ARID1A對乳腺癌生長的抑制及潛在調控機制

張 倩 顏海波 劉 鋒

(復旦大學生物醫(yī)學研究院醫(yī)學系統(tǒng)生物學研究中心 上海 200032)

ARID1A對乳腺癌生長的抑制及潛在調控機制

張 倩 顏海波 劉 鋒△

(復旦大學生物醫(yī)學研究院醫(yī)學系統(tǒng)生物學研究中心 上海 200032)

目的 探討ARID1A(AT-rich interactive domain containing protein 1A)對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的影響,包括對細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡的影響及潛在的機制。方法 采用小發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, sh RNA)及小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)的RNA干擾技術(RNA interference,RNAi)下調細胞ARID1A基因表達,采用瞬時表達及穩(wěn)定表達方法過表達ARID1A;通過Western blot檢測干擾或過表達ARID1A基因后其蛋白表達水平及P-Akt、PARP和Caspase-3蛋白水平的變化,應用MTT法、細胞計數(shù)法及克隆形成檢測細胞增殖的變化;應用流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期的變化。結果 應用RNA干擾技術沉默ARID1A基因后,乳腺癌細胞或正常乳腺細胞增殖速度顯著上升(Bcap-37-siARID1A,P＜0.001;MCF7-siARID1A,P＜0.01;MCF10A-sh ARID1A,P＜0.001;HMEC-sh ARID1A,P＜0.001),Akt磷酸化水平上升,克隆形成能力顯著提高。過表達ARID1A后,細胞增殖速率均顯著下降(P＜0.001),Akt磷酸化水平下降,細胞周期發(fā)生變化,其中S期減少,G2期增多,同時細胞凋亡比例上升。結論 ARID1A在乳腺癌中發(fā)揮著抑制腫瘤生長的作用,提示ARID1A可能成為臨床檢測、診斷和治療的有效潛在靶標。

ARID1A; 腫瘤抑癌基因; 乳腺癌

*This work was supported by the Chinese National Key Program on Basic Research(2011CB910702,2013CB911202)and the Natural Science Foundation of Shanghai(14ZR1402100).

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,2008年全球女性新增的乳腺癌患者占所有癌癥患者的23%,其新增加死亡比例為14%[1]。在西方發(fā)達國家,乳腺癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤的首位。目前中國乳腺癌發(fā)病已進入快速增長期,女性中乳腺癌的發(fā)病率是10萬之10～60,預測到2021年乳腺癌的發(fā)病率將達到10萬分之100,其中HER2陽性的乳腺癌升幅最快,患者數(shù)量在過去30年間增加了96%,并且發(fā)病高峰以44～55歲左右女性為主。

SWI/SNF是一個重要的染色質重塑復合物,是在研究酵母交換型轉換(mating-type switching, SWI)和蔗糖發(fā)酵(sucrose non fermenting,SNF)時發(fā)現(xiàn)的。ARID1A是SWI/SNF染色體重塑復合物中的一個非催化亞基,定位于人類第1號染色體1p35.3,總共包含20個外顯子,編碼一個由2285個氨基酸殘基構成、相對分子質量(Mr)約為240 000的蛋白質(圖1)。ARID1A蛋白一般定位于細胞核,也有報道突變的ARID1A定位于胞質,在全身多種組織如胸腺、前列腺、脾臟、小腸和直腸等均有大量表達。

人類ARID1A在進化上高度保守,果蠅中同源蛋白為Osa1,而酵母中同源蛋白為Swi1。ARID1A擁有兩個典型結構域,即N-端ARID(AT-rich interactive domain)結構域和C-端3個富含亮氨酸的LXXLL模體(motif),體外實驗及結構分析表明該結構域可與富含AT的DNA序列結合,但是這種結合并沒有序列特異性。3個LXXLL模體構成了糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor,GR)結合的結構域,可通過與GR等細胞核轉錄因子結合而增強轉錄激活效應,因此C-端結構域對ARID1A發(fā)揮功能是不可或缺的[2](圖1)。

圖1 ARID1A結構域示意圖Fig 1 Structure of ARID1A

近年來有多項腫瘤外顯子測序發(fā)現(xiàn)ARID1A基因在腫瘤中頻繁突變。在卵巢透明細胞癌中突變率最高,達到46%～57%[3],子宮內膜癌中為30%～41.9%[4]。在Burkitt淋巴瘤中,有17%是截斷(truncation)突變[5]。在肝癌中,其突變率是10%～16.8%[6-7],在HBV相關的肝癌中突變率是13%[8]。在11%的童年成神經(jīng)細胞瘤中,ARID1A和ARID 1B發(fā)生了染色體缺失及其他序列突變[9]。肺癌中該基因突變率是8%,主要是無義突變和導致移碼的插入和缺失(insertion and deletion, INDEL)突變[10]。在乳腺癌中,報道的突變率并不高,僅有3%(小樣本)[11],但也有報道稱在乳腺癌中ARID1A所在的1p36染色體位點附近的DNA拷貝數(shù)目丟失,同時在200例乳腺癌樣本中,ARID1A的RNA及蛋白質的低表達與乳腺癌的惡性程度呈正相關[12]。在另一項研究中發(fā)現(xiàn)在112例乳腺癌樣本中ARID1A的低表達率為56%,且ARID1A的低表達與乳腺癌的進展、轉移存在顯著正相關[13]。但是,關于ARID1A在乳腺癌中的功能,國內外鮮為報道。因此,ARID1A在乳腺癌中的功能和機制還有待深入研究。本實驗通過RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術以及過表達技術,在細胞系中調節(jié)ARID1A的表達,以研究ARID1A在乳腺癌中的功能。

材料和方法

主要實驗儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Nuarie公司);多功能酶標儀Synergy H4(美國伯騰儀器有限公司);熒光倒置顯微鏡DP70(日本Olympus公司);LAS-3000成像系統(tǒng)(日本FUJIFILM公司); Mini-Protean電泳系統(tǒng)(美國BioRad公司);流式細胞儀,細胞計數(shù)儀(美國Beckman公司)。

材料和試劑 乳腺癌細胞系MCF-7、MDAMB-231、Bcap-37及正常乳腺上皮細胞MCF10A、HMEC(上海生命科學研究院細胞庫);感受態(tài)DH5α(北京天根生化科技有限公司);96孔板(美國Corning公司);轉染試劑Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司);Opti-MEM(美國Gibco公司);細胞培養(yǎng)基RPMI 1640、DMEM、DMEM/F12和(美國HyClone公司);中抽試劑盒NucleoBond Xtra Midi(德國MACHERY-NAGEL公司);胎牛血清, 0.25%胰蛋白酶(美國Invitrogen公司);工具酶及DNA分子量標準、限制性內切酶、T4 DNA連接酶, PCR聚合酶(美國NEB公司);PCR產(chǎn)物回收試劑盒,DNA凝膠回收試劑盒,質粒小抽試劑盒(德國QIAGEN公司);細胞周期和凋亡試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

細胞培養(yǎng) MCF-7、293FT、MDA-MB-231、Bcap-37均用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素);MCF10A和HMEC細胞系所用培養(yǎng)基(F12培養(yǎng)基)配方如下見表1。

表1 F12培養(yǎng)基配方Tab 1 Supplements of F12 culture medium

所有的培養(yǎng)基中加入1%青霉素/鏈霉素(美國Hyclone公司),細胞放置在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

Western blot檢測 待指數(shù)生長期的細胞生長至90%融合度時,棄去培養(yǎng)基,預冷PBS洗滌2次,加入SDS裂解液,提取蛋白,根據(jù)BCA法定量蛋白濃度;配置10%分離膠及5%濃縮膠后對蛋白進行上樣;接著進行電泳及轉膜,最后進行抗體免疫反應,ECL化學發(fā)光。

穩(wěn)定細胞系的建立 sh RNA的序列由Sigma官方網(wǎng)站上獲取(已驗證為有效干擾序列),序列如下:sh1(TRCN0000040123),5′-CGCTCTACATCTTCTGCCTTA-3′;sh2(TRCN0000040126),5′-GACAGA-TTTCTACCACTCCAA-3′;對照p LKO.1-sh熒光素酶的target序列為:5′-GTGCGCTGCTGG-TGCCAAC-3′。首先制備雙鏈低聚糖,再分別對制備的低聚糖進行退火,p LKO.1TRC-克隆載體進行雙酶切,接著對回收產(chǎn)物和所得雙鏈低聚糖進行連接反應,隨后轉染DH5α感受態(tài)細胞,涂板,再進行菌落PCR驗證,陽性轉化子即可進行后續(xù)病毒包裝。慢病毒共轉染體系如下:p LKO.1-sh目標基因(或p LKO.1-sh熒光素酶)3μg,psPAX2 2.25μg,p MDZ.G 0.75μg。最后將病毒感染細胞系,再根據(jù)嘌吟霉素抗性篩選穩(wěn)定細胞系。

逆病毒載體的構建 載體構建:首先將目的基因進行PCR后膠回收,再對目的基因及pBABE雙酶切后進行連接反應。病毒包裝:將2×106個生長良好的293FT細胞傳代到直徑10 cm的培養(yǎng)皿中, 18 h后進行共轉染。逆病毒共轉染體系:p BABE-puro-目標基因10μg,p CL-10A 10μg。將以上2種質粒用opti-MEM定容到500μL;另外取12μL Trans-EZ用opti-MEM定容到500μL;再將兩者混合,靜置20 min,滴加到293FT細胞。培養(yǎng)48 h后收集含病毒的上清,1 000×g離心5 min,然后-80℃保存。病毒感染:將病毒上清滴加到細胞中,24 h后將病毒液更換為正常培養(yǎng)基。最后再根據(jù)載體抗性篩選細胞。

MTT法檢測細胞增殖實驗 將1 000～2 000個生長良好的細胞接種于96孔培養(yǎng)皿中,于37℃、5% CO2孵箱中孵育;每天取出一塊96孔板加MTT溶液(5 mg/mL)20μL/孔,37℃,繼續(xù)孵育4 h后,棄上清,每孔加入150μL DMSO,振蕩10 min,使結晶物充分溶解,然后用酶標儀在490 nm處測定吸光度(D)值,根據(jù)D值繪制細胞生長曲線,連續(xù)檢測5天。

細胞計數(shù)法檢測細胞增殖 將2×106個生長良好的細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);每天消化實驗組及對照組細胞,消化細胞體積為1.1 m L/皿,取1 m L進行細胞數(shù)量檢測,繪制生長曲線,連續(xù)檢測3天。

克隆形成實驗 將200個生長良好的細胞接種于6孔培養(yǎng)皿中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);培養(yǎng)2周后,吸去培養(yǎng)液,PBS清洗3次,結晶紫染色,計算克隆形成數(shù)目。

細胞周期檢測 收集細胞:將消化的細胞收集于離心管內,1 000×g離心5 min,PBS清洗1次。細胞固定:向離心管中加入1 mL預冷的70%乙醇,吹打均勻,4℃固定2 h或更長時間,1 000×g離心5 min,吸除上清,加入預冷PBS重懸,1 000×g離心5 min,然后小心吸除上清。染色:向離心管中加入適量碘化丙啶,緩慢并充分重懸細胞沉淀,37℃避光溫浴30 min,隨后4℃避光保存。流式檢測和分析:用流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm波長處檢測紅色熒光,同時檢測光散射情況,用軟件對結果進行分析。

細胞凋亡與壞死檢測 收集細胞:收集50～100萬消化的細胞于1.5 m L離心管內,1 000×g離心5 min,棄上清,細胞沉淀用0.8～1 m L細胞染色緩沖液重懸。染色:加入5μL Hoechst染色液;加入5μL PI染色液;混勻,冰浴或4℃孵育20～30 min。檢測和分析:流式細胞儀檢測紅色熒光和藍色熒光,用軟件對結果進行分析。

統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計學處理。對照組與實驗組之間生長差異采用t檢驗,差異顯著性檢驗水平設為雙尾0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

構建ARID1A shRNAs穩(wěn)定細胞系 采用基因下調的方法模擬ARID1A在正常乳腺上皮細胞中的表達缺失,并檢測其增殖能力,以驗證ARIDIA蛋白表達的缺失是否影響細胞生長。以p LKO.1為載體,設計了2條針對ARID1A的短發(fā)夾片段,構建重組質粒p LKO.1-ARID1A Sh1(sh1)及p LKO.1-ARID1A Sh2(sh2),對照組用p LKO.1,利用293FT細胞包裝生產(chǎn)病毒液,感染正常乳腺上皮細胞MCF10A及正常乳腺上皮細胞HMEC,48 h后嘌吟霉素篩選ARID1A sh RNAs穩(wěn)定細胞株。通過Western blot驗證表明在正常乳腺上皮細胞MCF10A及HMEC中ARID1A sh RNAs穩(wěn)轉株構建成功(圖2A)。

圖2 MCF10A和HMEC細胞中shRNA介導的穩(wěn)定干擾后ARID1A蛋白質表達水平Fig 2 The protein level of ARID1A after stable knockdown by sh-RNA in MCF10A and HMEC cell lines

干擾ARID1A的表達提高細胞的增殖能力及克隆形成能力 我們首先在Bcap-37與MCF-7乳腺癌細胞系中進行基因敲低,并進行Western blot驗證。接著我們對干擾ARID1A表達的Bcap-37與MCF-7細胞進行細胞增殖檢測。在Bcap-37與MCF-7乳腺癌細胞中敲低ARID1A基因后,其增殖速度均顯著高于正常細胞,差異有統(tǒng)計學意義(圖3A,P＜0.001)。同時,ARID1A sh RNAs穩(wěn)轉株MCF10A及HMEC細胞的增殖速度也顯著高于對照組細胞,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。

另外,我們對以上兩種ARID1A sh RNAs穩(wěn)轉細胞株進行克隆形成實驗,結果表明ARID1A sh RNAs穩(wěn)轉株細胞克隆形成能力顯著高于對照組細胞(p LKO.1)(圖3C)。以上結果表明:ARID1A能夠調控細胞的增殖,提示ARID1A在乳腺癌中可能扮演著抑癌基因的角色。

過表達ARID1A抑制了細胞的增殖能力 敲除ARID1A的細胞系其增殖及克隆形成能力均顯著高于對照組細胞,本研究通過在細胞系中過表達ARID1A來檢測該基因對細胞增殖的影響。首先,以pcDNA3.1為載體構建了pcDNA3.1-ARID1A瞬時過表達載體,并通過Western blot驗證pcDNA3.1-ARID1A在HeLa細胞系中過表達成功(圖4)。為了檢測pcDNA3.1-ARID1A過表達后對HeLa細胞增殖的影響,應用Brdu法檢測細胞增殖速率,結果表明在HeLa細胞中過表達pcDNA3.1-ARID1A的細胞生長速率顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001,圖4A)。為進一步證實該實驗結果,本研究構建了pBABE-ARID1A穩(wěn)定表達載體,并在293FT及乳腺癌細胞系MDA-MB-231中構建穩(wěn)轉細胞株, Western blot結果顯示穩(wěn)轉株構建成功(圖4B)。細胞計數(shù)法測定結果顯示293FT-pBABE-ARID1A及MDAMB-231-pBABE-ARID1A細胞的生長速率顯著低于對照組細胞(P＜0.001)。這些結果進一步說明ARID1A在乳腺癌細胞中對細胞增殖起著抑制作用。

圖3 干擾ARID1A后細胞的增殖及克隆形成能力情況Fig 3 The influence of cell proliferation and colony formation ability after knockdown of ARID1A

ARID1A通過調控細胞周期及Akt磷酸化水平調節(jié)乳腺癌細胞的增殖 293FT及乳腺癌細胞MDA-MB-231過表達ARID1A后細胞周期發(fā)生了顯著改變,ARID1A過表達時S期細胞減少,G2期細胞增多(圖5A)。

ARID1A的突變或表達與某些其他基因的突變和表達相關,如PI3K。已發(fā)現(xiàn)在腦膠質瘤中, ARID1A能夠調控PI3K/Akt信號通路來抑制細胞的增殖,在膠質瘤細胞中ARID1A過表達會下調Akt及S6K磷酸化,表明ARID1A通過PI3K-Akt通路調節(jié)細胞增殖[14]。Liang等[4]發(fā)現(xiàn),在子宮內膜癌中ARID1A低表達和PI3K途徑的突變和激活有關。因此本研究檢測了ARID1A干擾及過表達時P-Akt蛋白水平變化,結果顯示,當ARID1A干擾時,P-Akt蛋白水平在乳腺癌細胞系Bcap-37, MCF-7及正常乳腺上皮細胞MCF10A中表達上升(圖5B、5C),相反,當在293FT、Hela細胞及乳腺癌細胞系MDA-MB-231中過表達ARID1A時,P-Akt蛋白水平顯著降低(圖5D)。

在白血病中ARID1A能夠引起Fas介導的細胞凋亡途徑[15]。本研究發(fā)現(xiàn),ARID1A過表達后,促凋亡蛋白Caspase-3及PARP表達水平均上升(圖5E),流式細胞儀檢測到的細胞凋亡比例也隨之增加(圖5F),表明ARID1A能夠促進細胞凋亡來影響腫瘤細胞的生長。

綜上所述,在乳腺癌中,ARID1A能夠通過影響Akt磷酸化水平、細胞周期及細胞凋亡,從而調控細胞的增殖。

圖4 過表達ARID1A細胞的增殖情況Fig 4 Effect of ARID1A overexpressing on cell proliferation

圖5 ARIDIA對P-Akt的調控及對細胞周期與凋亡的影響Fig 5 The regulation of ARID1A on P-Akt，cell cycle and apoptosis

討 論

ARID1A是SWI/SNF(染色體重塑復合物的一種)中的一個亞基,參與基因轉錄、DNA復制和DNA損失修復等過程。文獻報道ARID1A在卵巢癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤中頻繁發(fā)生基因突變,提示其可能是一個潛在的抑癌基因。

SWI/SNF染色體重塑復合物通過與其他蛋白的相互作用來影響基因的轉錄,而ARID1A作為SWI/SNF復合物的一個亞基,可以招募并結合轉錄激活/抑制因子。目前發(fā)現(xiàn),ARID1A可以招募如p53、SMADs、AP-1、STAT3和E2F家族的轉錄因子,從而調控基因轉錄。而ARID1A的缺失會影響SWI/SNF復合物的各個方面,如復合物本身的組裝,復合物對下游基因位點的靶向性,復合物與其他轉錄調控子的結合能力以及核小體“sliding”的活性等,最終導致基因轉錄發(fā)生異常[16]。本課題組通過前期研究發(fā)現(xiàn),在胃癌中,ARID1A的表達缺失與胃癌預后及腫瘤轉移相關,ARID1A能夠抑制胃癌細胞的轉移和浸潤,并且發(fā)現(xiàn)其作用機制與E-cadherin相關[17]。

已有研究表明,SWI/SNF復合物的組成亞基與細胞周期、衰老、凋亡以及腫瘤的發(fā)生有著密切的關系[2,18]。Nagl等[19]在分化相關細胞中發(fā)現(xiàn)ARID1A可直接作用于C-myc啟動子,抑制其表達并介導細胞周期進展;后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),非催化亞基ARID1A缺失造成分化細胞的細胞周期停滯[20]。以上的數(shù)據(jù)顯示ARID1A敲除及過表達都對細胞的增殖都產(chǎn)生了影響,而在乳腺癌中相關的影響機制并不明確。

目前已有多篇文獻報道ARID1A在卵巢癌、肝癌、胃癌及乳腺癌等腫瘤中頻繁發(fā)生基因突變,認為ARID1A能夠抑制細胞的增殖[14,21],Guan等[22]發(fā)現(xiàn)ARID1A符合讀框(In-frame)的INDEL突變體基因會失去激活CDKN1A(p21)轉錄及抑制細胞增殖的能力。在婦科腫瘤中,ARID1A與p53協(xié)同,通過調節(jié)p21及SMAD3來調節(jié)腫瘤細胞的增殖[23]。在腦膠質瘤中,ARID1A通過影響PI3K/ Akt信號通路來抑制細胞增殖[21]。在胃癌細胞系里,敲低ARID1A促進細胞增殖,而過表達則抑制細胞增殖及克隆形成[24]。而目前ARID1A在乳腺癌中的研究比較少。

本研究首先通過過表達及RNAi的方法來檢測ARID1A對乳腺癌細胞增殖的影響。RNAi技術處理ARID1A后,促進了腫瘤細胞的生長,并且Akt磷酸化水平上升。相反,過表達ARID1A后,細胞的增殖速度減緩,Akt的磷酸化水平也隨之下降。這些研究結果與目前在胃癌及子宮內膜癌及卵巢癌中的報道結果一致。在乳腺癌中,本研究發(fā)現(xiàn)過表達ARID1A后,G2期的細胞比例增加,S期細胞則有所減少。近年有文獻報道在子宮內膜癌中ARID1A與細胞凋亡有關[25]。與本研究結果一致,即在HeLa細胞中過表達ARID1A后細胞凋亡顯著增加,并且細胞凋亡相關蛋白PARP及Caspase-3的蛋白表達水平上升。

以上結果表明,敲低ARID1A促進了腫瘤細胞的生長及克隆形成,ARID1A過表達則抑制了腫瘤細胞的生長,ARID1A可能通過細胞周期、細胞凋亡及PI3K/Akt通路的調節(jié)來調控細胞的生長與增殖。本研究豐富了ARID1A作為腫瘤抑癌基因的證據(jù),并且在乳腺癌中得到進一步證實,對其調控機制也做出了進一步分析。但是在乳腺癌中并沒有明確的報道ARID1A在體內是否影響腫瘤的生長;是否與相關轉錄因子相互作用,進一步結合到下游基因的啟動子區(qū)域來調控基因的表達;或是調控PI3K/Akt信號通路,這些問題都亟待進一步研究。

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ARID1A acts as a tumor-suppressor in breast cancer and its underlying regulatory mechanism

ZHANG Qian,YAN Hai-bo,LIU Feng△
(Center of Medical Systems Biology,Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University,Shanghai 200032,China)

Objective To investigate the functional role and the underlying mechanism of AT-rich interactive domain containing protein 1A(ARID1A)in breast cancer,including its influence on cell proliferation,cell cycle and cell apoptosis in vitro. Methods ARID1A was down-regulated by RNA interference(RNAi)of short hairpin RNA(sh RNA)and small interfering RNA(siRNA)or overexpressed by transient or stable transfection.The protein changes of P-Akt,PARP and Caspase-3 after ARID1A silencing or overexpression were determined by Western blot.Cell proliferation was measured using the MTT method and cell counting,while tumorigenicity was detected by colony formation assay.Furthermore,changes in cell cycle and cell apoptosis were measured by FACS. Results Breast cancer or normal breast cells with ARID1A silencing showed an elevated proliferation rate(Bcap-37-siARID1A,P＜0.001;MCF7-siARID1A,P＜0.01;MCF10A-sh ARID1A,P＜0.001; HMEC-sh ARID 1 A,P＜0.001),induced phosphorylation of Akt and an increased colony formationrate.Over expression of ARID1A could down-regulate cell proliferation(P＜0.001),and also down-regulate Akt phosphorylation.Expression of ARID1A also induced cell accumulation in G2-phase,cell decrease in S-phase,and cell apoptosis obviously. Conclusions As a tumor suppressor in breast cancer.ARID1A may be a potential clinicall biomarker in detection,diagnosis and therapy.

ARID1A; tumor-suppressor gene; breast cancer

R737

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.04.001

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(2011CB910702,2013CB911202);上海市自然科學基金(14ZR1402100)△Corresponding author E-mail:liuf@fudan.edu.cn

2014-11-20;編輯:段佳)