，結(jié)構(gòu)域功能喪失[26]。

根據(jù)以前相關(guān)報(bào)道可知，葉形變化和參與細(xì)胞壁形成的基因密切相關(guān)。木聚糖是植物次生細(xì)胞壁中半纖維素的最主要組分，近年來(lái)通過(guò)對(duì)雙子葉模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)中木聚糖合成缺陷的突變體分析表明：GT43家族的IRX9、IRX9-L、IRX14、IRX14-L，GT47家族的FRA8、F8H、IRX10、IRX10-L，GT8家族的IRX8、PARVUS、QUA1、GUX1、GUX2等參與了木聚糖主鏈、還原末端序列和側(cè)鏈的合成[27]。在水稻中已有的相關(guān)窄葉基因報(bào)道中，通過(guò)QTL定位獲得的DNL1、NRL1和ND1都是位于12號(hào)染色體上的同一窄葉、矮桿基因，編碼屬于糖基轉(zhuǎn)移酶家族2(GT2)的類纖維素合成酶D4，在種子、根尖以及莖頂端分生組織等分裂能力較強(qiáng)的部位集中表達(dá)，最終可以通過(guò)影響植物細(xì)胞壁形成導(dǎo)致水稻葉片出現(xiàn)變窄的表型[14~17]。Os02g29530編碼一個(gè)含PFAM結(jié)構(gòu)域的糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白，是可能性最高的候選基因，可以通過(guò)調(diào)控水稻木聚糖合成影響細(xì)胞壁形成，從而導(dǎo)致水稻葉片變窄。

水稻葉片形態(tài)發(fā)育過(guò)程十分復(fù)雜，只有合理利用不同葉片形態(tài)資源，對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行克隆和功能研究，才能更好地揭示葉形發(fā)育的機(jī)理。2013年Jin等[28]對(duì)擬南芥中Os02g29530的同源蛋白UGT74D1進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)和生長(zhǎng)素相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶，UGT74D1基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)會(huì)出現(xiàn)和本研究的水稻突變體類似的窄葉、矮桿表型，從而為本研究提供一個(gè)新思路，Os02g29530也可能通過(guò)影響生長(zhǎng)素調(diào)控葉形。水稻窄葉基因NAL1、NAL7、NAL2和NAL3都是通過(guò)影響生長(zhǎng)素從而對(duì)葉形進(jìn)行調(diào)控，其中NAL1基因編碼一生物學(xué)功能未知的蛋白，在微管組織中有豐富表達(dá)，影響微管發(fā)育，導(dǎo)致生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸出現(xiàn)障礙，從而表現(xiàn)窄葉表型[7]。NAL7基因則編碼屬于YUCCA基因家族的黃素單氧化酶，其可能通過(guò)影響生長(zhǎng)素的生物合成，參與葉形調(diào)控過(guò)程[9]。NAL2和NAL3編碼與WUSCHEL相關(guān)的同源蛋白(OsWOX3A)，通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素合成運(yùn)輸影響葉片發(fā)育[13]。

水稻的葉形變化與影響細(xì)胞壁形成的基因以及生長(zhǎng)素合成降解、極性運(yùn)輸?shù)幕蚨济芮邢嚓P(guān)。本研究中突變體zy17究竟是通過(guò)哪種途徑發(fā)揮作用尚不清楚，為了更好地了解其作用機(jī)理，還需對(duì)該基因及其功能進(jìn)行深入探索。在以后的研究中，我們需要進(jìn)一步構(gòu)建基因組互補(bǔ)載體對(duì)zy17突變體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，以確定兩個(gè)候選基因中哪一個(gè)是ZY17基因。

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(責(zé)任編委:邢永忠)

Genetic analysis and identification of candidate genes for a narrow leaf mutant(zy17)in rice

Xueqian Li1,2,Ran Xu2,Penggen Duan2,Yingbao Wu2,Yuehua Luo1,Yunhai Li2

1.Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresources and Agricultural College of Hainan University, Haikou 570228,China;
2.State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering,Institute of Genetics and Developmental Biology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China

Control of organ size by cell proliferation and cell expansion is a fundamental process in plant development,but little is known about the genetic and molecular mechanisms that determine organ size in plants.To understand the genetic and molecular mechanisms of organ growth control,we isolate a set of mutants with altered leaf size and identify the narrow leaf mutant,zhaiye 17(zy17)(zhaiye means narrow leaf in Chinese).zy17 exhibits narrow leaves,slightly short plants,small panicles,reduced panicle branches and decreased grain numbers per panicle compared with the wild type.Our cytological analyses show that the narrow leaf phenotype of zy17 is caused by the reduced number of cells,indicating that ZY17 regulates cell proliferation.Genetic analyses show that the zy17 mutant phenotypes are controlled by a single gene.Using the whole genome resequencing approach and linkage analysis,we identify Os02g22390,Os02g28280 and Os02g29530 as candidate genes.Os02g22390 encodes a retrotransposon protein with the mutation occurring in the intronic region;Os02g28280 encodes a protein with unknown function with a base substitution resulting in non-synonymous mutation;Os02g29530 encodes a protein containing the PFAM domain related to glycosyltransferase,with a 2 bp deletion mutation causing a premature termination.Further studies on these three candidate genes will be helpful for understanding the molecular mechanism of organ size control in rice.

rice(Oryza sativa L.);narrow leaf mutant;cell proliferation;genetic basis

2015-02-02;

2015-04-03

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(973計(jì)劃)(編號(hào)：2013CBA01401)，海南省科技項(xiàng)目(編號(hào)：ZDZX2013023)，“中央財(cái)政支持中西部高校提升綜合實(shí)力專項(xiàng)”和植物細(xì)胞與染色體工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(編號(hào)：PCCE-KF-2014-05)資助

李雪倩，碩士研究生，專業(yè)方向：作物遺傳育種。E-mail;825675580@qq.com

徐冉，博士，助理研究員，研究方向：植物器官大小調(diào)控。E-mail;284505584@qq.com李雪倩和徐冉為并列第一作者。

李云海，博士，研究員，研究方向：植物種子和器官大小調(diào)控。E-mail:yhli@genetics.ac.cn

羅越華，博士，研究員，研究方向：水稻光溫敏雄性不育分子機(jī)制及花粉發(fā)育分子機(jī)理。E-mail;lyhhk@163.com

10.16288/j.yczz.15-056

時(shí)間:2015-4-29 10:56:55

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150429.1056.003.html

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