南極磷蝦自溶過程蛋白質(zhì)組分含量變化

黃顯彬，曹 榮，李智博

（1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116000；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071）

南極磷蝦（Euphausia superba）屬于無脊椎動(dòng)物中的節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、軟甲亞綱、磷蝦目，廣泛分布于南極水域，生物量達(dá)數(shù)億t[1]。隨著近海漁業(yè)資源的日益減少，南極磷蝦資源受到世界漁業(yè)發(fā)達(dá)國家的廣泛關(guān)注，我國也極為重視南極磷蝦的開發(fā)，并于2009年開始對(duì)南極磷蝦進(jìn)行商業(yè)捕撈和加工利用[2]。

南極磷蝦富含優(yōu)質(zhì)蛋白，但體內(nèi)含有活性很高的蛋白酶系[3]，南極磷蝦起捕后會(huì)迅速發(fā)生自溶。因此，南極磷蝦捕撈后需立即冷凍或加工，但是遇到捕撈量集中的情況，南極磷蝦往往得不到及時(shí)處理，會(huì)導(dǎo)致原料品質(zhì)劣化[4]，造成經(jīng)濟(jì)損失。南極磷蝦蛋白質(zhì)極易自溶的生物學(xué)特性嚴(yán)重束縛了資源的高效利用，對(duì)南極磷蝦自溶機(jī)理與自溶過程的研究一直是國內(nèi)外科研人員的研究熱點(diǎn)。如遲海等[5]分析了南極磷蝦0、5 和20℃條件下細(xì)菌總數(shù)、嗜冷菌數(shù)、TVB-N和TMA-N 等鮮度指標(biāo)的變化情況；李學(xué)英[6]等對(duì)南極磷蝦0～3℃冷藏過程中pH、出肉率、可溶性蛋白等生化指標(biāo)進(jìn)行了研究。而目前有關(guān)南極磷蝦自溶過程蛋白質(zhì)組分含量變化的系統(tǒng)研究還較少。

本文研究了南極磷蝦在4℃和20℃條件下非蛋白氮（NPN）、TCA 可溶性蛋白、氨基酸態(tài)氮以及TVB-N 等含量的變化情況，旨在進(jìn)一步探索南極磷蝦自溶規(guī)律，為南極磷蝦蛋白的高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

南極磷蝦，由“南極磷蝦資源分布與冷鏈技術(shù)”項(xiàng)目組于2014年5月在南極48.1 漁業(yè)區(qū)捕撈，捕撈后迅速保存在-20℃冰柜中，2014年7月運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室后，繼續(xù)保存于-60℃超低溫冰箱中備用。

1.2 儀器設(shè)備

DNP-9162 型恒溫培養(yǎng)箱（上海精密試驗(yàn)設(shè)備公司）；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；TYS-200 型多功能高速粉碎機(jī)（浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司）；UV-2802 型紫外/可見分光光度計(jì)（尤尼柯儀器有限公司）；冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；DZ-400/2L 型真空包裝機(jī)（諸城市廣元包裝機(jī)械廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品解凍 凍結(jié)的南極磷蝦樣品采用流水方式解凍。具體操作步驟為：凍結(jié)的南極磷蝦放入真空包裝袋中，抽真空，之后置于塑料盒中，采用自然流水解凍。以南極磷蝦個(gè)體基本分離作為解凍終點(diǎn)。將解凍的南極磷蝦樣品分別置于4℃和20℃培養(yǎng)箱中貯藏，在0、1、2、4、6、8 h 時(shí)取樣進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.2 粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定 參照GB/T 5009.5-2010[7]，采用凱氏定氮法。

1.3.3 非蛋白氮（NPN）與TCA 可溶性蛋白含量測(cè)定 將南極磷蝦按照1 ∶4（m/v）比例均質(zhì)。準(zhǔn)確稱取勻漿液10 g，精確到0.001 g，置于100 m L 離心管中，加入10 m L 10%三氯乙酸（TCA）溶液，振蕩器震蕩1 min，靜置30 min，之后8 500 r/min 離心20 min，取上清液備用。取上清液10 m L，采用凱氏定氮法測(cè)定其中的氮元素含量，即為非蛋白氮。取上清液1 m L于試管中，采用雙縮脲法測(cè)定TCA 可溶性蛋白含量。

1.3.4 氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定 參照GB/T 5009.39-2003[8]，采用比色法測(cè)定。

1.3.5 總揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量測(cè)定 參照SC/T 3032-2007[9]，采用微量擴(kuò)散法。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦自溶過程中NPN 含量變化

由圖1 可以看出，南極磷蝦初始NPN 值較高，達(dá)到5.25 mg/g，占南極磷蝦總氮的20.70%，這與磷蝦原料歷經(jīng)長時(shí)間的冷鏈運(yùn)輸有關(guān)。在4℃和20℃條件下，南極磷蝦NPN 含量都隨著時(shí)間的延長而增加。在最初的1 h 內(nèi)，4℃和20℃兩組的NPN 無顯著差異，從2 h 開始，20℃組的NPN 含量開始顯著高于4℃組（P<0.05），這說明南極磷蝦的自溶酶系在20℃時(shí)具有很高的活性，導(dǎo)致蛋白大量降解，至8 h 時(shí)已達(dá)到12.67 mg/g，占到總氮的49.96%。4℃條件下，NPN含量的增加較為緩慢，8 h 時(shí)為8.40 mg/g，占總氮的33.12%，說明低溫在一定程度上抑制自溶酶系的活力。

2.2 南極磷蝦自溶過程中TCA 可溶性蛋白和氨基酸態(tài)氮含量變化

由圖2 可以看出，20℃條件下TCA 可溶性蛋白含量隨時(shí)間延長迅速增加，8 h 后，已由初始的13.28 mg/g 增至59.55 mg/g。而4℃條件下，TCA 可溶性蛋白含量增速平緩。這說明隨測(cè)試范圍內(nèi)，蛋白酶系隨溫度的升高而呈現(xiàn)活力增大的趨勢(shì)。

氨基酸態(tài)氮的變化趨勢(shì)與TCA 可溶性蛋白基本一致，但氨基酸態(tài)氮的含量較低，初始值為0.05 mg/g，20℃條件下8 h 后也僅為0.14 mg/g，與TCA 可溶性蛋白含量相比顯著偏低（P<0.01），這說明南極磷蝦自溶初期主要是大分子蛋白被降解為肽類，而自溶酶系分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的游離氨基酸非常有限。

圖1 南極磷蝦在4℃和20℃條件下NPN 含量的變化

圖2 南極磷蝦在4℃和20℃條件下TCA 可溶性蛋白與氨基酸態(tài)氮含量的變化

2.3 南極磷蝦自溶過程中TVB-N 含量變化

南極磷蝦TVB-N 初始值為0.08 mg/g。4℃條件下，南極磷蝦在前2 h 之內(nèi)TVB-N 值變化不大，2 h后緩慢增加，在8 h 后達(dá)到0.16 mg/g。20℃條件下，TVB-N 含量在前1 h 內(nèi)變化不大，1 h 后TVB-N 隨時(shí)間延長迅速增加，至8 h 時(shí)，已達(dá)到0.21 mg/g。我國對(duì)水產(chǎn)鮮活品TVB-N 的限量值為<0.30 mg/g，南極磷蝦在20℃條件下8 h 時(shí)TVB-N 含量已超過0.20 mg/g，表明實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)盡快加工，避免高溫條件下長時(shí)間貯存。

3 討 論

圖3 南極磷蝦在4℃和20℃條件下TVB-N 值的變化

由凱氏定氮法測(cè)得南極磷蝦氮元素含量為25.36 mg/g，折合粗蛋白含量為15.85%（濕基計(jì)），說明南極磷蝦是一種典型的高蛋白海洋動(dòng)物，這與Tou 等[10]的研究結(jié)果類似。南極磷蝦體內(nèi)含有活性很高的蛋白酶系，肌肉蛋白易發(fā)生自溶降解，生成小分子物質(zhì)[11]。NPN 是指大分子蛋白質(zhì)以外的含氮化合物的總稱，既包括蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的小分子肽類和游離氨基酸，也包含了酰胺類、氨以及銨鹽等含氮化合物[12]，因此適宜作為評(píng)判南極磷蝦自溶進(jìn)程的指標(biāo)。TCA 可以沉淀大分子蛋白質(zhì)，分子量小于10 000 的多肽組分則可以溶解在TCA 溶液中，因此TCA 可溶性蛋白含量的變化可以很好的表征南極磷蝦自溶初期蛋白質(zhì)發(fā)生的水解作用。南極磷蝦自溶酶系包含了類胃蛋白酶、羧肽酶A 和類胰蛋白酶，其最適pH 值分別為3.0、6.0 和8.0，最適溫度在40～60℃之間[3]。在0～20℃區(qū)間范圍內(nèi)，蛋白酶系隨溫度的升高而呈現(xiàn)活力增大的趨勢(shì)。因此，20℃條件下，南極磷蝦肌肉蛋白被迅速降解，生成大量的肽類，導(dǎo)致TCA 可溶性蛋白的大量增加。而4℃條件下，南極磷蝦蛋白酶系活力受到抑制，多肽的生成量較少。南極磷蝦的腐敗過程可分為兩個(gè)階段，第一階段主要為南極磷蝦的自溶水解，自溶酶系分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生小分子肽類、游離氨基酸等組分；第二階段則主要是內(nèi)源酶和微生物共同作用，產(chǎn)生揮發(fā)性的含氮化合物，造成TVB-N、TMA 等含量的大幅增加。TVB-N 是指動(dòng)物性食品由于酶和細(xì)菌的作用，在腐敗過程中蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生的氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)[13]。TVB-N 一般隨著鮮度的下降而增加，因此被廣泛作為反映魚、貝、蝦類等水產(chǎn)品腐敗程度的重要指標(biāo)。

4 結(jié) 論

（1）南極磷蝦自溶過程中，NPN 含量隨著時(shí)間的延長而增加，8 h 后4℃和20℃試驗(yàn)組NPN 含量分別為8.40 和12.67 mg/g，分別占到總氮的33.12%和49.96%，表明南極磷蝦具有活力很高的自溶酶系，而低溫可以在一定程度上抑制自溶酶系的活力。

（2）TCA 可溶性蛋白的變化規(guī)律與NPN 基本一致，而氨基酸態(tài)氮含量顯著偏低（P<0.01），表明南極磷蝦自溶初期主要是大分子蛋白被降解為肽類，而自溶酶系分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的游離氨基酸非常有限。

（3）南極磷蝦TVB-N 值同樣隨著時(shí)間延長而增加，8 h 后4℃和20℃試驗(yàn)組TVB-N 含量分別為0.16和0.21 mg/g。在實(shí)際生產(chǎn)中，南極磷蝦原料應(yīng)盡量避免高溫條件下長時(shí)間貯存。

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