拮抗細菌發(fā)酵提取物與井岡霉素混配對水稻紋枯病的毒力研究

彭雙強，張 亞,3，廖曉蘭,3，楚文琢，馮游滔

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.湖南省生物農(nóng)藥與農(nóng)藥制劑加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128）

水稻紋枯病（Rhizoctonia solani），是影響我國水稻生長的常見病害，一般情況下水稻紋枯病會致使水稻減產(chǎn)10%～20%，嚴重時往往導(dǎo)致水稻倒伏枯死，減產(chǎn)量高達到50%～60%[1]，對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失。然而，目前防治水稻紋枯病的有效藥劑比較單一，主要是井岡霉素，該藥劑自發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用至今已有40 a 以上歷史[2]。由于長期使用，水稻紋枯病菌對井岡霉素產(chǎn)生了一定程度的抗藥性[3]，單一的井岡霉素對水稻紋枯病的防效已明顯減弱，使得每年使用的次數(shù)逐漸增多，使用量也顯著增加[4-5]。因此，為了提高水稻紋枯病的防效，研發(fā)高效的新型藥劑已迫在眉睫。

生物防治是一種高效、安全控制水稻紋枯病的方法。近10 a 來，國內(nèi)外專家對水稻紋枯病拮抗菌進行了大量研究，取得了較大成果[6-9]，先后發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）、放線菌（Actinomycetes）等常見的紋枯病拮抗菌[10-14]。然而，研究也表明單一的生物防治效果并不理想，常常表現(xiàn)出較大的變異。研究證實，將井岡霉素與拮抗細菌混配使用，能有效延緩病原菌的抗藥性，提高對水稻紋枯病的防治效果。例如：陳菲等[15]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌與井岡霉素混用防治水稻紋枯病具有增效效果；農(nóng)倩等[16]報道稱內(nèi)生菌B196 菌株與井岡霉素混配能提高防治效果；陳志誼等[17]發(fā)現(xiàn)生防菌Bs-916 和井岡霉素混配可以協(xié)同防治水稻紋枯病。目前，關(guān)于利用拮抗細菌發(fā)酵液提取物與井岡霉素混配防治水稻紋枯病的報道在國內(nèi)外較為少見。實驗室從稻田養(yǎng)鴨生態(tài)系統(tǒng)的水稻根際土壤中分離了一株細菌SU8，經(jīng)鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomona aeruginosa），GenBank數(shù)據(jù)庫收錄號為HQ283487，研究發(fā)現(xiàn)該菌株對水稻紋枯病菌有較好的防治效果[18]?；诖?，研究以SU8發(fā)酵提取物與井岡霉素為材料開展水稻紋枯病防治試驗，以期拓寬對該病的防治途徑，削弱病原菌對藥劑的抗性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試藥劑為60%井岡霉素可溶性粉劑（武漢科諾生物有限公司）；供試菌種為SU8 拮抗細菌，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物安全檢測中心實驗室篩選分離；水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani），由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供。供試水稻為易感紋枯病品種皖稻68（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所）。

主要儀器有立式壓力蒸汽滅菌消毒器（上海申安醫(yī)療器械廠）；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；HQZ-C 雙層空氣恒溫震蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；HG303-3 型電熱干燥培養(yǎng)箱（南京實驗儀器廠）；AUX220 分析天平（島津公司）；HPG-280B 光照培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；LYH-XX 干燥箱（濟南魯岳涂裝烘干設(shè)備制造有限公司）；QHX-400BSH-Ⅲ人工氣候箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；移液槍（德國 Eppendoff）；衛(wèi)士牌WB-16 型背負式手動噴霧器（山東衛(wèi)士植保機械有限公司）；研缽、打孔器、各種試劑瓶等實驗室常用器材。

供試培養(yǎng)基有：（1）NA 培養(yǎng)基，牛肉浸膏10 g/L、蛋白胨 10 g/L、氯化鈉5 g/L、瓊脂17 g/L、pH 值7.0；（2）NB 培養(yǎng)液，除不加瓊脂外，其余同NA 培養(yǎng)基；（3）PDA 培養(yǎng)基，馬鈴薯200 g/L、葡萄糖15 g/L、瓊脂 17 g/L、自然pH 值。上述培養(yǎng)基參考方中達[19]的方法制備。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗細菌SU8 發(fā)酵提取物的制備種子液：將拮抗細菌SU8 在NA 培養(yǎng)基上活化后，用無菌水做成菌體懸浮液，取10 m L 接種到裝有100 m L NB 培養(yǎng)液的250 mL 錐形瓶中，在28℃的恒溫條件下以220 r/min的速率震蕩培養(yǎng)48 h，得到種子液。發(fā)酵液母液：種子液以10%的接種量接入裝有300 m L NB 培養(yǎng)液的1 000 m L 錐形瓶中，磁力攪拌子轉(zhuǎn)速為1 000 r/min，置28℃的振蕩培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)84 h，獲得發(fā)酵液。將發(fā)酵液和乙酸乙酯以1︰2 的比例充分混勻萃取48 h，取萃取液于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，以110 r/min 的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，獲得抑菌物質(zhì)，該抑菌物質(zhì)即為SU8 發(fā)酵液乙酸乙酯提取物（以下簡稱SU8 發(fā)酵提取物），用相應(yīng)的溶劑溶解，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 室內(nèi)毒力測定 （1）最小抑菌濃度（M IC）測定。試驗參照黃彰新[20]的菌絲生長速率法進行M IC測定。具體操作如下：在無菌條件下，將SU8 發(fā)酵液提取物和井岡霉素分別配制6種濃度，濃度分別為1 000、750、500、250、125、62.5 mg/L，4℃下保存?zhèn)溆茫环謩e取配制的不同濃度的兩種物質(zhì)1.0 m L，加入9.0 m L 熱培養(yǎng)基（以加1 m L 的水為對照），搖勻制成平板；接種生長一致的供試菌菌餅（直徑5.0 mm），使菌餅帶菌絲的一面貼在培養(yǎng)基表面，置于25℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)；待對照處理的菌絲長滿培養(yǎng)皿時，采取十字交叉法[21]測定菌落直徑，每個處理3 次重復(fù)；以不長菌處理中藥劑的最低濃度為最小抑菌濃度（M IC）。（2）菌絲生長抑制率的測定。在最小抑菌濃度（M IC）試驗的基礎(chǔ)上，分別取SU8 發(fā)酵提取物與井岡霉素溶液按兩者質(zhì)量比為9︰1、4︰1、1︰1、1︰4 和1︰9 進行混合，每個配比設(shè)置5種不同的濃度梯度，配置好的溶液于4℃下保存?zhèn)溆?；參照菌絲生長速率法計算藥劑的菌絲生長相對抑制率，采用十字交叉法測定各處理的菌落直徑，減去5 mm 的菌餅直徑即為菌落生長直徑，每個處理3 次重復(fù)。通過公式（1）計算藥劑對菌絲生長的抑制率。（3）混配劑聯(lián)合毒力的評價。參照Wadley[22]的增效比率法，以藥液濃度對數(shù)值為自變量，以相對抑制的百分率的幾率值為因變量，計算出毒力回歸方程Y 和相關(guān)系數(shù)r，根據(jù)回歸方程求出EC50值，并計算出理論的EC（th）50值，求出不同比例的混配的增效系數(shù)SR。

式中，A 為SU8 發(fā)酵提取物，B 為60%井岡霉素可溶性粉劑，a、b 分別為SU8 發(fā)酵提取物和60%井岡霉素可溶性粉劑在混配組合物總重量中的比例。

根據(jù)增效系數(shù)（SR）進行聯(lián)合作用綜合評價。當0.5＜SR ＜1.5 時，說明兩種物質(zhì)混配具有協(xié)同作用；當SR ≤0.5 時，說明兩種物質(zhì)混配表現(xiàn)出拮抗作用；當SR ≥1.5 時，說明兩種物質(zhì)混配有增效作用。

1.2.3 盆栽防病試驗 2014年5月中旬～6月下旬，在口徑為40 cm、高為25 cm 的花盆中裝入無菌水稻土至盆高的2/3，取40 g 病原菌培養(yǎng)物均勻混于土壤中，每盆移栽生長狀況較一致的易感病水稻品種皖稻68 幼苗20 株，置于溫度26℃、濕度80%～90%的人工氣候箱中培養(yǎng)，兩盆之間的間距為10 cm，其他同常規(guī)管理。每天觀察稻苗生長情況，于拔節(jié)孕穗期分別噴施質(zhì)量比1︰9 和1︰4 的井岡霉素（500 mg/L）和SU8 發(fā)酵液（1 000 mg/L）混配劑，以相同濃度的井岡霉素和SU8 發(fā)酵液做對照試劑，以清水做空白對照，每個處理3 次重復(fù)。連續(xù)施藥兩次，兩次施藥之間間隔7 d，觀察記錄水稻植株的發(fā)病情況，并計算防效。按照相關(guān)文獻的標準進行病害分級[23]。病情分級標準為：0 級，全株無病斑；1 級，第四葉片及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病（以頂葉為第一張葉片）；3 級，第三葉片及其以下各葉鞘、葉片發(fā)?。? 級，第二葉片及其以下各葉鞘、葉片發(fā)??；7 級，劍葉及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病；9 級，全株發(fā)病，提早枯死。

病情指數(shù)=[∑（各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值）/（調(diào)查病葉數(shù)×最高級數(shù)值）]×100

防治效果（%）=（對照區(qū)病情指數(shù)－處理區(qū)病情指數(shù)）/對照區(qū)病情指數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑菌濃度與菌絲生長抑制率

試驗結(jié)果表明，60%井岡霉素和SU8 發(fā)酵提取物對水稻紋枯病菌的最小抑菌濃度分別為6.25 和25 mg/L；在最小抑菌濃度的基礎(chǔ)上，設(shè)定的不同質(zhì)量比混配的溶液對水稻紋枯病菌絲生長抑制率為14.3%～70.1%范圍內(nèi)。

2.2 單劑和混配劑對水稻紋枯病菌的室內(nèi)毒力

利用菌絲生長速率法進行SU8 發(fā)酵提取物與井岡霉素混配的室內(nèi)聯(lián)合毒力測定，結(jié)果見表1。從表1 中可以看出，SU8 發(fā)酵液提取物單劑對水稻紋枯病菌的EC50為4 120.17 mg/L，井岡霉素可溶性粉劑單劑的EC50為404.81 mg/L。

SU8 發(fā)酵提取物和井岡霉素可溶性粉劑以質(zhì)量比9︰1、4︰1、1︰1、1︰4 和1︰9 的混配，其增效系數(shù)分別為7.53、3.68、3.31、1.01 和1.81。其中，質(zhì)量比為1︰4 混配的SR 大于0.5，而小于1.5，表現(xiàn)為協(xié)同作用；質(zhì)量比為9︰1、4︰1、1︰1 和1︰9 混配的SR 均大于1.5，表現(xiàn)為增效效果，其中又以質(zhì)量比為9︰1 的混配增效最明顯。

表1 SU8 發(fā)酵提取物和井岡霉素單劑及其不同比例混合組配對水稻紋枯病菌的室內(nèi)毒力

2.3 單劑和混配劑對水稻紋枯病的盆栽防效

由表2 可知，兩次施藥，單一的60%井岡霉素可溶性粉劑防病效果分別為70.2%和73.8%，單一的SU8 發(fā)酵提取物的防病效果分別為40.7%和39.6%，均低于同濃度兩者質(zhì)量比9︰1、4︰1 的混配劑的防病效果，且表現(xiàn)出極顯著差異。

3 結(jié)論與討論

目前，利用拮抗菌株的代謝產(chǎn)物防治水稻紋枯病的研究已有報道。如：王國平等[24]指出內(nèi)生真菌紫杉木霉ZJUF0986 的發(fā)酵液提取物可以防治水稻紋枯病；陳志誼等[25]證實了拮抗細菌的分泌物拮抗素JK-b 對水稻紋枯病菌具有抑制作用；段桂芳等[26]發(fā)現(xiàn)了禾長蠕孢菌的代謝產(chǎn)物 Ophiobolin A 能防治水稻紋枯?。粚O冬梅等[27]報道了黃綠木霉發(fā)酵液可以抑制水稻紋枯病菌。而有關(guān)利用拮抗菌株的代謝產(chǎn)物與井岡霉素混配防治水稻紋枯病的報道還較少見。

表2 SU8 發(fā)酵液提取物和井岡霉素不同比例混合組配對水稻紋枯病的盆載防效

該研究通過室內(nèi)毒力測定試驗，發(fā)現(xiàn)SU8 發(fā)酵液提取物和60%井岡霉素可溶性粉劑以質(zhì)量比9︰1、4︰1、1︰1 和1︰9 的混合組配對水稻紋枯病菌的防治具有顯著的增效作用，以質(zhì)量比1︰4 的混合組配對水稻紋枯病菌的防治具有協(xié)同作用。盆栽試驗也證實SU8 發(fā)酵液提取物和60%井岡霉素質(zhì)量比為9︰1 和4︰1 的混合組配的防病效果高于單一的同濃度的井岡霉素。這表明與SU8 發(fā)酵提取物混配能顯著增強井岡霉素對水稻紋枯病的防治效果，為提高井岡霉素對水稻紋枯病的防治效果提供了一定的理論依據(jù)，并為拓展拮抗細菌SU8 生物農(nóng)藥的應(yīng)用提供了一條有效途徑。此外，其增效機理、作用方式和田間防效還有待進一步研究。

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